$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Liyuan, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology [Nr zatwierdzenia: 2026IEC(RYJ016)]. Wszyscy pacjenci wyrazili świadomą zgodę, a pobieranie i wykorzystanie próbek klinicznych było zgodne z odpowiednimi wytycznymi etycznymi Deklaracji Helsińskiej. Główne materiały eksperymentalne i instrumenty użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
Pobieranie próbek tkanek klinicznych i wykrywanie ekspresji CDCP1
Próbki tkanek chirurgicznych pobrano od siedmiu pacjentów z rozpoznaniem raka nosowogardła w naszym szpitalu między styczniem 2019 a grudniem 2019 roku. Równocześnie pobrano próbki tkanki nosa od sześciu pacjentów z nieżytem nosa jako kontrolę. Wszystkie próbki tkanek zostały natychmiast zamrożone w ciekłym azocie po pobraniu do kolejnej ekstrakcji RNA.
Ekstrakcja RNA i ilościowa detekcja PCR w czasie rzeczywistym
Całkowite RNA zostało wyodrębnione z próbek tkanek zgodnie z instrukcjami producenta. Na każdą próbkę przetwarzano 50–100 mg tkanki na lodzie w 1 mL odczynnika ekstrakcyjnego przy użyciu homogenizatora tkanek. Homogenizacja była przeprowadzana przez 30 sekund i powtarzana 3 razy, aby zapewnić całkowite uszkodzenie tkanki. Po rozbiciu tkanek każdy lizat otrzymał 200 μL chloroformu. Rurki były intensywnie potrząsane przez wirowanie przez 15 sekund, utrzymywane w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie obracane w temperaturze 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby oddzielić fazy. Przezroczysta warstwa wodna została usunięta bez zakłócenia interfazy i przeniesiona do nowej rurki.
RNA zostało odzyskane z tej frakcji wodnej poprzez dodanie izopropanolu w stosunku objętościowym 1:1. Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej próbki były wirowane w 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby rozpylić RNA. Supernatant został wyrzucony, a granulek przepłukano raz 1 mL 75% etanolu. Po drugim kroku wirowania w 7 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunięto płukanie etanolem. Pellet RNA był następnie suszony na powietrzu przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawieszany w 20 μL wody wolnej od RNazy. Ilość i czystość RNA zostały określone spektrofotometrycznie.
Do przygotowania cDNA użyto 1 μg całkowitego RNA do transkrypcji odwrotnej. Reakcja przeprowadzono w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie podgrzewano do 85 °C przez 5 sekund. Następnie przeprowadzono ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) z użyciem TB Green Premix Ex Taq II na systemie PCR w czasie rzeczywistym. Każda reakcja o objętości 20 μL zawierała 2 μL matrycy cDNA, sprężarki do przodu i do tyłu po 0,4 μmol/L każda, 10 μL premixu SYBR Green oraz wodę wolną od nukleazy. Protokół amplifikacji rozpoczął się od denaturacji w 95 °C przez 30 sekund. Następnie nastąpiło 40 cykli, z których każdy składał się z 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 30 s dla wyżarzania/przedłużania. Sekwencje pierwsze są wymienione w Tabeli 1.
Immunohistochemiczne wykrywanie ekspresji białka CDCP1
Próbki tkanek najpierw utrwalano w 4% paraformaldehydu przez 24 godziny, następnie nastąpiło standardowe odwodnienie, osadzanie parafiny oraz przygotowanie sekcji o grubości 4 μm. Sekcje parafiny były następnie traktowane ksylenem w celu usunięcia parafiny i stopniowo nawodniane za pomocą roztworów etanolu oklasyfikowanego. Do odmaskowania antygenów preparaty umieszczano w buforze cytrynianowym (pH 6,0) i podgrzewano w szybkowarze przez 3 minuty po osiągnięciu wrzenia roztworu. Endogenna aktywność nadtlenku została wygaszona przez wystawienie sekcji na działanie nadtlenku wodoru 3% przez 10 minut.
Po zablokowaniu aktywności endogennych enzymów, sekcje były inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C, z przeciwciałem przeciwnym przeciw CDCP1 rozcieńczonym w 1:200. Następnego dnia preparaty zostały poddane zastosowaniu przeciwciał wtórnych z nadtlenkiem chrzanu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wizualizację sygnału przeprowadzono za pomocą zestawu podłoża DAB, a przekroje zostały następnie odbarwione hematoksyliną. Na koniec preparaty zostały odwodnione, zamontowane i zbadane pod mikroskopem optycznym.
Hodowla komórkowa i grupowanie
Komórki raka nosowogardła CNE2 i HK1 u człowieka były utrzymywane w wysokoglukozowym DMEM, uzupełnionym o 10% surowicy bydła płodu i 1% penicylin-streptomycyny. Komórki hodowano w temperaturze 37 °C w inkubatorze zawierającym 5% CO₂. Gdy komórki osiągnęły konfluencję 70%–80%, transfekowano je według następujących grup: Grupa kontrolna (kontrolna): transfekowana pustym wektorem lub siRNA kontrolnym ujemnym; Grupa nadekspresji CDCP1 (CDCP1-OE): transfekowana plazmidem nadekspresji CDCP1; Grupa wyciszająca CDCP1 (si-CDCP1): transfekowana siRNA CDCP1; Grupa eksperymentalna ratunkowa (CDCP1-OE + U0126): leczona inhibitorem specyficznym dla ERK1/2 U0126 (10 μmol/L) przez 48 godzin na podstawie nadekspresji CDCP1.
Transfekcja została przeprowadzona zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki były powłaszczane 24 godziny przed transfekcją w płytkach 6-dołków w ilości 2 × 105 komórek /dołek, przy czym każdy dołek zawierał 2 mL bezantybiotykowego medium. Transfekcja została rozpoczęta, gdy kultury osiągnęły około 70% zbiegu się. Następnie pożywka hodowla została usunięta i zastąpiona świeżą, bezsurowicową pożywką. Dla każdej dołki przygotowywano osobno 2 μg plazmidowego DNA lub 100 pmol siRNA od 5 μL odczynnika transfekcyjnego, przy czym każdy składnik był rozcieńczony w 250 μL zredukowanego medium zawierającego surowicę. Obie mieszanki przechowywano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie rozcieńczony kwas nukleinowy i odczynnik transfekcyjny zostały połączone i pozostawione do stoienia przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać kompleksy transfekcyjne. Kompleksy te były dodawane do komórek kropelowo, delikatnie rozprowadzane po studni i inkubowane z komórkami przez 6 godzin. Po zakończeniu okresu inkubacji mieszanina transfekcyjna była usuwana, a komórki dostarczano kompletnym nośnikiem zawierającym 10% FBS.
Badanie proliferacji komórek
Po 48 godzinach po transfekcji komórki CNE2 i HK1 z każdej grupy zostały zebrane i zasiane na płytach 96-dołków o gęstości 3 × 103 komórek /dołek z 100 μL medium na odwiert, z pięcioma dołkami replikującymi na grupę. Po hodowli komórek przez 24, 48 lub 72 godziny, do każdego dołku dodawano 10 μL roztworu MTT o stężeniu 5 mg/mL. Płyty były następnie ponownie inkubowane w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez kolejne 4 godziny. Po tej inkubacji supernatant hodowli był starannie odrzucany, a do każdego dołku dodawano 100 μL dimetylosulfenu (DMSO), aby rozpuścić kryształy formezonu. Płyty były mieszane przez 10 minut, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie. Absorpcja była następnie rejestrowana za pomocą czytnika mikropłyt przy 570 nm, używając 630 nm jako długości fali referencyjnej.
Badanie aktywności apoptozy
Po 48 godzinach po transfekcji pobrano komórki CNE2 z każdej grupy, a aktywność kaspazy-3 wykryto za pomocą zestawu do analizy aktywności kaspazy-3 zgodnie z instrukcjami producenta. Do 1 ×10 6 komórek dodano łącznie 100 μL buforu lizy, które przez 15 minut były lizowane na lodzie, a następnie wirowane w 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powstały supernatant był przekazywany do dalszej analizy. W testie Caspase-3 każda studnia otrzymała 50 μL buforu reakcyjnego i 5 μL substratu Caspase-3 (DEVD-pNA). Następnie płyta była utrzymywana w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, a absorpcja zmierzona na poziomie 405 nm za pomocą czytnika mikropłyty.
Analiza zachodniej plamy
Po 48 godzinach po transfekcji pobrano komórki CNE2 i HK1 z każdej grupy eksperymentalnej do ekstrakcji białkowej. Komórki zostały rozbite w buforze RIPA zawierającym inhibitory proteazy i przechowywane w lodzie przez 30 minut. Powstałe lizaty były wirowane w 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, po czym pobierano frakcje supernatantów. Stężenie białka zmierzono za pomocą zestawu do analizy białek BCA.
Do analizy western blot, 30 μg białka z każdej próbki zostało wymieszane z buforem obciążeniowym 5x i podgrzane w 100 °C przez 10 minut, aby denaturować białka. Próbki były rozdzielane na żelach 10% SDS-PAGE pod napięciem 120 V przez 90 minut, po czym nastąpił transfer na membrany PVDF przy stałym prądzie 300 mA przez 90 minut. Po transferze błony były blokowane mlekiem beztłuszczowym 5% przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Błony były inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko CDCP1 (1:1 000), E-kadherynie (1:1 000), Vimentynie (1:1 000), p-ERK1/2 (1:2 000), ERK1/2 (1:1 000) oraz GAPDH (1:5 000).
Następnego dnia błony były płukane TBST 3 razy, przy czym każde płukanie trwało 10 minut. Następnie były wystawione na działanie przeciwciał wtórnych sprzężonych z nadoksydazą chrzanu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po trzech kolejnych płukaniach TBST sygnały białkowe zostały zwizualizowane za pomocą podłoża chemiluminescencyjnego ECL. Intensywność pasma mierzono za pomocą oprogramowania ImageJ, a GAPDH stosowano jako kontrolę normalizacji.
Analiza statystyczna
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono niezależnie 3 razy. Wyniki przedstawiane są jako średnia ± odchylenia standardowego (SD). Różnice między wieloma grupami oceniano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a metoda Tukeya została wykorzystana do porównań pojedynczych po parach. Wartość P < 0,05 została uznana za statystycznie istotną.