Analiza transkryptomiczna ujawnia podgrupy mitochondrialne w zmianach atopowego zapalenia skóry

Yingyao Yu; Yuanyuan Shang; Xinhong Ge; Lingdi Dong; Kexin Li

doi:10.3791/70240

Research Article

Analiza transkryptomiczna ujawnia podgrupy mitochondrialne w zmianach atopowego zapalenia skóry

DOI:

10.3791/70240

⸱

May 26th, 2026

Yingyao Yu¹ , Yuanyuan Shang¹ , Xinhong Ge¹ , Lingdi Dong¹ , Kexin Li¹

¹Department of Dermatology, General Hospital of Ningxia Medical University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopowe zapalenie skóry (AD) to przewlekła zapalna choroba skóry o znacznej heterogeniczności molekularnej. Badanie to identyfikuje dwie transkryptomicznie odrębne podgrupy AD, napędzane różnicą ekspresji genów mitochondrialnych i infiltracją immunologiczną, oraz ujawnia cztery geny hubowe jako potencjalne biomarkery dla stratyfikacji pacjenta.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopowe zapalenie skóry (AD) to powszechna i przewlekła zapalna choroba skóry o globalnej powszechności. Jej heterogeniczność kliniczna oraz złożone mechanizmy molekularne stanowią poważne wyzwania dla rozwoju skutecznych terapii. Badanie heterogeniczności molekularnej AD na podstawie danych transkryptomicznych skóry ze zmian, charakteryzacja ich profili biologicznych i immunologicznych oraz identyfikacja kluczowych genów leżących u podstaw różnicowania. Geny różnicowo ekspresyjne zostały zidentyfikowane za pomocą DESeq2, a następnie przeprowadzono analizy szlaków i współekspresji odpowiednio za pomocą GSEA i WGCNA. Geny związane z mitochondriami zostały wyodrębnione przez przecięcie modułów DEG i WGCNA z bazą danych MitoCarta3.0, a ich funkcjonalność oceniono poprzez wzbogacenie GO i KEGG. Geny hubów zostały zidentyfikowane za pomocą analizy sieci interakcji białko-białko, które następnie posłużyły do stworzenia modelu klasyfikacji. Regulatory transkrypcyjne przewidywano za pomocą hTFtarget, natomiast infiltrację komórek odpornościowych ilościowo określano za pomocą CIBERSORT. Zidentyfikowano dwie podgrupy molekularne. Klaster 1 był wzbogacony o szlaki sygnalizacji komórkowej i adhezji, podczas gdy Klaster 2 wykazywał wzrost fosforylacji oksydacyjnej i procesów związanych z proteasomem. Łącznie 85 genów związanych z mitochondriami, głównie zaangażowanych w metabolizm energii, zostało różnie ekspresowanych pomiędzy klastrami. Analiza sieci PPI wykazała cztery geny hubów (BAD, BOLA1, CHCHD5 i ISOC2), które zostały istotnie zwykłe w klastrze 1. Klasyfikator oparty na genach hubowych wykazał silną dyskryminacyjną moc (pole pod krzywą > 0,7). Przewidywane kluczowe regulatory transkrypcyjne to ATF3, BRD2, BRD4 i CEBPA. Profilowanie immunologiczne wykazało wyższą infiltrację komórek T regulujących w klastrze 1 oraz zwiększoną liczbę komórek pomocniczych pęcherzyków w klastrze 2. Badanie to ujawnia dwa molekularnie i immunologicznie odrębne podtypy AD, charakteryzujące się różnicową funkcją mitochondriów oraz sygnaturami immunologicznych w mikrośrodowisku.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopowe zapalenie skóry (AD) to powszechna i przewlekła zapalna choroba skóry, która dotyka do 20% dzieci i 10% dorosłych¹. Charakteryzuje się intensywnym swędzeniem i nawracającymi zmianami egzematycznymi². Klinicznie AD wynika z dynamicznej interakcji podatności poligenowej (np. mutacji utraty funkcji u FLG), zaburzeń odporności oraz narażenia środowiskowego, takich jak niska wilgotność i dysbioza mikroorganizmów³. Chociaż AD dzieli pewne cechy patofizjologiczne z łuszczycą, ich objawy kliniczne są wzajemnie wykluczające się, z różnymi efektami genetycznymi w wspólnych szlakach i wyraźnymi zmianami immunologicznych⁴.

AD jest chorobą heterogeniczną, charakteryzującą się różnorodnymi profilami transkryptomowymi w różnych grupach pacjentów oraz objawami choroby⁵. Zintegrowane analizy tkanek skóry i komórek jednojądrowych krwi obwodowej wykazały, że cechy kliniczne, takie jak rumień i rozruch mięśnia, są powiązane z odrębnymi sygnaturami immunologicznymi, odzwierciedlając współdziałanie lokalnej skóry z ogólnoustrojową odpowiedzią immunologiczną⁶. Szeroko zakrojone badania transkryptomiczne dodatkowo podkreślają rolę szlaków IL-13 w patogenezie AD, podczas gdy AD wykazuje większą heterogeniczność molekularną niż łuszczyca, z różnicami w wzorcach ekspresji genów powiązanymi z nasileniem choroby, wiekiem wystąpienia choroby i tłem genetycznym ^5,7. Te różnice podkreślają złożoność patogenezy AD oraz potrzebę indywidualnych podejść do badań i terapii.

Białka mitochondrialne odgrywają ważną rolę w patogenezie AD poprzez zaburzenia stresu oksydacyjnego i szlaków metabolicznych. Badania wykazały zwiększoną aktywność kompleksów mitochondrialnych I i II w nieuległych keratinocytach AD, co powoduje nadmierną utlenianie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych oraz zwiększaną produkcję ROS, co zwiększa dysfunkcję bariery naskórnej ^8,9. Równocześnie analizy proteomiczne wykrywają zmniejszone białka szlaku NRF2-antyoksydacyjnego oraz składniki mitochondrialne w naskórku AD, co zmniejsza rozwiązywanie stresu oksydacyjnego¹⁰. Uszkodzenia DNA mitochondrialnego dodatkowo przyczyniają się do reakcji zapalnych, podczas gdy interwencje takie jak stosowanie antyoksydantów ukierunkowanych na mitochondria wykazują skuteczność w przywracaniu homeostazy naskórka poprzez łagodzenie ROS^11,12. Te odkrycia podkreślają białka mitochondrialne jako czynniki napędzające patologię AD oraz potencjalne cele terapeutyczne.

Najnowsze analizy transkryptomu AD znacząco pogłębiły zrozumienie jego architektury genetycznej i heterogeniczności molekularnej. Pierwsze sekwencjonowanie RNA AD wykazało zwiększoną ekspresję w szlaku TREM-1 oraz cytokiny^{IL-36 13}. Analiza ważonej sieci współekspresji genów oparta na profilu ekspresji genów ujawniła także odrębne moduły molekularne i geny hubowe, takie jak HSPA4, LCE3E i LCE3D, które koordynują odpowiedzi zapalne i keratynizację, podkreślając potencjalne cele terapeutyczne¹⁴. Badania te podkreślają wartość wielotkankowej transkryptomiki oraz poligenicznego modelowania ryzyka w doskonaleniu przewidywania chorób i odkrywaniu złożonych podstaw choroby AD. Jednak istniejące badania koncentrowały się głównie na ogólnej transkryptomice AD, nie rozstrzygając konkretnie roli genów mitochondrialnych w definiowaniu podgrup molekularnych. Niniejsze badanie wykracza poza wcześniejsze analizy transkryptomiczne, integrując wiele zbiorów danych GEO w celu identyfikacji podgrup AD opartych na konsensusie oraz systematycznie przecięcie genów różnicowo ekspresyjnych, modułów WGCNA oraz starannie wyselekcjonowanego katalogu genów mitochondrialnych, aby wskazać geny mitochondrialne w centrum, które definiują tożsamość podgrup i mogą służyć jako nowe biomarkery.

Z hipotezą, że skóra z lezyjną chorobą AD posiada molekularnie odrębne podgrupy transkryptomiczne charakteryzujące się różnicową ekspresją mitochondrialnych genów, co może stanowić podstawę klinicznej heterogeniczności AD. Aby to przetestować, badanie to zintegrowało dane sekwencjonowania RNA z opublikowanych badań oraz zebrało dane o ekspresji genów próbek skóry zmian od 266 pacjentów z chorobą AD. Podgrupy molekularne zostały zidentyfikowane na podstawie konsensusowego skupienia ekspresji genów, a ekspresja genów porównana między tymi dwoma podgrupami molekularnymi. Geny generujące tę różnicę wykazują funkcjonalne wzbogacenie sygnalizacji komórkowej i fosforylacji oksydacyjnej. Ponadto zbadano geny mitochondrialne różniące dwie grupy molekularne, a kluczowe geny hubowe zidentyfikowano w sieci interakcji białko-białko. Te odkrycia podkreślają genetyczną heterogeniczność choroby Alzheimera i poszerzają wiedzę na temat roli białek mitochondrialnych w patologii AD.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to wykorzystało publicznie dostępne zbiory danych o ekspresji genów z bazy Gene Expression Omnibus (GEO). Nie uzyskano dostępu do danych identyfikowalnych przez pacjenta ani pobrano nowe próbki pacjentów. Dlatego nie było wymagane zatwierdzenie przez instytucjonalną komisję przeglądową (IRB) ani zgoda pacjenta na tę wtórną analizę publicznie dostępnych danych. Oprogramowanie i używane bazy danych są wymienione w Tabeli Materiałów.

1 Dane i zasoby

Dane transkryptomowe pacjentów z atopowym zapaleniem skóry (AD) zostały pozyskane z bazy GEO, w tym z czterech badań: GSE121212 (N = 55)⁵, GSE157194 (N = 57)¹⁵, GSE193309 (N = 111)¹⁶ oraz GSE277961 (N = 43)¹⁷. Wszystkie zbiory danych zawierały surowe lub wstępnie znormalizowane dane liczebne z biopsji skóry po zmianie. Surowe macierze liczenia zostały pobrane i zintegrowane w różnych badaniach. Efekty wsadowe badań międzybadań zostały skorygowane metodą ComBat-seq (pakiet sva R, v3.44.0), aby ujednolicić profile ekspresji między czterema zbiorami danych GEO przed dalszą analizą. Wszystkie cztery zbiory danych opierają się na RNA-seq wykonanym na próbkach biopsji skóry ludzkiej i zostały dopasowane do referencyjnego genomu ludzkiego GRCh38 przy użyciu specyficznych dla badań pipeline'ów. Ilościowa ekspresja na poziomie genu została przeprowadzona za pomocą anotacji genu Ensembl (v105).

2 Skupianie konsensusu

Nienadzorowane klasteryzowanie konsensualne przeprowadzono przy użyciu pakietu ConsensusClusterPlus R (v1.64.0)¹⁸ , aby stratyfikować 266 próbek skóry z uszkodzeniem od pacjentów z AD na podstawie profili transkryptomicznych. Przed klastrowaniem surowe dane liczebne ze wszystkich badań były łączone, a efekty partii badań krzyżowych korygowane za pomocą funkcji removeBatchEffect z pakietu limma. Dane ekspresji genów zostały następnie przekształcone stabilizujące wariancję (VST) za pomocą DESeq2 i przefiltrowane, aby zachować 5 000 najbardziej zmiennych genów. Klasteryzacja przeprowadzono przy użyciu hierarchicznego klasteryzmu z korelacją Pearsona i średnim powiązaniem na 1000 iteracji, podpróbkując 80% próbek na iterację. Najlepsza liczba klastrów (k waha się od 2 do 10) została wyłoniona na podstawie oceny konsensualnej skumulowanej funkcji rozkładu (CDF), wykresów powierzchni delta oraz wyników konsensusu klastrów. Powstałe klastry zostały zweryfikowane za pomocą konsensusowych map cieplnych i PCA oraz wykorzystane w dalszych analizach biologicznych i klinicznych.

3 Różnicowa analiza ekspresji genów

Poziomy ekspresji genów porównano między podgrupami molekularnymi za pomocą pakietu DESeq2 R (v1.46.0)¹⁹. Dane z surowej liczby zostały wprowadzone w celu oszacowania dyspersji genowej i dopasowania do ujemnego modelu dwumianowego. Geny różnicowo ekspresyjne (DEG) zidentyfikowano za pomocą testu Walda, a wyniki filtrowano według progu istotności w postaci skorygowanej wartości p < 0,01 oraz bezwzględnej zmienności log2 > 1.

4 Analiza wzbogacania zbiorów genów

Analiza wzbogacania zbiorów genów (GSEA) została przeprowadzona przy użyciu pakietu clusterProfiler R (v4.12.6)²⁰. Wszystkie geny zostały uszeregowane według ich log2 zmian stopni na podstawie analizy różnicowej ekspresji, a funkcja GSEA została zastosowana z parametrami eps = 0, minGSSize = 10 i maxGSSize = 500, podczas gdy inne ustawienia pozostały domyślne. Wzbogacenie zostało przeprowadzone na zestawach genów MSigDB Hallmark. Dla każdego klastra molekularnego (Klaster 1 i Klaster 2) wybrano trzy najwyżej wzbogacone szlaki na podstawie nominalnej wartości p oraz normalizowanego wyniku wzbogacenia (NES). Wyniki były wizualizowane za pomocą pakietu GseaVis R (v0.1.0)²¹.

5 Analiza ważonej sieci współekspresji genów

WGCNA została przeprowadzona na profilu ekspresji genów pacjentów z AD w celu identyfikacji modułów współekspresji genów związanych z transkryptomiczną tożsamością podtypu przy użyciu pakietu R WGCNA (v1.73)²². Geny zostały przefiltrowane, aby zachować górne 75% z największą wariancją we wszystkich próbkach. Skonstruowano sieć współwyrażeń ze znakiem, wykorzystując moc miękkiego progu wybranego od 1 do 30, aby przybliżyć topologię bezskalową. Moduły genowe identyfikowano poprzez hierarchiczne klastrowanie i dynamiczne cięcie drzew. Powiązania modułów z cechami badane były poprzez korelację współekspresowanych genów własnych modułów z oznakami podtypów molekularnych, a moduły wykazujące istotną korelację (p < 0,05) z podtypem molekularnym zostały wybrane do dalszej analizy.

6 Białka mitochondrialne w podgrupach molekularnych AD

Aby zidentyfikować geny związane z mitochondriami w modułach DEGs i WGCNA, zestawy tych zestawów genów zostały nałożone na listę białek mitochondrialnych z MitoCarta3.0²³. Przecinające się geny uznano za potencjalne białka mitochondrialne istotne dla kontekstu choroby AD.

7 Ontologia genów i analiza wzbogacania KEGG

Identyfikacja głównych funkcji komórek i procesów biologicznych, które różnicują podgrupy molekularne. Analizy wzbogacenia GO i KEGG przeprowadzono dla genów związanych z mitochondriami przy użyciu clusterProfilera. Wzbogacenie GO przeprowadzono osobno dla kategorii Procesów Biologicznych (BP), Składników Komórkowych (CC) i Funkcji Molekularnych (MF), używając funkcji enrichGO z OrgDb = "org. Hs.eg.db", ont = "WSZYSTKIE" oraz parametry domyślne. Wzbogacenie szlaku KEGG przeprowadzono za pomocą funkcji wzbogacania KEGG z organizmem ustawionym na "has". Wzbogacone składniki o skorygowanej wartości p < 0,05 uznano za istotne.

8 Sieci interakcji białko-białko

85 DEG oraz geny mitochondrialne powiązane z modułami AD zostały przeszukane w bazie danych STRING (https://string-db.org)²⁴ w celu uzyskania znanych i przewidywanych PPI. Analiza topologii sieci została przeprowadzona przy użyciu siedmiu miar (stopień, bliskość, pomiędzy nimi, wektor własny, PageRank, hub oraz autorytet), aby uszeregować znaczenie każdego białka dla węzła. Wybrano 30 najwyżej ocenionych genów każdego stopnia, a przecięcia wszystkich siedmiu podejść zobrazowano za pomocą wykresu UpSet. Cztery przecinające się geny z tych miar zostały wykorzystane do stworzenia modelu klasyfikacyjnego opartego na poziomie ekspresji genów. Dokładność modelu, czułość, swoistość oraz pole pod krzywą ROC (AUC) zostały obliczone w celu oceny wydajności klasyfikacji.

9 Analiza regulacji transkrypcji

Baza danych hTFtarget (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)²⁵ została przeszukana w celu uzyskania eksperymentalnie wspieranych interakcji TF-target dla czterech przecinających się genów hubów. Powstała w ten sposób sieć regulacyjna genu TF została zbudowana i zwizualizowana za pomocą pakietów igraph²⁶ i ggraph²⁷ R.

10 Analiza infiltracji komórek odpornościowych RNA-seq

Algorytm CIBERSORT²⁸ (https://cibersort.stanford.edu/) został użyty do oszacowania względnych proporcji 22 typów komórek odpornościowych w danych transkryptomowych skóry uszkodzonych zmian. Dane o znormalizowanej ekspresji genów zostały wprowadzone do CIBERSORT (v0.1.0) wraz z macierzą sygnatur LM22. Analiza została przeprowadzona z 1 000 permutacji i wyłączoną normalizacją kwantylną. Próbki o wartościach p wyjściowych CIBERSORT < 0,05 były rozpatrywane do analizy dalszej. Szacowane frakcje komórek odpornościowych porównano między podgrupami molekularnymi za pomocą testu sumy rangi Wilcoxona z korektą FDR dla wielu porównań między 22 typami komórek odpornościowych (p.adjust.method = "FDR"), a wyniki zobrazowano za pomocą wykresów pudełkowych przy użyciu pakietu ggplot2²⁹ R.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podgrupy transkrypcyjne w atopowym zapaleniu skóry

Dane RNA-seq z 266 próbek pacjentów z chorobą AD zostały przeanalizowane w celu zbadania heterogeniczności transkrypcyjnej w obrębie choroby. Po kontroli jakości i korekcie efektów partii w wielu badaniach, nienadzorowane klasteryzowanie konsensusu ujawniło dwie odrębne podgrupy molekularne (Rysunek 1A). Stabilność klastrów i optymalna liczba klastrów oceniono za pomocą wykresu funkcji rozkładu kumulacyjnego (CDF) (Rysunek 1B), wykresu powierzchni delta (Rysunek 1C) oraz mapy cieplnej macierzy konsensusu (Rysunek 1D). Razem te wyniki potwierdzają istnienie dwóch solidnych podtypów transkrypcji w AD, odzwierciedlających podstawową heterogeniczność genetyczną.

Geny różnicowo ekspresyjne pomiędzy podgrupami AD

Wykres t-SNE oparty na znormalizowanej macierzy ekspresji genów dodatkowo potwierdził podgrupy transkrypcyjne zidentyfikowane przez klasteryzację konsensusową. Wykres t-SNE ujawnił dwa dobrze rozdzielone klastry, z których każdy odpowiadał jednej z wcześniej zdefiniowanych podgrup (rysunek 2A), co potwierdza obecność odrębnych profili molekularnych u pacjentów z AD. Następnie analizowano różniczkową ekspresję między tymi dwoma podgrupami za pomocą DESeq2, z progiem skorygowanym p < 0,01 oraz |log₂ zmiana fold| > 1. Powstały wykres wulkanu (Rysunek 2B) pokazał różnicowo ekspresyjne geny (DEG), co wskazuje na silną dywergencję transkrypcyjną. Dziesięć najczęściej regulowanych genów to ABHD2, ADAR, ADCY3, ADCY9, ADD1, ADIPOR2, AFF1, AGFG1, AGRN i AHNAK w klastrze 1 oraz C2orf68, CTTN, GPR108, HERPUD1, LRPAP1, MAP1LC3B2, NKIRAS2, NR1H2, PDE5D oraz PMPCA w klastrze 2 (Rysunek 2C).

Zestaw genów powiązany z podgrupą AD

Analiza wzbogacania zestawów genów (GSEA) ujawniła odrębne profile wzbogacenia funkcjonalnego pomiędzy dwoma klastrami transkryptomicznymi (Rysunek 3A). Klaster 1 wykazał istotne wzbogacenie szlaków zaangażowanych w sygnalizację komórkową i adhezję, w tym adhezję ogniskową (rysunek 3B) oraz szlak sygnalizacji MAPK (rysunek 3C), co sugeruje stan aktywny charakteryzujący się zwiększonym interakcjami i proliferacją macierzy międzykomórkowej komórka-macierz zewnątrzkomórkową. Dla porównania, Klaster 2 wykazał silne wzbogacenie o fosforylację oksydacyjną (Rysunek 3D) i funkcję proteasomów (Rysunek 3E), co sugeruje aktywny fenotyp metaboliczny utleniający i proteolityczny.

Geny współekspresyjne w grupach molekularnych AD

Aby zidentyfikować moduły współekspresji związane z podtypami transkryptomicznymi, WGCNA przeprowadzono po wstępnym przetwarzaniu danych. Próbki odstające zostały najpierw zidentyfikowane i usunięte na podstawie hierarchicznego klastrowania odległości próbek, aby zapewnić odporność budowy sieci downstream (Rysunek 4A). Następnie wybrano moc o miękkim progu przy użyciu kryterium topologii wolnej od skal, z potęgą 6, aby uzyskać bezskalowy R² > 0,85 (Rysunek 4B). Moduły genowe były identyfikowane poprzez hierarchiczne klasteryzowanie i dynamiczne cięcie drzew, a następnie klasteryzację genów własnych, aby łączyć blisko powiązane moduły (Rysunek 4C i Rysunek 4D). Powstała sieć genów została zwizualizowana za pomocą mapy ciepła nakładania się topologicznego, potwierdzającej obecność odrębnych wzorców współekspresji genów (rysunek 4E). Analiza zależności moduł-cecha wykazała silną i istotną korelację między modułem MEyellow (_gen N = 743) a podgrupą molekularną (Rysunek 4F).

Funkcjonalne wzbogacenie genów mitochondrialnych związanych z podgrupą AD

Następnie przeprowadzono analizę wzbogacenia GO i KEGG na przecinanych genach (N = 85) wśród DEG, genach w module MEyellow oraz liście białek mitochondrialnych z MitoCarta3.0 (Rysunek 5A), aby zbadać funkcjonalne role genów związanych z mitochondrialnymi wpływającymi na różnice transkrypcyjne między klastrami. Analiza szlaków KEGG wykazała wzbogacenie w fosforylacji oksydacyjnej i szlakach metabolicznych (Rysunek 5B). Analiza wzbogacania GO wykazała znaczącą nadreprezentację terminów związanych z funkcją mitochondriów, w tym syntezy ATP napędzanej siłą napędową protonów, kompleksem łańcucha oddechowego oraz aktywnością dehydrogenazy NADH (rysunek 5C), co sugeruje, że geny te są głównie związane z metabolizmem energii mitochondrialnej i regulacją energii.

Geny mitochondrialne w rdzeniu w różnicowaniu cząsteczkowym AD

Aby zidentyfikować kluczowe geny w 85 genach związanych z mitochondrialnymi podgrupami transkryptomowymi, zbudowano sieć PPI (Rysunek 6A). Na podstawie rankingu w każdym z siedmiu miar topologicznych (patrz metody) wybrano 30 najlepszych genów, a ich przecięcia przeanalizowano i zobrazowano na wykresie UpSet (Rysunek 6B). Analiza ta wykazała, że cztery geny hubowe są konsekwentnie identyfikowane jako węzły centralne na podstawie wszystkich kryteriów rankingowych (BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2). Profile ekspresji zostały przeanalizowane w obu klastrach transkryptomicznych i stwierdzono, że wszystkie cztery geny hubowe były istotnie podwyższone w klastrze 1 w porównaniu do klastra 2 (rysunek 6C). Parowa analiza korelacji ekspresji genów wykazała pozytywne korelacje między wszystkimi czterema genami, wskazując na skoordynowaną regulację, przy czym CHCHD5 i ISOC2 wykazują najsilniejszą korelację (rysunek 6D). Ponadto model klasyfikacji, który stworzyliśmy na podstawie ekspresji tych czterech genów, wykazał silną dyskryminację między dwoma klastrami, przy czym krzywa ROC pokazała pole poniżej krzywej (AUC) > 0,7 (Rysunek 6E). Dodatkowo przeprowadzono analizę sieci regulacyjnej czynników transkrypcyjnych (TF), aby zbadać mechanizmy regulacyjne regulujące ekspresję czterech zidentyfikowanych genów hubów. Wszystkie znane i przewidywane czynniki transkrypcyjne, które potencjalnie regulują te geny hubowe, zostały przeanalizowane z hTFtarget, a wyniki zostały zintegrowane i zobrazowane jako sieć regulacyjna transkrypcji (Rysunek 7). W sieci regulatorów genów TF-hub BAD miał największą liczbę TF, a ATF3, BRD2, BRD4 i CEBPA oddziaływały ze wszystkimi czterema genami hubów, co sugeruje wspólny mechanizm regulacyjny.

Porównanie infiltracji komórek odpornościowych między podgrupami AD

Aby zbadać krajobraz immunologiczny związany z podgrupami transkryptomicznymi, przeprowadzono analizę infiltracji komórek odpornościowych za pomocą CIBERSORT, która szacuje względne proporcje 22 typów komórek odpornościowych na podstawie danych z transkryptomu zbiorczego (Rysunek 8). Wśród podgrup immunologicznych stwierdzono istotną liczbę regulatorów T (Tregs) w Klastrze 1, co sugeruje immunosupresyjne mikrośrodowisko potencjalnie związane z aktywnością mitochondrialną i zwiększonymi szlakami sygnalizacyjnymi w tej grupie. Natomiast komórki pomocnicze T pęcherzyków były istotnie wzbogacone w Klastrze 2, co wskazuje na potencjalnie bardziej aktywną adaptacyjną odpowiedź immunologiczną w tej podgrupie.

DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:

Dane transkryptomiczne analizowane w tym badaniu są publicznie dostępne w repozytorium Gene Expression Omnibus (GEO) pod numerami akcesyjnymi GSE121212, GSE157194, GSE193309 i GSE277961 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

figure-results-1
Rysunek 1: Konsensusowe klasteryzowanie próbek zmian atopowego zapalenia skóry na podstawie profili transkryptomicznych. (A) Mapa ciepła i hierarchiczne klasteryzowanie macierzy konsensusu na próbkach atopowego zapalenia skóry (AD). (B) Wykres konsensualnej skumulowanej funkcji dystrybucji (CDF) używany do określenia optymalnej liczby klastrów (k = 2–10). (C) Wykres powierzchni delta pokazujący względną zmianę powierzchni pod krzywą CDF dla każdego k. (D) Przydział konsensusu klastra dla k = 2. Każda kolumna reprezentuje indywidualną próbkę, a kolory wskazują na przynależność do klastra (Klaster 1, czerwony; Klaster 2, turkusowy). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Różnica ekspresji genów molekularnych podtypów atopowego zapalenia skóry. (A) t-rozłożony wykres stochastycznego osadzania sąsiada (t-SNE) próbek AD. Każdy punkt reprezentuje próbkę rzutowaną na dwa wymiary i jest kolorowany zgodnie z przypisaniem klastra. (B) Wykres wulkanu genów różnicowo ekspresyjnych (DEG) pomiędzy Klastrem 1 a Klastrem 2. Każdy punkt reprezentuje gen, przedstawiony przez log2 zmianę razu (oś x) oraz −log10 skorygowaną wartość p (oś y). Czerwone i niebieskie punkty wskazują na znacząco zwykłą ekspresję genów odpowiednio w Klastrze 1 i Klastrze 2, natomiast szare punkty wskazują na geny nieistotne. (C) Mapa ciepła 10 najczęściej eksprimowanych genów w Klastrze 1 i Klastrze 2. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza wzbogacania zestawów genów dla molekularnych podtypów atopowego zapalenia skóry. (A) Dwustronny wykres słupkowy pokazujący wyniki GSEA pomiędzy Klastrem 1 a Klastrem 2, z najwyższymi istotnie wzbogaconymi szlakami. Szlaki wzbogacone w klastrze 1 pokazano po prawej, a te wzbogacone w klastrze 2 po lewej. (B–E) Reprezentatywne wykresy wzbogacające dla adhezji ogniskowej, szlaku sygnalizacji MAK, fosforylacji oksydacyjnej oraz szlaków proteasomowych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza ważonej sieci współekspresji genów próbek atopowego zapalenia skóry. (A) Skupienie dendrogramu na podstawie profili ekspresji genów. (B) Indeks dopasowania topologii wolnej od skali oraz średnia łączność pomiędzy mocami progowymi miękkimi (1–30). (C) Klasteryzacja i mapa ciepła genów własnych modułów, z kolorami wskazującymi korelacje parami. (D) Hierarchiczne skupienie dendrogramu pokazujące geny pogrupowane w współekspresowane moduły. (E) Mapa ciepła macierzy nakładania się topologicznego (TOM), reprezentująca podobieństwo współekspresji między parami genów. (F) Mapa ciepła relacji moduł–cecha, pokazująca korelacje między genami własnymi modułów a cechami klinicznymi. Współczynniki korelacji są wyświetlane w każdej komórce, a intensywność koloru wskazuje siłę i kierunek korelacji (czerwony, dodatni; niebieski, ujemny). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5: Ontologia genów i wzbogacenie szlaku KEGG genów mitochondrialnych powiązanych z podtypem. (A) Diagram Venna pokazujący nakładanie się między DEG, genami modułów powiązanymi z podtypem oraz genami mitochondrialnymi. (B) Wykres bąbelkowy 20 najwyżej wzbogaconych szlaków KEGG przecinających się genów. (C) Top 10 wzbogaconych terminów w ontologii genowej (GO) dla procesów biologicznych (BP), komponentu komórkowego (CC) oraz funkcji molekularnej (MF). Wszystkie analizy wzbogacania przeprowadzono z użyciem skorygowanej wartości p < 0,05 (wskaźnik fałszywych odkryć) jako progu istotności. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-6
Rysunek 6: Analiza interakcji białko-białko i identyfikacja genów hubów. (A) sieć interakcji białko-białko (PPI) składająca się z 85 przecinających się genów. Węzły reprezentują białka, a krawędzie wskazują przewidywane lub eksperymentalnie zweryfikowane interakcje z bazy danych STRING. (B) Wykres UpSet pokazujący przecięcia między 30 najlepiej ocenianymi genami na podstawie siedmiu miar centralności sieci. (C) Wykresy pudełkowe pokazujące poziomy ekspresji czterech genów hubowych w klastrze 1 i klastrze 2. (D) Analiza korelacji parą między czterema genami hub. (E) Krzywa charakterystyki pracy odbiornika (ROC) pokazująca wydajność klasyfikacji, z czułością przedstawioną względem specyficzności. Obszar pod krzywą (AUC) wskazuje na ogólną dokładność. Istotność statystyczna w panelu (C) oceniano za pomocą testu sumy rang Wilcoxona (*p < 0,05). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-7
Rysunek 7: Sieć regulacyjna genów hubów. Czerwone kółka symbolizują geny hubów, a niebieskie okręgi odpowiadają powiązanym czynnikom transkrypcyjnym (TF). Krawędzie wskazują na interakcje regulacyjne. Rozmiar każdego węzła genowego huba odzwierciedla liczbę oddziałujących TF. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

figure-results-8
Rysunek 8: Porównanie infiltracji komórek odpornościowych między podgrupami atopowego zapalenia skóry. Wykresy pudełkowe pokazujące szacunkowy udział 22 typów komórek odpornościowych w każdym klastrze (Klaster 1, czerwony; Klaster 2, turkusowy). Gwiazdki (*) wskazują statystycznie istotne różnice między klastrami, oceniane za pomocą testu sumy rangi Wilcoxona z korekcją fałszywego wskaźnika odkryć dla wielu porównań. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopowe zapalenie skóry to powszechne i genetycznie niejednorodne zapalenie skóry, które stanowi poważne wyzwanie dla spersonalizowanych strategii leczenia. Badanie to dostarcza wglądu w molekularną heterogeniczność AD poprzez identyfikację dwóch odrębnych podgrup transkrypcyjnych w 266 próbkach skóry z urazami u pacjentów z AD. Te podgrupy wykazują różne biologiczne wzbogacenie funkcji i infiltrację komórek odpornościowych, przy czym Klaster 1 charakteryzuje się aktywnym sygnalizowaniem komórkowym i szlakami adhezji oraz wzbogaceniem regulatorowych komórek T (Treg), natomiast Klaster 2 charakteryzuje się zwiększoną fosforylacją oksydacyjną i funkcją proteasomów, a także wzrostem liczby pęcherzykowych komórek pomocniczych T. Co istotne, zidentyfikowano cztery geny związane z mitochondriami (BAD, BOLA1, CHCHD5 i ISOC2), które są podwyższone w klastrze 1. Są to geny hubowe w sieci PPI składającej się z 85 genów, które definiują oba podtypy transkryptomiczne i mogą być regulowane jednocześnie przez czynniki transkrypcyjne, w tym ATF3, BRD2, BRD4 i CEBPA.

Dwa odrębne klastry zostały zidentyfikowane na podstawie wzorca ekspresji genów, co sugeruje, że AD wykazuje istotną heterogeniczność ekspresji genów. Wcześniejsze badania wykazały, że ta heterogeniczność może być napędzana przez mechanizmy genetyczne, epigenetyczne i immunologiczne, które definiują odrębne molekularne endotypy ^5,30,31. Pomiędzy tymi dwoma klastrami zaobserwowano również różne infiltracje komórek odpornościowych: klaster 1 charakteryzował się regulacyjnymi komórkami T, a klaster 2 wzbogacony o pęcherzykowe komórki pomocnicze T (Tfh), co sugeruje podstawową heterogeniczność immunologiczną i potencjalnie odmienne mechanizmy choroby w kohorcie AD. Klaster zdominowany przez Treg sugeruje środowisko immunologiczne, w którym dominują mechanizmy regulacyjne, co może odzwierciedlać próby kontroli stanu zapalnego lub kompensacyjną odpowiedź na przewlekłą aktywację immunologiczną^32,33. Jednak w AD funkcja Treg może być upośledzona mimo zwiększonej wartości, co może nie skutecznie hamować stanu zapalnego. Natomiast klaster wzbogacony o Tfh wskazuje na zwiększoną pomoc komórek B, zwiększoną aktywność ośrodków zarodkowych oraz prawdopodobnie podwyższoną produkcję IgE, które są cechami charakterystycznymi reakcji alergicznych oraz cięższych lub zewnętrznych form AD^34,35. Komórki Tfh są znane z wspierania różnicowania komórek B i zmiany klas przeciwciał, a ich rozszerzanie koreluje z aktywnością choroby i uczuleniem alergicznym³⁶. Obecność tych odrębnych klastrów może odzwierciedlać różne fenotypy kliniczne, nasilenie choroby lub reakcje na terapię, podkreślając znaczenie spersonalizowanych podejść w badaniach i leczeniu AD.

Wiadomo, że dysfunkcja mitochondrialna odgrywa istotną rolę w patogenezie AD poprzez mechanizmy takie jak utrzymanie bariery naskórnej³⁷, produkcja reaktywnego rodzaju^{tlenu 38} oraz regulacja odpowiedzi komórek odpornościowych³⁹. Cztery białka mitochondrialne zostały zidentyfikowane jako centralne węzły genów związanych z różnicowaniem transkryptomicznym, które mogą z dużą dokładnością przewidywać podtyp molekularny (AUC>0.7). Chociaż żadne wcześniejsze badanie nie wykazało bezpośredniego związku tych genów z AD, wyniki te sugerują, że są one potencjalnymi biomarkerami do stratyfikacji pacjentów z AD oraz oceny dysfunkcji mitochondrialnej u pacjentów z AD. BAD (agonista śmierci komórkowej związany z BCL2) jest pro-apoptotycznym członkiem rodziny BCL-2, zaangażowanym w mitochondrialne sygnalizację apoptotyczną; jego wzrost w klastrze 1 może odzwierciedlać zwiększone apoptotyczne primowanie mitochondrialne u tego podtypu. BOLA1 to białko mitochondrialne zaangażowane w biogenezę klastrów żelaza i siarki oraz regulację stresu oksydacyjnego. CHCHD5 (domena spiralna-helis-spiralna-spiralna-helis-zawierająca 5) to białko błony mitochondrialnej związane z organizacją kryszt i efektywnością łańcucha transportu elektronów. ISOC2 (domena izochoryzmataza zawierająca 2) została powiązana z procesami metabolicznymi i funkcją mitochondriów. Skoordynowana zwiększouaktywność tych czterech genów w Klastrze 1 sugeruje stan zwiększonej aktywności metabolicznej mitochondrialnej oraz sygnałów apoptotycznych w tej podgrupie AD.

To badanie ma kilka ograniczeń. Chociaż badanie to zidentyfikowało dwie podgrupy molekularne z odmienną ekspresją genów w genach mitochondrialnych i infiltracją komórek odpornościowych oddzielonych, brakuje nam szczegółowych danych fenotypowych klinicznych, które pozwoliłyby powiązać warstwowość z nasileniem choroby i podłużnymi odpowiedziami na leczenie. Aby w pełni zrozumieć, co oznacza wysoka ekspresja tych czterech genów hubowych w Klastrze 1, przyszłe badania powinny integrować kompleksowe metadane kliniczne i najlepiej przeprowadzić walidację funkcjonalną w modelach keratynocytów lub myszy. Ponadto badanie opiera się na publicznie dostępnych zbiorowych danych RNA-seq; Chociaż jest potężny w analizie na dużą skalę, brakuje mu rozdzielczości w określonych typach komórek. To ograniczenie utrudnia określenie, czy obserwowana różnica ekspresji genów mitochondrialnych pochodzi z keratynocytów, komórek odpornościowych infiltrujących lub innych populacji komórek zamieszkujących skórę. Dzięki szerokiemu zastosowaniu podejść transkryptomicznych jednokomórkowych i przestrzennych, przyszłe badania znacznie skorzystają na mocy dekonwilacjonowania sygnałów ekspresji i dostarczania dokładniejszego obrazu profilu transkryptomicznego na poziomie komórkowym. Dodatkowo, wszystkie dane pochodzą z próbek biopsji punch, które pobierają pełną grubość skóry. Przyszłe badania z wykorzystaniem taśmowego RNA-seq mogą zaoferować komplementarne, nieinwazyjne podejście do profilowania powierzchownego transkryptomu naskórka i potwierdzić zidentyfikowane sygnatury podgrup w minimalnie inwazyjnych warunkach. Przyszła integracja danych RNA-seq z pojedynczych komórek oraz transkryptomii przestrzennej jeszcze bardziej przyspieszyłaby rozdzielczość specyficznych dla typu komórek sygnatur mitochondrialnych w skórze AD.

Podsumowując, badanie to analizowało transkryptomiczną heterogeniczność AD w 266 próbkach, zidentyfikowało kluczowe geny mitochondrialne oraz unikalną infiltrację komórek odpornościowych, różnicując podgrupy. Te odkrycia poprawiają zrozumienie heterogeniczności molekularnej AD i podkreślają potencjał do opracowania precyzyjnych metod leczenia opartych na konkretnych profilach molekularnych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
CIBERSORT	Uniwersytet Stanforda	v0.1.0; dekonwolucja komórek odpornościowych; https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler	Bioconductor	v4.12.6; Analiza wzbogacania GSEA i GO/KEGG; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
ConsensusClusterPlus	Bioconductor	v1.64.0; nienadzorowane skupianie konsensusu; https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2	Bioconductor	v1.46.0; różnicową analizę ekspresji genów; https://bioconductor.org/packages/DESeq2
Omnibus ekspresji genów (GEO)	NCBI	Publiczne repozytorium danych transkryptomicznych; zbiory danych GSE121212, GSE157194, GSE193309, GSE277961; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
ggplot2	CRAN	wizualizacja danych; https://ggplot2.tidyverse.org
ggraph	CRAN	Wizualizacja grafów i sieci; https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVis	GitHub (junjunlab)	v0.1.0; wizualizacja GSEA; https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget	Uniwersytet Nauki i Technologii Huazhong	baza docelowych czynników transkrypcji ludzkich; http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
igraph	CRAN	Konstrukcja i wizualizacja sieci; https://igraph.org
Limma	Bioconductor	funkcję removeBatchEffect; https://bioconductor.org/packages/limma
MitoCarta3.0	Instytut Broad	Kuratorowana baza danych białek mitochondrialnych; https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB (zestawy genów Hallmark)	Instytut Broad	baza danych zbiorów genów dla GSEA; https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
org. Hs.eg.db	Bioconductor	baza danych adnotacji genomu ludzkiego; https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
R	Zespół R Core	Środowisko obliczeń statystycznych; https://www.r-project.org
STRING	EMBL	v12.0; baza danych interakcji białko-białko; https://string-db.org
sva (ComBat-seq)	Bioconductor	v3.44.0; korekcja efektu wsadowego; https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNA	CRAN	v1.73; analizę ważonej sieci współekspresji genów; https://cran.r-project.org/package=WGCNA

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Analiza transkryptomiczna ujawnia podgrupy mitochondrialne w zmianach atopowego zapalenia skóry

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles