Badanie to miało na celu zbadanie wpływu Tymochinonu na stres oksydacyjny, ścieżkę sygnalizacyjną Keap-1/Nrf-2 oraz zachowanie w osoczu, korze mózgowej i hipokampie szczurów narażonych na bisfenol A.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie to miało na celu zbadanie wpływu Tymochinonu na stres oksydacyjny, ścieżkę sygnalizacyjną Keap-1/Nrf-2 oraz zachowanie w osoczu, korze mózgowej i hipokampie szczurów narażonych na bisfenol A.
Przewlekła ekspozycja na niskie dawki bisfenolu A (BPA), szeroko stosowanego środka zaburzającego działanie hormonów, była coraz częściej łączona ze stresem oksydacyjnym pośredniczącym w neurotoksyczności. Tymochinon (TQ), bioaktywny składnik Nigella sativa, wykazuje silne właściwości przeciwutleniające; jednak jego potencjał neuroprotekcyjny przeciwko toksyczności wywołanej BPA pozostaje niedostatecznie zrozumiany. Biorąc pod uwagę rozpowszechniony charakter ekspozycji na BPA, identyfikowanie skutecznych i dostępnych strategii neuroprotekcyjnych ma rosnące znaczenie. W badaniu tym zbadano wpływ TQ na stres oksydacyjny, sygnałowanie Keap-1/Nrf-2, zachowanie oraz zmiany histopatologiczne u szczurów wystawionych na BPA. Łącznie 24 dorosłych samców szczurów Wistar Albino przypisano losowo do czterech grup (n = 6/grupa): kontrolna, BPA, BPA + 10 mg/kg TQ (BPA+TQ I) oraz BPA + 20 mg/kg TQ (BPA+TQ II). BPA (50 µg/kg) i TQ były podawane doustnie przez 30 dni. Ekspozycja na BPA wywołała istotne zaburzenia behawioralne, stres oksydacyjny, zakłócenie sygnałowania Keap-1/Nrf-2 oraz wyraźne zmiany histopatologiczne w hipokampie i korze mózgowej. Leczenie TQ znacząco poprawiło aktywność ruchową i zachowanie przypominające depresję, zmniejszyło peroksydacje lipidów i poziom tlenku azotu, przywróciło zdolność przeciwutleniającą związaną z glutationem oraz znormalizowało ekspresję Keap-1 i Nrf-2 (p < 0,001). Te efekty ochronne były bardziej zauważalne przy wyższej dawce TQ. Łącznie wszystkie te wyniki pokazują, że tymochinon łagodzi neurotoksyczność wywołaną przez BPA poprzez modulacje stresu oksydacyjnego i szlaku sygnałowego Keap-1/Nrf-2, podkreślając jego potencjał jako środka neuroprotekcyjnego przeciwko ekspozycji na BPA istotnej ekologicznie.
Bisfenol A (BPA) jest związkiem syntetycznym szeroko stosowanym w tworzywach sztucznych i żywicach epoksydowych i jest powszechnie wykrywany w materiałach do pakowania żywności, systemach wodnych, urządzeniach medycznych i produktach domowych1. Ciągła ekspozycja na środowisko wzbudziła obawy dotyczące jego potencjalnych neurotoksycznych efektów, szczególnie w warunkach przewlekłego niskiego dawkowania, które odzwierciedlają prawdziwą ludzką ekspozycję.
Mimo że agencje regulacyjne, takie jak U.S. Food and Drug Administration i U.S. Environmental Protection Agency, zdefiniowały 50 µg/kg/dzień jako poziom bez obserwowanych niekorzystnych efektów, pojawiające się dowody eksperymentalne i epidemiologiczne wskazują, że zmiany behawioralne i poznawcze mogą wystąpić w niższych dawkach. W związku z tym, europejski dopuszczalny dzienny przyjęty poziom został obniżony do 4 µg/kg/dzień, podkreślając potrzebę badania mechanizmu efektów narażenia na BPA istotnego dla środowiska1,2.
Stres oksydacyjny jest uważany za centralny mechanizm leżący u podstaw neurotoksyczności indukowanej przez BPA. BPA zakłóca równowagę redoks komórkowych poprzez zmniejszenie obrony przeciwutleniającej, takiej jak glutation (GSH) i zwiększenie markerów peroksydacji lipidów, w tym malondialdehydu (MDA)3,4. Jednak mechanizmy regulacyjne sterujące reakcjami przeciwutleniającymi pod wpływem ekspozycji na BPA pozostają niewystarczająco scharakteryzowane.
Szlak białka 1 podobnego do Kelch skojarzonego z ECH (Keap-1)/czynnik 2 związany z czynnikiem erytroidalnym jądra (Nrf-2) jest głównym endogennym mechanizmem obrony przeciwutleniającej. W warunkach stresu oksydacyjnego, Nrf-2 oddziela się od Keap-1, przemieszcza się do jądra i aktywuje ekspresję genu zależną od elementu odpowiedzi przeciwutleniającej5. Mimo że jego ustalona rola w obronie komórkowej, regionowo specyficzna modulacja sygnalizacji Keap-1/Nrf-2 w mózgu podczas narażenia na BPA istotnego dla środowiska nie została kompleksowo zbadana w powiązaniu z wynikami behawioralnymi.
Tymochinona (TQ), główny składnik aktywny oleju z nasion Nigella sativa, jest lipofilową benzochinoną zdolną do przenikania przez barierę krew-mózg. TQ wykazuje właściwości przeciwutleniające, przeciwzapalne i przeciwapoptoticzne, częściowo poprzez aktywację sygnalizacji Nrf-2 i wzmocnienie endogennej zdolności przeciwutleniającej5,6. Podczas gdy poprzednie badania wykazały efekty ochronne TQ w różnych modelach neurotoksyczności, zintegrowane podejście metodologiczne oceniające markery stresu oksydacyjnego, sygnalizację Keap-1/Nrf-2 i parametry behawioralne w ramach tego samego paradygmatu ekspozycji na BPA jest niedostateczne5,6,7.
Przedstawiamy tutaj reproduktywalny protokół eksperymentalny do oceny biomarkerów stresu oksydacyjnego, ekspresji szlaku Keap-1/Nrf-2 i zmian behawioralnych w modelu szczurzym istotnej dla środowiska ekspozycji na BPA oraz do oceny efektów neuroprotekcyjnych tymochinony w wielu regionach mózgu.
Wysunęliśmy hipotezę, że ekspozycja na BPA w niskiej dawce powoduje upośledzenia behawioralne poprzez oksydacyjny stres związany z dysregulacją szlaku sygnalizacji Keap-1/Nrf-2, a tymochinona łagodzi te efekty poprzez przywrócenie równowagi redoks i aktywację odpowiedzi przeciwutleniających zależnych od Nrf-2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Eksperymentów na Zwierzętach (Numer zgody: 68429034/07).
Zwierzęta i projekt eksperymentu
Dwadzieścia cztery dorosłe samce szczura Wistar Albino (200-250 g) zostały uzyskane z Laboratorium Badań na Zwierzętach Eksperymentalnych i umieszczone indywidualnie w kontrolowanych warunkach (cykl 12 h światło/ciemność, 24 ± 2 °C) z ad libitum dostępem do standardowej karmy i wody pitnej. Zwierzęta zostały przyzwyczajone do warunków laboratoryjnych przed rozpoczęciem eksperymentu, który trwał 32 dni.
Śczurki zostały losowo przydzielone do grup eksperymentalnych za pomocą metody prostego losowania generowanego komputerowo, aby zminimalizować zafałszowanie selekcji, z równą liczbą zwierząt przydzielonych do każdej grupy (n = 6/grupa): kontrola, BPA, BPA + 10 mg/kg tymochinonu (BPA + TQ I) oraz BPA + 20 mg/kg tymochinonu (BPA + TQ II). Wielkość próby została określona na podstawie analizy a priori za pomocą oprogramowania G*Power (wersja 3.1). Na podstawie wielkości efektów zgłoszonych w poprzednich badaniach5,6,7 oceniających neurotoksyczność indukowaną przez BPA i interwencje przeciwutleniające, szczególnie dla wyników biochemicznych i behawioralnych, założono statystyczną moc 0,80 dla jednokierunkowej analizy wariancji. W takich warunkach, wymagano co najmniej sześciu zwierząt na grupę, aby wykryć statystycznie istotne różnice między grupami eksperymentalnymi.
BPA (50 µg/kg) i TQ (10 lub 20 mg/kg) były podawane doustnie przez zgłębnik 1x dziennie przez 30 dni. Wszystkie leki były świeżo przygotowywane i podawano w łącznej objętości 1 mL/kg. Dawka BPA stosowanej w niniejszym badaniu (50 µg/kg/dzień) została wybrana na podstawie jej oznaczenia jako poziom bez obserwowanych szkodliwych efektów i dawka referencyjna przez Agencję Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych i U.S. Food and Drug Administration. Ta dawka była szeroko stosowana w badaniach eksperymentalnych w celu modelowania ekspozycji na BPA istotnej dla środowiska i badania potencjalnych neurobehawioralnych i biochemicznych zmian występujących na poziomach ekspozycji uważanych wcześniej za bezpieczne. Co ważne, gromadzące się dowody eksperymentalne wskazują, że niekorzystne efekty neurologiczne i behawioralne mogą wystąpić na lub poniżej tej dawki, co potwierdza jej istotność dla oceny toksyczności BPA w niskich dawkach1,2. Wybór dawek TQ (10 i 20 mg/kg) opierał się na poprzednich badaniach eksperymentalnych wykazujących jej skuteczność neuroprotekcyjną i przeciwutleniającą bez indukowania toksyczności5,6,7. Te dawki były szeroko stosowane w modelach gryzoni neurotoksyczności, stresu oksydacyjnego i neurozapalenia i są znacznie niższe od zgłoszonych progów toksyczności dla wielokrotnego podawania. Żadne wstępne badania dotyczące dawkowania nie zostały przeprowadzone; wybór dawki opierał się na precedensach literaturowych i uznanych profilach bezpieczeństwa, aby zapewnić zarówno skuteczność, jak i istotność translacyjną.
BPA był podawany przez 30 kolejnych dni. Oceny behawioralne przeprowadzono w 31. i 32. dniu po ostatniej ekspozycji. Zwierzęta zostały uśmiercone w 32. dniu po zakończeniu wszystkich testów behawioralnych. Ten harmonogram został zaprojektowany, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na ocenę behawioralną, jednocześnie minimalizując potencjalne skutki zaburzające ostrej manipulacji lub stresu proceduralnego na późniejsze analizy biochemiczne, molekularne i histopatologiczne. Tymochinon był podawany 1x dziennie bezpośrednio po podawaniu BPA za pomocą tej samej doustnej drogi. Testy behawioralne przeprowadzono po ostatnim podaniu BPA i TQ. Harmonogram eksperymentu jest przedstawiony na Rysunku 1.
Pomiar masy ciała
Masę ciała mierzono za pomocą skali cyfrowej o precyzyjności cyfrowej (±0.1 g). Każdy szczur był ważyony indywidualnie rano przed podaniem leku, a pomiary były rejestrowane w dniach 1, 10, 20 i 32 w znormalizowanych warunkach, aby zminimalizować zmienność (Rysunek 2).
Oceny behawioralne
Wszystkie parametry behawioralne były oceniane przez pojedynczego obserwatora nieznajomego przydziału do grupy, aby zminimalizować zafałszowanie ze strony obserwatora i zmienność międzyobserwacyjną. Zwierzęta były przyzwyczajone do pomieszczenia testowego przez co najmniej 30 min przed testem behawioralnym, aby zmniejszyć stres spowodowany nowością.
Połączone użycie testu na otwartym polu (OFT) i testu przymusowego pływania (FST) umożliwia kompleksową ocenę neurotoksyczności behawioralnej wywołanej przez BPA, ponieważ wykazano
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Masa ciała
W 1. i 32. dniu badania nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w masie ciała pomiędzy grupami (F(3,20)=2.750, p > 0.05; Rysunek 2).
Wyniki testów behawioralnych
Analiza testu otwartego pola wykazała, że ekspozycja na BPA znacząco ograniczyła aktywność lokomotoryczną, co objawiło się zmniejszoną liczbą przejść w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0.001). Leczenie dawkami 10 mg/kg ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Niniejsze badanie oceniło wpływ BPA, strukturalnego składnika poliwęglanów uważanych za bezpieczne przez USEPA w dawce 50 µg/kg1,2, na stres oksydacyjny, sygnałowanie Keap-1/Nrf-2, zachowanie i zmiany histopatologiczne w mózgu szczurów. Ponadto zbadano potencjalne działanie neuroprotekcyjne TQ, naturalnie występującego związku o dobrze udokumentowanych właściwościach antyoksydacyjnych, w dwóch różnych dawkach (10 mg/kg i 20 mg/kg)5,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają żadnych sporów interesu do zadeklarowania.
Ten projekt był wspierany przez Biuro Koordynacji Projektów Badawczych Uniwersytetu (Numer projektu TIP.A4.24.003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5,5'-Ditiobis(2-nitrobenzoesan) | Thermo Scientific | 69-78-3 | |
| Centryfuga stołowa NF048 | Nüve | 43560 | |
| Beta_Aktyna | ThermoFisher Scientific, Stany Zjednoczone | 7D2C10 | |
| Bisfenol A | Merck | 239658 | |
| Roztwór BSA | Proteintech, Stany Zjednoczone) | 66201-1-Ig | |
| Butylowane hydroksytoluen | Sigma Aldrich | 128-37-0 | |
| Dijital Homojenizatör | Daihan Scientific | https://www.artlaboratuvarcih azlari.com/urun/daihan-hg- 15d-dijital-homojenizator-set -a?srsltid=AfmBOorx_az06ulc HpSzKZsuP8-47Za4BkvLOM2 2Xhp00tgwWhJ-86Vc | |
| Hematoksylina i eozyna | Bio Optica | W01030708 | |
| Kwas solny | Merck | 7647-01-0 | |
| Program oprogramowania Image J | NIH; Waszyngton, USA | https://imagej.net/ij/ | |
| Zestaw do barwienia immunohistochemicznego | Lab VisionTM UltraVisionTM Large Volume Detection System: przeciwciała wieloskojarzeniowe | HRP, TA-125-HL | |
| Leica Autocut 14051956472 | Niemcy | https://www.leicabiosystems. com/histology-equipment/mic rotomes/histocore-autocut/ | |
| Mikroskop świetlny | Nikon, Eclipse | Ni-U, 940728 | |
| N-(1-Nafto)etylenodiamina | Thermo Scientific | 1465-25-4 | |
| Nano czytnik płytek | BMG LABTECH | SPECTROstar Nano | |
| Roztwór soli fizjologicznej z fosforanem | Merck | P4417 | |
| Przeciwciała pierwotne Keap-1 | Proteintech | Nr kat. 10503-2-AP, 1:200 | |
| Przeciwciała pierwotne Nrf-2 | Proteintech | Nr kat. 16396-1-AP, 1/100 | |
| Zestaw Qubit Protein BR Assay | ThermoFisher Scientific-INVITROGEN | Q33211 | |
| Cytrynian sodu | Merck | 03-04-6132 | |
| Siarczan dodecylu sodu | Thermo Scientific | 151-21-3 | |
| Wodorotlenek sodu | Merck | 1310-73-2 | |
| Azotlan sodu | Merck | 7631-99-4 | |
| Streptawidyna peroksydaza | Thermo Scientific | SHRP248-B | |
| Sulfonamid | Thermo Scientific | 63-74-1 | |
| Kwas tiobarbiturowy | Merck | 504-17-6 | |
| TQ | CAYMAN | 490-91-5 | |
| Kwas trikarbalowy, 99% | Thermo Scientific Chemicals | 139360500 | |
| Kwas trichlorooctowy | Thermo Scientific Chemicals | 76-03-9 | |
| Tris-HCl | Thermo Scientific | 1185-53-1 | |
| Chlorek wanadu(III) | Sigma Aldrich | 7718-98-1 | |
| Substrat chemiluminescencyjny West Pico PLUS i iBright 750 | System Thermo Fisher Scientific | https://www.clinxsci.com/product/mini _chemiluminescence_imaging_system ?gad_source=1&gad_campaignid= 16224184202&gbraid=0AAAAAoN6 UOOtoB8UD0deumBAMD8Xi-1l-&g clid=CjwKCAjwgeLHBhBuEiwA L5gNEXtK2CNSLS1GqllMuNgkrFYD aW7yK585njQjFja485Fkwj9lRUEKD BoCgLoQAvD_BwE | |
| Roztwór siarczanu cynku | Merck | 7733-02-0 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.