Wpływ na jakość RNA PBMC przy różnych czasach kriokonserwacji i metodach przetwarzania u pacjentów z zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuc

Podsumowanie

Badanie to porównuje odczynnik potrójnej izolacji (TRIzol) oraz klasyczny roztwór (FBS + DMSO) dla PBMC pacjentów z kriogeniochronem NSCLC. TRIzol utrzymuje satysfakcjonującą integralność RNA do 6 miesięcy, co czyni go zalecanym do wysokiej jakości zachowania RNA.

Streszczenie

Kriokonserwowane komórki monojądrowe krwi obwodowej (PBMC) są szeroko stosowane w sekwencjonowaniu RNA (RNA-seq), a jakość ich RNA bezpośrednio wpływa na wyniki testów. Jednak krioprezerwacja może łatwo prowadzić do degradacji RNA w PBMC, a kwestia poprawy jakości RNA podczas długoterminowej krioprezerwacji pozostaje nierozwiązana. PBMC z świeżych próbek krwi pobranych od pacjentów z zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuc (NSCLC) zostały wykorzystane jako kontrola. Skuteczność zachowania RNA próbek PBMC porównano pomiędzy klasycznym roztworem kriokonserwacji komórek (90% surowicy płodowej bydła [FBS] + 10% dimetylosulfoksydu [DMSO]) a powszechnym odczynnikiem ekstrakcyjnym RNA (TRIzol) w temperaturze -80 °C przez 1, 3 i 6 miesięcy. Stężenie, czystość i integralność RNA (mierzone przez liczbę integralności RNA [RIN]) oceniono za pomocą wielopróbkowego mikrowoluminowego spektrofotometru UV-Vis oraz zautomatyzowanego mikrofluidycznego elektroforetycznego bioanalizatora, aby zapewnić teoretyczne podstawy do zachowania wysokiej jakości próbek RNA. Badanie wykazało, że stężenie, czystość i integralność RNA w PBMC maleją wraz z wydłużeniem czasu kriokonserwacji. Chociaż obie metody przetwarzania nie miały wpływu na stężenie RNA, wpływały na czystość i integralność RNA. Integralność RNA PBMC kriokonserwowanych z TRIzol przez 6 miesięcy pozostała zadowalająca. Nasze wyniki wskazują, że TRIzol przyczynia się do skutecznej krioprezerwacji i utrzymuje wysokiej jakości RNA.

Wprowadzenie

RNA-seq PBMC u pacjentów z NSCLC odgrywa kluczową rolę w ocenie skuteczności immunoterapii. Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) jest powszechnym złośliwym guzem na całym świecie, a około 70% pacjentów diagnozuje się w zaawansowanym stadium z niską rokownictwem ^1,2. Immunoterapia zrewolucjonizowała paradygmat leczenia NSCLC, oferując innowacyjne strategie terapeutyczne ^3,4. W leczeniu inhibitorów punktów kontrolnych odporności (ICI), sekwencjonowanie RNA (RNA-seq) komórek monojądrowych krwi obwodowej (PBMC) uzyskanych od pacjentów z NSCLC może monitorować dynamiczne zmiany klinicznych korzyści immunoterapii⁵. Przykładowe źródła RNA-seq to tkanka nowotworowa oraz PBMC ^6,7, przy czym PBMC są kluczowym przykładem biologicznym zarówno w badaniach klinicznych, jak i podstawowych badaniach naukowych⁸. Kriokonserwacja stanowi podstawową metodę długoterminowego przechowywania próbek, utrzymując komórki i tkanki w stanie spokojem przy jednoczesnym zachowaniu ich biologicznego potencjału i cech. W konsekwencji krioprezerwacja PBMC stała się możliwą i szeroko przyjętą metodą. Krioprezerwowany PBMC ułatwia analizę wsadową próbek, minimalizuje zmienność wewnątrzlaboratoryjną i międzylaboratoryjną oraz optymalizuje wykorzystanie zasobów ^8,9. Na przykład badania wykazały, że stosowanie mrożonego medium RPMI-1640 z dodatkiem 40% surowicy cielętej płodu (FCS) i 20% dimetylosulfoksydu (DMSO) do kriokonserwacji PBMC pokazuje, że proporcje komórek T i B wyrażających kombinację CD39 i CD73 pozostawały stosunkowo stabilne w ciągu sześciu miesięcy od magazynowania¹⁰. Jedno z badań porównało trzy komercyjne zestawy kriokonserwacyjne oraz dwa środki krioprotekcyjne (90% RPMI - 10% DMSO, 90% osocz-10% DMSO), wykazując podobną żywotność komórek (81,0%) i wskaźniki regeneracji (73,7%) w różnych metodach. Jednak wszystkie krioprezerwacje PBMC wykazywały istotnie niższą żywotność w porównaniu ze świeżymi próbkami⁵. Dalsze badania wykazały, że ponownie zawieszony PBMC wytrąca się w odczynniku TRIzol i natychmiast zamraża je w temperaturze -80 °C. Po 1–2 dniach zaobserwowano, że wartość RIN PBMC była wyższa niż w próbkach pełnej krwi¹¹.

Inne badanie porównało próbki leukocytów poddane TRIzolu, RNAlaterowi i innym odczynnikom, wykazując, że wszystkie metody osiągnęły wartości integralności RNA (RIN) >7. Integralność RNA oceniono za pomocą automatycznego mikrofluidycznego elektroforetycznego bioanalizatora, a RIN obliczono jako ilościową miarę jakości RNA. Próbki z RIN ≥7 uznano za odpowiednie do analizy RNA-seq¹². Warto zauważyć, że grupa leukocytów + RNAlater wykazywała istotnie niższy wynik RNA w porównaniu z grupą leukocytów + TRIzol¹². Jednak obecne badania nad krioprezerwacją PBMC koncentrują się głównie na żywotności komórek i analizie fenotypu komórek odpornościowych po rozmrożu; Ograniczoną uwagę poświęcono systematycznej, długoterminowej ocenie jakości RNA w różnych warunkach zachowania. Ponadto ustandaryzowane protokoły dotyczące kriokonserwujących próbek PBMC w celu zachowania integralności RNA pozostają niedostatecznie opracowane 13,14,15. Ta luka jest szczególnie istotna w immunoterapii NSCLC, gdzie wysokiej jakości RNA z podłużnie zebranych PBMC jest niezbędna do wiarygodnego odkrywania biomarkerów i monitorowania odpowiedzi na leczenie.

W niniejszym badaniu zakładamy, że wybór metody kriokonserwacji znacząco wpływa na długoterminową integralność i jakość RNA pochodzącego z PBMC, a zoptymalizowany protokół może utrzymać odpowiedniość RNA do wrażliwych testów, takich jak RNA-seq. Aby temu przeciwdziałać, jako kontrolę wykorzystano świeżo wyizolowane PBMC z próbek krwi pobranych od zaawansowanych pacjentów NSCLC. Skuteczność zachowania RNA próbek PBMC porównano między dwoma metodami leczenia (90% FBS + 10% DMSO i TRIzol) w temperaturze -80 °C przez 1, 3 i 6 miesięcy (Rysunek 1). Stężenie, czystość i integralność RNA (mierzone przez RIN) oceniono za pomocą wielopróbkowego mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis oraz zautomatyzowanego mikrofluidycznego elektroforetycznego bioanalizatora. Celem tego badania jest dostarczenie teoretycznych podstaw do wysokiej jakości zachowania próbek RNA oraz rozwój badań translacyjnych i zachowania próbek w precyzyjnej medycynie nowotworowej.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem próbek tkanek ludzkich i klinicznych w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Komitet Etyki Szpitala Onkologicznego w Jilin (Zatwierdzenie etyczne nr 202507-002-01). Przed pobraniem próbki uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich uczestników lub ich prawnych opiekunów. Pobrano próbki krwi obwodowej (10 mL na pacjenta) od 19 pacjentów z zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuc (NSCLC) w Jilin Cancer Hospital, co dało łącznie 133 próbki RNA. Aby zapewnić bezpieczeństwo laboratoryjne, wszystkie operacje związane z chemikaliami niebezpiecznymi były wykonywane w szafie bezpieczeństwa biologicznego.

Szczegółowe informacje o instrumentach, odczynnikach i materiałach eksploatacyjnych użytych w eksperymencie zawarto w Tabeli Materiałów.

Izolacja PBMC
Próbki krwi obwodowej zostały przetworzone do izolacji PBMC w ciągu 2 godzin po pobraniu. PBMC były izolowane i oczyszczane przez wirowanie Ficoll-Paque gradientu gęstości w napięciu 400 × g przez 25 minut w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem. Po wirowaniu pośrednia warstwa mlecznobiałych limfocytów (zawierająca PBMC) została starannie zasysana¹⁶. Co ważne, ściśle ustandaryzowaliśmy stężenie wejściowe PBMC dla każdej próbki i każdej grupy, aby zapewnić spójną liczbę komórek we wszystkich warunkach eksperymentalnych, minimalizując tym samym zmienności spowodowane wejściem i przetwarzaniem komórek. Zapewnia to, że obserwowane różnice odzwierciedlają rzeczywiste efekty różnych metod konserwacji, a nie zmienność techniczną. Dla każdego pacjenta izolowane PBMC dzielono na 7 probówek: jedna probówka służyła do natychmiastowej ekstrakcji RNA, a stężenie, czystość i integralność oceniano tak. Pozostałe sześć probówek zostało krioprezerwowanych z chłodzeniem -1 °C/min: trzy poddano 1 mL 90% FBS + 10% DMSO, a pozostałe trzy 1 mL TRIzolu, po czym przechowywano w temperaturze -80 °C. Ekstrakcję RNA i ocenę jakości przeprowadzono po 1, 3 i 6 miesiącach przechowywania w zamrażaniu.

Ekstrakcja RNA
Próbki pobierano z magazynu o temperaturze -80 °C i rozmrażano w temperaturze 4 °C, aż do całkowitego rozmrozienia¹⁷ °C. Próbki zachowane z 90% roztworem kriokonserwacyjnym w 90% FBS + 10% DMSO lub TRIzol były myte raz PBS, wirowane w 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a supernatant odrzucano, aby zatrzymać pellet komórkowy. Całkowite RNA zostało wyekstrahowane za pomocą TRIzolu. Konkretnie, do probówki mikrowirówki zawierającej przetworzoną próbkę dodano odczynnik TRIzol, wymieszano przez inwersję i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby zapewnić pełną lizę. Następnie dodano 200 μL chloroformu, dokładnie wymieszano przez wstrząsanie i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po wirowaniu w 2400 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, górna faza wodna była ostrożnie zasysana i przelana do nowej rurki Eppendorfa. Następnie dodano izopropanol (0,5 mL), dobrze wymieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5–10 minut. Po centrifugowaniu w 2400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, supernatant został odrzucony, pozostawiając wytrąceń RNA na dnie rurki.

Osad został ponownie zawieszony w 75% etanolu (1 mL) przy delikatnym potrząsaniu, a następnie nastąpiła wirówka w 1600 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant został odrzucony, a pellet RNA pozostawiono do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 5–10 minut. Na koniec próbki RNA rozpuszczano w wodzie o objętości 50 μL DEPC i inkubowano w kąpieli wodnej o temperaturze 55–60 °C przez 5–10 minut¹⁸ minut. Wykrywanie stężenia i czystości RNA. Stężenie i czystość RNA mierzono metodą absorpcji ultrafioletowej za pomocą wielopróbkowego mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis (zakres pomiarów: 2,5–3000 ng/μL). Stężenie RNA określono na podstawie wartości absorpcji 260 nm, natomiast czystość RNA oceniano na podstawie stosunku A260/A280. Wprowadzono oprogramowanie pomiarowe; Kliknięto "Kwas nukleinowy" na głównym interfejsie. Platforma detekcyjna była dwukrotnie płukana podwójnie destylowaną wodą, a następnie 1,5 μL próbki RNA zostało na nią podane pipetą. Wybrano RNA-40 dla typu próbki, kliknięto "Measure" i zarejestrowano stężenie oraz wartości czystości A260/280. Stosunek A260/A280 między 1,9 a 2,1 wskazywał na wysoką czystość RNA, podczas gdy wartości poniżej 1,8 sugerowały zanieczyszczenie białkami, a wartości powyżej 2,2 wskazywały na potencjalną degradację RNA lub rezydualny izotiocjanian¹⁹.

Wykrywanie integralności RNA
Integralność RNA (RIN) oceniono za pomocą zautomatyzowanego mikrofluidycznego elektroforetycznego bioanalizatora i zestawu detekcyjnego. RIN waha się od 1 do 10, gdzie 1 oznacza silnie rozłożone RNA, a 10 nienaruszone RNA. Do analizy 1,2 μL RNA umieszczono w rurce PCR, termicznie denaturowano w temperaturze 70 °C przez 2 minuty za pomocą cyklera termicznego i natychmiast umieszczono na lodzie. Następnie do studni detekcyjnej chipu dodano 1 μL zdenaturowanego RNA dla analizy²⁰. Oprogramowanie zostało uruchomione, wybrano "Assays", a z menu rozwijanego wybrano "RNA". Program "Eukaryote Total RNA Nano Series II.xsy" został wybrany na podstawie użytego odczynnika. Kliknięto "Start", aby rozpocząć wykrywanie. Po około 10 minutach sprawdzono liczbę szczytów i wysokość szczytu drabiny pod kątem normalności.

Metody statystyczne
Przeprowadzono testy normalności dla wszystkich danych. Dane rozkładu normalnego wyrażano jako średnią ± odchylenie standardowe (SD), natomiast dane o rozkładzie nienormalnym jako medianę (zakres międzykwartylowy, IQR). Porównania między dwiema grupami analizowano za pomocą testu t-pair dla danych o rozkładzie normalnym oraz testu nieparametrycznego próbek powiązanych dla danych nierozkładających się normalnie. Do porównań między trzema lub więcej grupami zastosowano analizę wariancji powtórzonych dla danych rozkładających się normalnie, a test nieparametryczny z próbkami powiązanymi stosowano dla danych o rozkładzie nienormalnym. Wszystkie analizy statystyczne zostały przeprowadzone przy użyciu SPSS 19.0 i GraphPad Prism 9.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

Wyniki

Wpływ różnych czasów krio-konserwacji i metod przetwarzania na stężenie RNA w próbkach PBMC
Wpływ różnych czasów krio-konserwacji: jako grupę kontrolną wykorzystano świeże próbki PBMC pobrane od pacjentów z zaawansowanym NSCLC. Próbki traktowano albo TRIzol-em, albo mieszaniną 90% FBS + 10% DMSO i przechowywano w temperaturze -80 °C przez 1, 3 i 6 miesięcy; następnie wyizolowano całkowite RNA w celu pomiaru jego stężenia. W przypadku próbek traktowanych TRIzol-em stężenia RNA w czterech grupach wynos...

Dyskusja

Na jakość RNA w próbkach biologicznych wpływa wiele czynników, w tym zmienne przedanalityczne, warunki transportu, czas przetwarzania w temperaturze otoczenia, martwica tkanek, temperatura i produkty zamrażania, wielkość i liczba aliquotów oraz czas przechowywania, co istotnie wpływa na jakość RNA²¹. W przypadku identycznych próbek różnice w czasie kriokonserwacji i metodach przetwarzania mogą znacząco wpływać na jakość RNA. Wcześniejsze badania podkreślały kluczowe znaczenie integralności RNA, po...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939B	Wykrywanie integralności RNA, ocena jakości RNA poprzez generowanie Numeru Integralności RNA (RIN)
Agilent RNA 6000 Nanokit	Agilent	5067-1511	W połączeniu z bioanalizatorem Agilent 2100, dostarczając dedykowane odczynniki i chipy zapewniające integralność RNA
Wirówka	Eppendorf	5424R	Do ekstrakcji RNA
Wirówka	Eppendorf	5810R	Do ekstrakcji PBMC
Chloroform	Chińska Narodowa Korporacja Grupy Farmaceutycznej	20191031	Do ekstrakcji RNA metodą Trizol, używaną do oddzielania fazy wodnej zawierającej RNA od fazy organicznej zawierającej zanieczyszczenia
Dimetylsulfoksyd	Beijing Dingguo Changsheng	DH105-2	Jako rozwiązanie kriokonserwacji PBMC, umożliwiające długotrwałe przechowywanie próbek w temperaturze -80 i stopni; C
Rurka	Corning	MCT-150-C	Do przechowywania próbek, mieszania odczynników, wirowania i innych operacji eksperymentalnych
Etanol	Shandong Lierkang	25071901A	Ekstrakcja IIn RNA metodą Trizol, używana do płukania wytrąceń RNA w celu usunięcia resztek
Surowica bydła płodowa	Xpbiomed	C04001-500	Jako rozwiązanie kriopkonserwacyjne dla PBMC, umożliwiające długotrwałe przechowywanie
Roztwór separacji Ficoll	Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology CO., LTD	CC0161	Do izolacji i oczyszczania PBMC za pomocą wirowania gradientu gęstości
GeneTouch(Plus) Cykler termiczny	Bioer	TC-EA-48DA	Do termicznej denaturacji RNA (70 stopni i g; C przez 2 minuty), po czym następuje wykrywanie za pomocą bioanalizatora
Izopropanol	Chińska Narodowa Korporacja Grupy Farmaceutycznej	20210929	W ekstrakcji RNA metodą Trizol, stosowaną do wytrącania RNA
Spektrofotometr Nanodrop 8000	GeneCompany	ND-8000	Dla stężenia RNA (na podstawie absorpcji przy 260 nm) i czystości (na podstawie stosunku A260/A280) przy użyciu metody absorpcji ultrafioletowej
Lampy PCR	Corning	PCR-02-C	Do termicznej denaturacji RNA (70 stopni i g; C przez 2 minuty), po czym następuje wykrywanie za pomocą bioanalizatora
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym	Układ procelowy	PB180327	Do bezpośredniej lizy i zachowania PBMC, czyli późniejszego całkowitego RNA
Triple Isolation Reagent	Adsin	ads60154	Do bezpośredniej lizy i zachowania PBMC, czyli późniejszego całkowitego RNA