Wpływ na jakość RNA PBMC przy różnych czasach kriokonserwacji i metodach przetwarzania u pacjentów z zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuc

Podsumowanie

Badanie to porównuje odczynnik potrójnej izolacji (TRIzol) oraz klasyczny roztwór (FBS + DMSO) dla PBMC pacjentów z kriogeniochronem NSCLC. TRIzol utrzymuje satysfakcjonującą integralność RNA do 6 miesięcy, co czyni go zalecanym do wysokiej jakości zachowania RNA.

Streszczenie

Kriokonserwowane komórki monojądrowe krwi obwodowej (PBMC) są szeroko stosowane w sekwencjonowaniu RNA (RNA-seq), a jakość ich RNA bezpośrednio wpływa na wyniki testów. Jednak krioprezerwacja może łatwo prowadzić do degradacji RNA w PBMC, a kwestia poprawy jakości RNA podczas długoterminowej krioprezerwacji pozostaje nierozwiązana. PBMC z świeżych próbek krwi pobranych od pacjentów z zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuc (NSCLC) zostały wykorzystane jako kontrola. Skuteczność zachowania RNA próbek PBMC porównano pomiędzy klasycznym roztworem kriokonserwacji komórek (90% surowicy płodowej bydła [FBS] + 10% dimetylosulfoksydu [DMSO]) a powszechnym odczynnikiem ekstrakcyjnym RNA (TRIzol) w temperaturze -80 °C przez 1, 3 i 6 miesięcy. Stężenie, czystość i integralność RNA (mierzone przez liczbę integralności RNA [RIN]) oceniono za pomocą wielopróbkowego mikrowoluminowego spektrofotometru UV-Vis oraz zautomatyzowanego mikrofluidycznego elektroforetycznego bioanalizatora, aby zapewnić teoretyczne podstawy do zachowania wysokiej jakości próbek RNA. Badanie wykazało, że stężenie, czystość i integralność RNA w PBMC maleją wraz z wydłużeniem czasu kriokonserwacji. Chociaż obie metody przetwarzania nie miały wpływu na stężenie RNA, wpływały na czystość i integralność RNA. Integralność RNA PBMC kriokonserwowanych z TRIzol przez 6 miesięcy pozostała zadowalająca. Nasze wyniki wskazują, że TRIzol przyczynia się do skutecznej krioprezerwacji i utrzymuje wysokiej jakości RNA.

Wprowadzenie

RNA-seq PBMC u pacjentów z NSCLC odgrywa kluczową rolę w ocenie skuteczności immunoterapii. Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) jest powszechnym złośliwym guzem na całym świecie, a około 70% pacjentów diagnozuje się w zaawansowanym stadium z niską rokownictwem ^1,2. Immunoterapia zrewolucjonizowała paradygmat leczenia NSCLC, oferując innowacyjne strategie terapeutyczne ^3,4. W leczeniu inhibitorów punktów kontrolnych odporności (ICI), sekwencjonowanie RNA (RNA-seq) komórek monojądrowych krwi obwodowej (PBMC) uzyskanych od pacjentów z NSCLC może monitoro....

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem próbek tkanek ludzkich i klinicznych w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Komitet Etyki Szpitala Onkologicznego w Jilin (Zatwierdzenie etyczne nr 202507-002-01). Przed pobraniem próbki uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich uczestników lub ich prawnych opiekunów. Pobrano próbki krwi obwodowej (10 mL na pacjenta) od 19 pacjentów z zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuc (NSCLC) w Jilin Cancer Hospital, co dało łącznie 133 próbki RNA. Aby zapewnić bezpieczeństwo laboratoryjne, wszystkie operacje związane z chemikaliami niebezpiecznymi były wykonywane w szafie bezpieczeńs....

Wyniki

Wpływ różnych czasów krio-konserwacji i metod przetwarzania na stężenie RNA w próbkach PBMC
Wpływ różnych czasów krio-konserwacji: jako grupę kontrolną wykorzystano świeże próbki PBMC pobrane od pacjentów z zaawansowanym NSCLC. Próbki traktowano albo TRIzol-em, albo mieszaniną 90% FBS + 10% DMSO i przechowywano w temperaturze -80 °C przez 1, 3 i 6 miesięcy; następnie wyizolowano całkowite RNA w celu pomiaru jego stężenia. W przypadku próbek traktowanych TRIzol-em stężenia RNA w czterech grupach wynos.......

Dyskusja

Na jakość RNA w próbkach biologicznych wpływa wiele czynników, w tym zmienne przedanalityczne, warunki transportu, czas przetwarzania w temperaturze otoczenia, martwica tkanek, temperatura i produkty zamrażania, wielkość i liczba aliquotów oraz czas przechowywania, co istotnie wpływa na jakość RNA²¹. W przypadku identycznych próbek różnice w czasie kriokonserwacji i metodach przetwarzania mogą znacząco wpływać na jakość RNA. Wcześniejsze badania podkreślały kluczowe znaczenie integralności RNA, po.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939B	Wykrywanie integralności RNA, ocena jakości RNA poprzez generowanie Numeru Integralności RNA (RIN)
Agilent RNA 6000 Nanokit	Agilent	5067-1511	W połączeniu z bioanalizatorem Agilent 2100, dostarczając dedykowane odczynniki i chipy zapewniające integralność RNA
Wirówka	Eppendorf	5424R	Do ekstrakcji RNA
Wirówka	Eppendorf	5810R	Do ekstrakcji PBMC
Chloroform	Chińska Narodowa Korporacja Grupy Farmaceutycznej	20191031	Do ekstrakcji RNA metodą Trizol, używaną do oddzielania fazy wodnej zawierającej RNA od fazy organicznej zawierającej zanieczyszczenia
Dimetylsulfoksyd	Beijing Dingguo Changsheng	DH105-2	Jako rozwiązanie kriokonserwacji PBMC, umożliwiające długotrwałe przechowywanie próbek w temperaturze -80 i stopni; C
Rurka	Corning	MCT-150-C	Do przechowywania próbek, mieszania odczynników, wirowania i innych operacji eksperymentalnych
Etanol	Shandong Lierkang	25071901A	Ekstrakcja IIn RNA metodą Trizol, używana do płukania wytrąceń RNA w celu usunięcia resztek
Surowica bydła płodowa	Xpbiomed	C04001-500	Jako rozwiązanie kriopkonserwacyjne dla PBMC, umożliwiające długotrwałe przechowywanie
Roztwór separacji Ficoll	Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology CO., LTD	CC0161	Do izolacji i oczyszczania PBMC za pomocą wirowania gradientu gęstości
GeneTouch(Plus) Cykler termiczny	Bioer	TC-EA-48DA	Do termicznej denaturacji RNA (70 stopni i g; C przez 2 minuty), po czym następuje wykrywanie za pomocą bioanalizatora
Izopropanol	Chińska Narodowa Korporacja Grupy Farmaceutycznej	20210929	W ekstrakcji RNA metodą Trizol, stosowaną do wytrącania RNA
Spektrofotometr Nanodrop 8000	GeneCompany	ND-8000	Dla stężenia RNA (na podstawie absorpcji przy 260 nm) i czystości (na podstawie stosunku A260/A280) przy użyciu metody absorpcji ultrafioletowej
Lampy PCR	Corning	PCR-02-C	Do termicznej denaturacji RNA (70 stopni i g; C przez 2 minuty), po czym następuje wykrywanie za pomocą bioanalizatora
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym	Układ procelowy	PB180327	Do bezpośredniej lizy i zachowania PBMC, czyli późniejszego całkowitego RNA
Triple Isolation Reagent	Adsin	ads60154	Do bezpośredniej lizy i zachowania PBMC, czyli późniejszego całkowitego RNA