Wpływ przewlekłej niewydolności nerek w połączeniu z migotaniem przedsionków na funkcję śródbłonka lewego przedsionka w modelu na beglu

Podsumowanie

To badanie ustanowiło nowy in vivo model beagle przewlekłego umiarkowanego niedokrwienia nerek w połączeniu z migotaniem przedsionków poprzez przezskórne zatorowe embolizację tętnicy nerkowej i szybkie stymulowanie przedsionków, i wykazało, że ta kombinacja poważnie upośledziła funkcję śródbłonka lewego przedsionka, zwiększyła aktywność prokoagulacyjną i podniosła ryzyko zakrzepicy poprzez ścieżki zapalne i pośredniczone przez układ renina-angiotensyna-aldosteron.

Streszczenie

Współwystępowanie migotania przedsionków (AF) i niewydolności nerek (RI) reprezentuje klinicznie złożone zjawisko o wysokiej częstości występowania. Niniejsze badanie zbadał wpływ przewlekłej umiarkowanej RI w połączeniu z AF na funkcję endotelialną lewego przedsionka u szklistookich. Przewlekła RI została wywołana przez embolizację przezcewkową głównej gałęzi lewej tętnicy nerkowej za pomocą granulek gąbki żelatynowej, a zwierzęta utrzymywano przez 3 miesiące, aby pozwolić na rozwój przewlekłych uszkodzeń miąższu nerki. AF zostało następnie wywołane przez ciągłą szybką stymulację przedsionków (podstawowa długość cyklu, 60 ms; napięcie, 4 razy wyższe niż próg stymulacji rozkurczowej; 180 min). Zmiany histologiczne oceniono za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną. Parametry związane z funkcją endotelialną, koagulacją, fibrynolizą, stanem zapalnym i aktywnością układu renina-angiotensyna-aldosteron (RAAS) w osoczu i tkankach serca badano za pomocą immunoenzymatycznego testu oznaczania białka, ilościowej rzeczywistej czasowej reakcji łańcuchowej polimerazy oraz western blottingu. Wyniki wykazały pomyślne utworzenie modelu przewlekłego uszkodzenia nerek z umiarkowaną RI, potwierdzone znacznie podwyższonym poziomem kreatyniny, azotu mocznikowego i zmniejszonym wydalaniem kreatyniny. Funkcja endotelialna lewego przedsionka była znacznie upośledzona u szklistookich z łączną RI i AF, co prowadziło do zwiększenia efektów prokoagulacyjnych i zmniejszenia fibrynolizy. Markery zapalne były podwyższone po zabiegu RI lub indukcji AF i były dalsze zwiększone w grupie z łączną RI+AF. Ponadto, aktywność RAAS, co wykazało zwiększone poziomy reniny i aldosteron, była podwyższona po RI i dalsze zwiększona w połączeniu z AF. Podsumowując, niniejsze badanie pomyślnie stworzyło in vivo model zwierzęcy przewlekłej umiarkowanej RI w połączeniu z AF u szklistookich, wykazując, że ta kombinacja znacząco zakłóciła funkcję endotelialną lewego przedsionka i zwiększyła ryzyko zakrzepowe.

Wprowadzenie

Fibrylacja przedsionków (AF), najczęstsza postać utrzymującej się arytmii serca, jest ściśle związana z niekorzystnymi wynikami klinicznymi. Ze względu na ogólnoustrojowe charakterystyki patofizjologiczne AF, ta arytmia często angażuje się w złożoną patofizjologiczną interakcję z szeregiem współistniejących schorzeń towarzyszących, w tym upośledzeniem funkcji poznawczych, depresją i zatorami ogólnoustrojowymi¹. Przewlekła choroba nerek (CKD) została zidentyfikowana jako niezależny czynnik ryzyka zarówno rozwoju AF, jak i występowania zdarzeń zatorowych. Około 15% do 20% pacjentów z rozpoznaną CKD ma AF, podczas gdy odsetek pacjentów otrzymujących terapię zastępczą nerek, którzy rozwijają AF, waha się od 15% do 40%². Tymczasem około 30% do 60% pacjentów z rozpoznaną AF wykazuje jednocześnie łagodne do umiarkowanego upośledzenie czynności nerek (RI)³. Dlatego współwystępowanie AF i RI stało się złożonym zjawiskiem klinicznym o wysokiej częstości występowania w populacjach pacjentów. Dwukierunkowa relacja między AF i RI znacznie zwiększa ryzyko wystąpienia AF, a także pogarsza postęp upośledzenia czynności nerek, co ostatecznie prowadzi do gorszych wyników klinicznych⁴.

W poprzednich badaniach szczury były często używane do stworzenia modeli RI; jednakże, ich mała wielkość serca sprawia, że nie nadają się do eksperymentów z elektrofizjologią serca. Psy, natomiast, są często używane w średnich i dużych modelach zwierzęcych niewydolności nerek, przy czym nefrektomia jest główną metodą modelowania⁵. Niemniej jednak, to podejście jest związane z ograniczonym sukcesem modelowania. Co więcej, ponieważ nefrektomia nie wywołuje bezpośrednio uszkodzenia miąższu nerkowego, nie jest w stanie skutecznie symulować procesów patologicznych niewydolności nerek. Dlatego też, stworzenie odpowiedniego modelu zwierzęcego z RI i AF jest niezbędne. Należy zauważyć, że Liang Z i wsp. z powodzeniem stworzyli lekki model RI u beagli przez zator małych gałęzi tętnicy nerkowej w lewej nerce przez dwa tygodnie za pomocą granulek gąbki żelatynowej, co było związane z AF⁶; jednakże, dwutygodniowy okres obserwacji jest ogólnie uważany za niewystarczający do symulacji przewlekłej CKD, ponieważ charakterystyczne cechy przewlekłej nefropatii, w tym stwardnienie kłębuszkowe i fibroza tubulointerstycjalna, wymagają dłuższego okresu utrzymywanego uszkodzenia miąższu nerkowego, aby w pełni rozwinąć się w modelach zwierzęcych^7,8. Podkreśla to potrzebę stworzenia przewlekłego modelu z dłuższym okresem obserwacji, który bardziej wiernie odzwierciedla progresywny charakter przewlekłej CKD.

Niniejsze badanie dążyło zatem do stworzenia zwierzęcego modelu przewlekłego umiarkowanego RI w połączeniu z AF poprzez przeprowadzenie przezcewkowej embolizacji głównego pnia lewej tętnicy nerkowej u beagli i utrzymanie zwierząt przez 3 miesiące, aby umożliwić rozwój ustalonej przewlekłej patologii nerek. Ponadto, zbadaliśmy patogenezę dysfunkcji śródbłonka lewego przedsionka w tych warunkach patologicznych, testując hipotezę, że połączenie przewlekłego umiarkowanego RI i AF synergistycznie upośledzi funkcję śródbłonka lewego przedsionka poprzez zwiększoną inflamację i aktywację układu renina-angiotensyna-aldosteron, tym samym zwiększając ryzyko zakrzepicy poza każdą z tych warunków osobno. Te odkrycia mogą dostarczyć dalszego zrozumienia przewlekłego RI w połączeniu z AF i położyć podstawę dla dalszych badań nad zaletami terapii przeciwzakrzepowej u pacjentów z AF i RI.

Protokół

Niniejsze badanie przeprowadzono ściśle zgodnie z zaleceniami zawartych w "Przewodniku po opiece nad zwierzętami laboratoryjnymi" Narodowych Instytutów Zdrowia (Numer publikacji 85-23, zrewidowane 1996). Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Wykorzystania w Szpitalu Anzhen w Pekinie (Numer zgody 81700293). Protokół badania został przejrzany i zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Wykorzystania w naszej instytucji. Wszystko zostało zrobione, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zmniejszyć liczbę użytych zwierząt w badaniu. Reaktanty i sprzęt użyty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Model zwierzęcy i projekt eksperymentu

1. Przygotowanie zwierząt i ich zakwaterowanie
   Dwadzieścia cztery zdrowe samce beagli, w wieku 4–5 lat i o wadze 10–12 kg, zostały uzyskane od Spółki Akcyjnej Shanghai Jiao Tong University Agricultural Experimental Animal Farm Co., Ltd. (patrz Tabela Materiałów). Tylko samce beagli zostały użyte, aby zminimalizować potencjalne skutki zakłócające związane z fluktuacjami hormonalnymi związanymi z cyklem estrusowym na krzepnięcie, funkcję śródbłonka i reakcje zapalne. Wszystkie beagli były zakwaterowane indywidualnie w standardowych klatkach, utrzymywanych w temperaturze 22–25 °C z wilgotnością 40–60% i 12-godzinnym cyklem światło-ciemność. Zwierzęta były karmione standardową laboratoryjną dietą dla psów i wodą ad libitum. Przed rozpoczęciem procedur eksperymentu wszystkie beagli przeszły 1-tygodniowy okres aklimatyzacji. Przetorakowe echokardiogramy (TTE) zostały wykonane na wszystkich zwierzętach za pomocą systemu ultrasonograficznego wyposażonego w przetwornik fazowy 3,5 MHz, aby wykluczyć patologie zastawek, kardiomiopatię i inne strukturalne choroby serca.
2. Znieczulenie i dostęp naczyniowy
   Wszystkie beagli były postowane przez 12 godzin przed zabiegiem. Znieczulenie zostało wprowadzone poprzez dożylne podanie pentobarbitalu sodowego w dawce 20 mg/kg przez żyłę łokciową, wprowadzane powoli przez około 3–5 min, aż do potwierdzenia utraty odruchu powiekowego. Po osiągnięciu odpowiedniego znieczulenia, wykonano intubację oskrzelową za pomocą odpowiednio dobranego (średnica wewnętrzna 7,0–8,0 mm) mankietu rurki endotrachealnej i rozpoczęto wentylację mechaniczną o objętości pociągowej 15 mL/kg i częstości oddechów 12–15 oddechów/min. Ciągłe monitorowanie hemodynamiczne było utrzymywane przez cały zabieg. Założono 3-przewodowe powierzchniowe elektrokardiogram (EKG) do monitorowania częstości akcji serca i rytmu serca, a pulsoksymetria była używana do monitorowania nasycenia tlenem. Podtrzymiwano zewnętrzną żyłę obwodową do podawania płynów (roztwór Ringera z jeziorka, wlewane w tempie 5–10 mL/kg/h) i uzupełniających dawek znieczulających, jeśli było to konieczne.
   Następnie, pod warunkami aseptycznymi, wykonano nacięcie skóry o długości około 3–4 cm w prawej okolicy pachwinowej, aby eksponować wspólną tętnicę udową za pomocą stępienia. Pomyślne dotarcie do tętnicy zostało potwierdzone przez pulsujący powrót krwi. Przez tętnicę udową wprowadzono 6F osłonę naczyniową za pomocą zmodyfikowanej techniki Seldingera. Heparyna sodowa (4000 IU, rozcieńczona w 10 mL fizjologicznego roztworu soli) została podana przez osłonę, aby zapobiec zatorom zakrzepowym.

2. Embalizacja tętnicy nerkowej w celu indukcji przewlekłej umiarkowanej RI

5F wielofunkcyjny cewnik został wprowadzony przez osłonę tętniczą i zaawansowany pod promieniami X z wykorzystaniem fluoroskopii podczas iniekcji kontrastowo-jonowej środka niejonowego w tętnicę brzuszną. Przeprowadzono selektywne nakłucie lewej tętnicy nerkowej i wykonano podstawową angiografię tętnicy nerkowej poprzez wstrzyknięcie 5–8 mL niejonowego kontrastowo-jonowego środka w tempie 3 mL/s, aby wizualizować pełne drzewo tętnic nerkowych. Pomyślne umieszczenie cewnika zostało zweryfikowane poprzez demonstrację całej lewej tętnicy nerkowej i jej gałęzi na obrazach angiograficznych.

Następnie, RI zostało wywołane poprzez embolizację przezcewnikową głównej gałęzi lewej tętnicy nerkowej za pomocą granulek absorbowalnego żelatynowego gąbczastego środka (średnica 50 mg). Granulki żelatynowe zostały przygotowane jako zawiesina poprzez zmieszanie około 50 mg granulek z mieszaniną kontrastowo-jonowego środka i fizjologicznego roztworu soli w proporcji 1:1 do objętości całkowitej około 2–3 mL. Zawiesinę embolizacyjną wstrzykiwano powoli poprzez ręczne wstrzyknięcie przez cewnik przez około 2–3 min pod ciągłym nadzorem fluoroskopowym. Pomyślną embolizację potwierdzono poprzez ponowną angiografię lewej tętnicy nerkowej, która wykazała brak dalszego kontrastowania tętnic w zaembolizowanej

Wyniki

Model zwierzęcy przewlekłego, umiarkowanego NI i AF

Schematyczny przegląd projektu eksperymentalnego i harmonogramu przedstawiono na Rysunku 1. Reprezentatywne obrazy angiografii lewej tętnicy nerkowej przed i po embolizacji przezcewkowej, przedstawione na Rysunku 2A,B wykazały, że małe gałęzie tętnicy nerkowej zostały pomyślnie zablokowane po embolizacji przezcewkowej, co wykazano brakiem oświetlenia...

Dyskusja

Niniejsze badanie ustanowiło in vivo model zwierzęcy umiarkowanego RI połączonego z AF i zbadano patogenezę dysfunkcji endotelialnej lewego przedsionka w tych warunkach patologicznych. Główne wyniki tego badania są następujące: po pierwsze, zakrzepica głównej lewej tętnicy nerkowej przez 3 miesiące u beagles z powodzeniem wywołała umiarkowany RI. Po drugie, model AF został skutecznie ustanowiony u beagles. Po trzecie, funkcja endotelialna lewego przedsionka była znacznie upośledzona u zwierząt z zarówno RI, jak ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6-0 Polypropylene suture	Ethicon (Johnson & Johnson)	8706H	Do naprawy tętnicy udowowej
5F Multipurpose catheter	Cordis (Cardinal Health)	521-550S	Do kanulacji i embolizacji tętnicy nerkowej
6F Quadripolar electrode catheter	St. Jude Medical	401443	Do stymulacji przedsionka praworakawego
6F Vascular introducer sheath	Terumo	RS*A60K10SQ	Do dostępu do tętnicy udowowej
ABI 7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific)	4351105	Do cyklizacji termicznej qRT-PCR i wykrywania fluorescencji
Absorbable gelatin sponge granules (50 mg diameter)	Jinling Pharmaceutical	—	Do przezcewnowej embolizacji tętnic nerkowych; przygotowywane jako suspensja z środkiem kontrastowym i solą fizjologiczną (1:1)
ADMA ELISA Kit (canine)	Cusabio	CSB-E09297c	Do pomiaru asymetrycznej dimetylarginin w osoczu
Aldosterone ELISA Kit (canine)	Cusabio	CSB-E08014c	Do pomiaru aldosteron w osoczu
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225	Do określania stężenia białka
Beagles (male, 4–5 years, 10–12 kg)	Shanghai Jiao Tong University Agricultural Experimental Animal Farm Co., Ltd.	—	Zdrowe samce beaglei; przetrzymywane indywidualnie w standardowych warunkach
C-arm Fluoroscopy System	GE Healthcare	OEC 9900 Elite	Do wykonania fluoroskopowo kierowanej cewnikowania i angiografii
Chemiluminescence Imaging System	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Do wizualizacji pasm Western blot
Creatinine ELISA Kit (canine)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C011-2-1	Do pomiaru kreatyniny w osoczu
Cuffed endotracheal tube (ID 7.0–8.0 mm)	Covidien (Medtronic)	86449	Do intubacji oskrzeliowej i wentylacji mechanicznej
DF-5A Cardiac Stimulator	Suzhou Dongfang Electronic Technology Research Institute	DF-5A	Do przyspieszonego stymulacji przedsionków; ustawienia: BCL 60 ms, szerokość impulsu 2 ms, napięcie 4× próg
ECL Western Blotting Substrate	Thermo Fisher Scientific	32106	Podwyższona chemiluminescencja zestaw do wizualizacji blot
EDTA Anticoagulant Tubes	BD Vacutainer	367835	Do pobierania krwi (oddzielanie osocza)
eNOS Primary Antibody (rabbit)	Cell Signaling Technology	32027	Rozcieńczenie 1:1000; do Western blotting (~130 kDa)
Eosin Y Solution (aqueous)	Solarbio	G1100	Do kontrastowania H&E (2 min)
Foley Urinary Catheter (8 Fr)	C.R. Bard	0165SI08	Do czasowego pobierania moczu podczas oznaczania CCr
GAPDH Primary Antibody (rabbit)	Cell Signaling Technology	5174	Rozcieńczenie 1:1000; kontrola wewnętrzna do Western blotting (~36 kDa)
GraphPad Prism (version 8.0)	GraphPad Software	—	https://www.graphpad.com; do analizy statystycznej (jednokierunkowa ANOVA, test Dunnetta)
Hematoxylin Solution (Harris)	Solarbio	G1140	Do nuklearnego barwienia H&E (5 min)
Heparin Sodium Injection (unfractionated)	Changzhou Qianhong Biopharma	H32022088	4000 IU rozcieńczona w 10 mL izotonicznego roztworu soli; do antykoagulacji podczas cewnikowania
HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	7076	Rozcieńczenie 1:5000; do Western blotting
HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	7074	Rozcieńczenie 1:5000; do Western blotting
hs-CRP ELISA Kit (canine)	Cusabio	CSB-E08557c	Do pomiaru wysokiej czułości C-reaktywnego białka w osoczu
IL-6 ELISA Kit (canine)	R&D Systems	CA6000	Do pomiaru interleukiny-6 w osoczu
ImageJ Software (version 1.53)	National Institutes of Health	—	https://imagej.nih.gov/ij/; do densytomicznej analizy Western blot
iNOS Primary Antibody (rabbit)	Abcam	ab178945	Rozcieńczenie 1:1000; do Western blotting (~130 kDa)
Lactated Ringer's Solution	Baxter	2B2324	Płyn do infuzji dożylnych; podawany w ilości 5–10 mL/kg/h podczas zabiegów
Light Microscope	Olympus	BX53	Do histologicznego badania tkanek nerki po barwieniu HE
Mechanical Ventilator (veterinary)	Midmark	Matrx Model 3000	Objętość oddechowa 15 mL/kg; częstotliwość oddechów 12–15 oddechów/min
Microplate Reader	BioTek	Synergy HTX	Do pomiaru absorbancji w ELISA na długości fali 450 nm
Neutral Buffered Paraformaldehyde (10%)	Solarbio	P1110	Do fiksacji tkanek nerki (24 h)
NO ELISA Kit (canine)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A012-1-2	Do pomiaru tlenku azotu w osoczu
Non-ionic Iodinated Contrast Medium (Iohexol)	GE Healthcare	Omnipaque 350	5–8 mL na wstrzyknięcie z szybkością 3 mL/s do angiografii tętnic nerkowych
PAI-1 ELISA Kit (canine)	Cusabio	CSB-E13043c	Do pomiaru inhibitora aktywatora plasminogenu w osoczu
PAI-1 Primary Antibody (rabbit)	Abcam	ab66705	Rozcieńczenie 1:1000; do Western blotting (~45 kDa)
Paraffin Wax	Leica Biosystems