Badania wykazały podwyższone poziomy HMGA1 oraz obniżoną ekspresję HAND1 w raku krtani, co wskazuje na odwrotną zależność oraz istotne powiązania z przerzutami a stadium klinicznym, sugerując, że oba czynniki przyczyniają się do postępu guza.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Badania wykazały podwyższone poziomy HMGA1 oraz obniżoną ekspresję HAND1 w raku krtani, co wskazuje na odwrotną zależność oraz istotne powiązania z przerzutami a stadium klinicznym, sugerując, że oba czynniki przyczyniają się do postępu guza.
Badanie to badało profile ekspresji genów HMGA1 i HAND1 w raku krtaniowym płaskonabłonkowym (LSCC) oraz w sąsiednich prawidłowych tkankach śluzowych krtani, stosując metody immunohistochemii i RT-PCR. Celem było zbadanie ich możliwych ról w inicjacji, rozwoju, inwazji i przerzutach LSCC. Zarówno HMGA1, jak i HAND1 wykryto w tkankach nowotworowych i przylegających w zdrowości. Niemniej jednak HMGA1 wykazał istotnie podwyższoną ekspresję w tkankach LSCC, podczas gdy HAND1 wykazał znacznie niższy poziom ekspresji. Podwyższona ekspresja HMGA1 była pozytywnie powiązana z przerzutami do węzłów chłonnych (100,0% vs. 50,0%) oraz zaawansowanym stadium klinicznym (91,7% vs. 44,4%), ale nie była powiązana z histologią guza, typem klinicznym ani wiekiem pacjenta. Dla porównania, obniżona ekspresja białka HAND1 była powiązana z przerzutami do węzłów chłonnych, stadium klinicznym i stopieniem patologicznym, co sugeruje rolę w postępie i przerzutach nowotworów. Ponadto zaobserwowano liniową korelację ujemną między ekspresjami HMGA1 i HAND1, co sugeruje potencjalną interakcję regulacyjną, w której HMGA1 może hamować ekspresję HAND1. Wyniki te sugerują, że HMGA1 i HAND1 pełnią funkcje komplementarne w patogenezie LSCC, przy czym HMGA1 potencjalnie ułatwia rozwój guza, a HAND1 pełni funkcję supresora. Interakcja między tymi dwoma genami może zaoferować nowe spojrzenie na mechanizmy molekularne napędzające progresję LSCC i przerzuty.
Rak krtani jest drugim co do częstym pierwotnym złośliwym guzem głowy i szyi, zaraz po raku nosowogardła, odpowiadającym za 26%–30% wszystkich guzów głowy i szyi na świecie1. Ponad 90% nowotworów krtani klasyfikowanych jest jako rak krtaniowy płaskokomórkowy (LSCC)2. Główne metody leczenia raka krtani to chirurgia i radioterapia. Miejscowe nawroty i przerzuty do węzłów chłonnych są głównymi przyczynami zgonów u pacjentów z rakiem krtani. Dlatego skuteczne zarządzanie nawrotami i przerzutami pozostaje poważnym wyzwaniem klinicznym. Wraz z rozwojem biologii molekularnej zidentyfikowano różne geny o nieprawidłowej ekspresji w raku krtani. Jednak mechanizmy leżące u podstaw inwazji guza i przerzutów w raku krtanii pozostają niejasne i wymagają dalszych badań.
Białka grupy A (HMGA) o wysokiej mobilności to białka wiążące chromatynę niezwiązane z histonami, znajdujące się w jądrze komórki. HMGA1 wiąże się z DNA i powiązanymi białkami, indukując zmiany strukturalne chromatyny, które regulują transkrypcję genów3. Jako regulator transkrypcji związany z chromatyną, HMGA1 moduluje ekspresję wielu genów związanych z nowotworami zaangażowanych w proliferację i przerzuty. Wcześniejsze badania wykazały, że HMGA1 jest nadekspresjonowany w szerokim zakresie nowotworów ludzkich, w tym w nowotworach tarczycy, jelita grubego, trzustki oraz nowotworachgłowy i szyi 4,5,6,7, a także innych guzach nabłonka i litego opisanych w literaturze. HMGA1 reguluje nowotwory poprzez modulację ekspresji wielu genów docelowych zaangażowanych w proliferację i przerzuty8.
Geny ekspresyjne serce i grzebienia nerwowego (HAND) należą do rodziny bHLH (zasadowa helisa–pętla–helisa), w tym HAND1 i HAND2. HAND1, jako czynnik transkrypcyjny, odgrywa rolę w różnicowaniu trofoblastów i rozwoju serca9. Jednak mechanizm ekspresji HAND1 w warstwie komórek pozaembrionalnych pozostaje niejasny. Potwierdzono, że HMGA1 bezpośrednio wiąże się z promotorem HAND1, hamując aktywność HAND1 zarówno in vivo, jak i in vitro10. HAND1, jako białko represatorowe, jest powiązany z regulacją różnicowania komórek i powstawania nowotworów. Badania wykazały, że ekspresja HAND1 jest wyciszona i hipermetylowana w ludzkim raku żołądka11, raku trzustki12, raku jajnika13 oraz raka tarczycy14. Jednak według naszej wiedzy, ograniczone badania badały ekspresję HAND1 w tkankach raka krtani.
W niniejszym badaniu zastosowano immunohistochemię (dwuetapową metodę wykrywania) oraz reakcję łańcuchową polimerazy odwróconej transkrypcji (RT-PCR) do wykrywania ekspresji białek HMGA1 i HAND1 oraz mRNA w LSCC i sąsiednich prawidłowych tkankach śluzowych. Immunohistochemia umożliwia wizualizację lokalizacji białek w architekturze tkanki, natomiast RT-PCR umożliwia czułe wykrywanie ekspresji genów na poziomie transkrypcyjnym, dostarczając uzupełniających wglądów w wzorce ekspresji białek i mRNA. W porównaniu z ilościowym PCR (qPCR), które oferuje wyższą czułość i precyzyjną ilościowość, Western blotting, który umożliwia walidację na poziomie białka, ale nie ma kontekstu przestrzennego, oraz sekwencjonowaniem RNA (RNA-seq), które zapewnia kompleksowe profilowanie transkryptomiczne, ale wymaga zaawansowanej analizy obliczeniowej, połączenie immunohistochemii i RT-PCR stanowi opłacalną i klinicznie stosowalną strategię badań biomarkerów. Celem badania było zbadanie roli i korelacji tych dwóch czynników w występowaniu, rozwoju, postępie i przerzutach LSCC. Ponadto ocena ekspresji HMGA1 i HAND1 może dostarczyć biomarkerów do diagnozy i oceny prognosycznej w raku krtani, potencjalnie poprawiając stratyfikację ryzyka i wspomagając podejmowanie decyzji klinicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Badanie to zostało przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Szpitala Ludowego Shijiazhuang (Nr Zatwierdzenia YKLS 2026 nr 041; 27 marca 2026). Badanie przeprowadzono zgodnie z Przepisami dotyczącymi Etycznego Przeglądu Badań Biomedycznych z udziałem ludzi, Regulacjami dotyczącymi Etycznego Przeglądu Nauk Przyrodniczych i Badań Medycznych z udziałem ludzi, Deklaracją Helsińską oraz Międzynarodowymi Wytycznymi Etycznymi dotyczącymi badań zdrowotnych z udziałem ludzi. Próbki tkanek ludzkich pozyskano z archiwalnych próbek chirurgicznych zgodnie z wymogami etycznymi instytucji, zapewniając anonimizację i poufność danych pacjentów. Pisemna świadoma zgoda była uzyskiwana od uczestników lub komisja etyki udzielała zgody na korzystanie z anonimowych zarchiwalnych próbek, w zależności od przypadku.
Materiały eksperymentalne
Źródło okazów
Łącznie 42 przypadki tkanek LSCC oraz 25 przypadków sąsiednich prawidłowych tkanek błony śluzowej krtani pobrano z próbek chirurgicznych LSCC w Oddziale Otolaryngologii Chirurgii Głowy i Szyi w Hebei w okresie od lutego 2011 do sierpnia 2012 roku. Wśród nich 25 przypadków sąsiedniej prawidłowej błony śluzowej (pobranej z miejsca > 1,0 cm od krawędzi nowotworu) patologicznie potwierdzono jako zapalna lub prawidłowa błona śluzowa. Wszystkie 42 okazy LSCC zostały patologicznie potwierdzone jako rak płaskonabłonkowy. Wszystkie tkanki przechowywano w temperaturze -80 °C. Spośród 42 pacjentów byli mężczyźni, bez pacjentek kobiet. Wśród przypadków LSCC 15 było dobrze zróżnicowanych, 18 umiarkowanie zróżnicowanych, a 9 słabo zróżnicowanych. Osiemnaście przypadków miało przerzuty do węzłów chłonnych, podczas gdy 24 nie miały. Kliniczne stadowanie opierało się na systemie klasyfikacji i stadowania TNM (UICC, 2002), z 20 przypadkami w etapach I i II oraz 22 przypadkami w etapach III i IV. Było 30 przypadków typu supraglotowego, 11 przypadków typu glotatycznego oraz 1 przypadek typu podglotycznego. Przedział wieku pacjentów wynosił 40–75 lat, a mediana wieku wynosiła 60 lat. Żaden z pacjentów nie otrzymał radioterapii ani chemioterapii przed operacją, a dane kliniczne były kompletne.
Metody eksperymentalne i kroki
Procedura barwienia HE
Przygotowanie szkiełka i barwienie hematoksylinowo-eozynowe
Szkiełka do immunohistochemii najpierw moczono w skoncentrowanym kwasie przez 24 godziny, następnie dokładnie myto pod bieżącą wodą przez co najmniej 10 minut, aby usunąć resztki kwasu, a następnie zanurzano w wodzie destylowanej przez 30 minut dwukrotnie z delikatnym mieszaniem, aby zapewnić pełne płukanie. Po moczeniu w etanolu 95% przez 2 godziny, preparaty suszono w piekarniku o temperaturze 60 °C, a następnie zanurzano w mieszance APES: aceton (1:49, v/v) przez 1 minutę, delikatnie potrząsając dla uzyskania jednolitej powłoki, a następnie płukano czystym acetonem. Na koniec suszono je na powietrzu w temperaturze pokojowej (20–25 °C), aby zapewnić prawidłową przyczepność tkanek podczas kolejnych procedur barwienia.
Fragmenty tkanek osadzonych w parafinie były sekwencyjnie zanurzane w ksylenie I i ksylene II przez 10 minut każda, aby usunąć parafinę, następnie nawadniano je przez etanol oklasyfikowany (100%, 95%, 80%) przez 5–10 minut każda, a następnie płukano w wodzie destylowanej przez 2 minuty. Następnie przekroje poddawano barwieniu hematoksylinowo-eozynowym (HE) w następujący sposób: barwienie hematoksyliną przez 4 minuty, płukanie pod bieżącą wodą z kranu przez 3 minuty z ciągłym przepływem w celu usunięcia nadmiaru barwników, różnicowanie z użyciem 1% kwasu solnego w etanolu przez 30 sekund, trzykrotne mycie wodą z kranu w celu zakończenia różnicowania oraz barwienie eozyną przez 10 sekund. Rutynowe stopniowe odwodnienie przeprowadzano kolejno, kolejno stosując 70% etanolu, 80% etanolu, 95% etanolu, bezwodnego etanolu I oraz bezwodnego etanolu II przez 5 minut każdy. Po wyschnięciu zamek montowano za pomocą neutralnego balsamu.
Procedura immunohistochemii
Fragmenty parafiny o grubości 4 μm były cięte, układane płasko na szkiełkach powlekanych APES i umieszczane na noc w piecu 67 °C, po czym nastąpiła deparafinizacja ksylenem I i II przez 10 minut każda. Stopniowe odwodnienie przeprowadzono przy użyciu alkoholu w 100%, 90% i 70% przez 5 minut każdy, po czym myto wodą z kranu i wodą destylowaną przez 3 minuty. Aby zablokować aktywność endogennej nadoksydazy, preparaty inkubowano świeżo przygotowanym roztworem 3% metanolu i nadtlenku wodoru, zapewniając pełne pokrycie przekroju tkanki w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez 20 minut, po czym nastąpiły trzy płukania wodą destylowaną przez 5 minut w 0,01 M PBS.
Pobieranie antygenów przeprowadzano poprzez zanurzanie szkiełek w buforze cytrynianowym (pH 6,0) i podgrzewanie w szybkowarze w temperaturze ~95–100 °C przez 8 minut dla HMGA1 i 10 minut dla HAND1, z pokrywkami szczelnie zamkniętymi w celu utrzymania stałego ciśnienia. Następnie sekcje schładzano w temperaturze pokojowej (20–25 °C) i myto trzykrotnie w temperaturze 0,01 M PBS przez 3 minuty każda, delikatnie mieszając. Przeciwciała pierwotne przeciwko HMGA1 i HAND1 rozcieńczono w rozcieńczalniku przeciwciał (odpowiednio 1:150 i 1:100) i delikatnie mieszamy pipetowaniem, a następnie równomiernie nałożono, aby całkowicie pokryć każdy fragment tkanki. Preparaty były inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C w nawilżonej komorze. Po inkubacji przez noc szkiełka zostały wyjęte z nawilżonej komory i pozostawione do temperatury pokojowej przez 10 minut. Preparaty były myte trzykrotnie 0,01 M PBS (5 minut na płukanie) pod delikatnym mieszaniem, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Usunięto nadmiar płynu, a dodano przeciwciało wtórne (polimerowy anty-królik/mysz znakowany HRP), aby całkowicie pokryć powierzchnie tkanek. Kolejna inkubacja przeprowadzono w temperaturze 37 °C przez 35 minut.
Roztwór podłoża DAB nakładano kropelo po kroplach, aby pokryć tkankę, a rozwój koloru monitorowano pod mikroskopem przez 1–3 minuty, aż pojawiły się brązowe przebarwienia, które natychmiast zatrzymano przez płukanie wodą destylowaną po osiągnięciu optymalnej intensywności barwienia. Wykonano ponowne barwienie hematoksyliny, różnicowanie alkoholu kwasem solnym oraz roztwór amoniaku w celu odwrócenia niebieskiego koloru. Następnie przeprowadzono rutynowe odwodnienie alkoholu stopniowane, przezroczystość ksylenowej oraz montaż z neutralnym balsamem do obserwacji pod mikroskopem. PBS był stosowany jako kontrola bez ognia zamiast przeciwciała głównego. Ponadto jako pozytywne kontrole, aby zapewnić jakość i spójność barwienia z przekrojem tkanki płaskokątnego głowy i szyi z HMGA1 dodatnimi wycinkami oraz tkanki łożyskowej z HAND1, wykorzystano wcześniej potwierdzone z pozytywnym wynikiem HMGA1.
Ustalanie wyniku
Chromogenem użytym w tym eksperymencie jest system DAB-H2O2. Po ponownym barwieniu hematoksylinowym pozytywne barwienia HMGA1 i HAND1 obserwuje się głównie w jądrze komórkowym, z pewnym barwieniem cytoplazmatycznym. Do oceny zidentyfikowano obszar o największej gęstości komórek pozytywnie barwionych przy niskim powiększeniu (×40). W powiększeniu ×100 wybrano pięć pól o najwyższej dodatniej gęstości komórek, a w każdym polu policono po 100 komórek. Średni procent pozytywnych komórek z pięciu pól jest wykorzystywany jako wynik dla każdego slajdu. Kryteria oceny były następujące: brak komórek barwionych (-), komórek pozytywnych < 25% (+), komórek pozytywnych 25%–50% (++) oraz komórek pozytywnych > 50% (+++), na podstawie półilościowej metody procentowej powszechnie stosowanej w analizach immunohistochemicznych. Ocena została przeprowadzona niezależnie przez dwóch wykwalifikowanych patologów w trybie podwójnie ślepym15, 16, 17. Jeśli ich opinie się różnią, powinni omówić dyskusję i dojść do wniosku18.
Metoda RT-PCR
Spłony
Zapalniki były projektowane przy użyciu oprogramowania do projektowania zapalników opartych na docelowych sekwencjach genów, z uwzględnieniem specyficzności sprężystości, kompatybilności z temperaturą topnienia oraz oczekiwanego rozmiaru produktu. Szczegółowe sekwencje rozgrzewek, rozmiary produktów oraz temperatury wyżarzania są podsumowane w Tabeli 1. Startery zostały zsyntetyzowane do stężenia 2 OD, podzielone na dwie probówki i rozcieńczone do 10 pmol/μL wodą poddawaną DEPC do przechowywania w temperaturze -20 °C. Temperaturę wyżarzania obliczono według wzoru: Tm= 2(A + T) + 4(G + C)
Obróbka materiałami i sprzętem RNazy:
Plastikowe przedmioty (np. końcówki pipet, rurki EP): Plastikowe przedmioty umieszczano w sterylnej butelce z szerokim odczynnikiem, dodawano przygotowaną wodę DEPC aż do całkowitego zanurzenia, a materiały inkubowano przez noc w okapie spalającym w temperaturze pokojowej (20–25 °C). Następnie sterylizowano je pod ciśnieniem przez 120 minut i suszono w temperaturze 65 °C.
Przedmioty szklane: Naczynia były moczone przez noc w kwasie, dokładnie płukane, suszone, owinięte folią aluminiową i pieczone w piekarniku o temperaturze 200 °C przez 6 godzin, a następnie przechowywane w czystym miejscu do przyszłego użytku.
Metalowe przedmioty (np. nożyczki, pęseta): Metalowe przedmioty były czyszczone, pieczone w piekarniku o temperaturze 200 °C przez 6 godzin i przechowywane w czystym miejscu do przyszłego użytku.
Przygotowanie roztworów
Roztwór DEPC 0,1% (v/v): 1 mL DEPC dodano do 1000 mL wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1% (v/v), dobrze wstrząśnięto, inkubowano w 4 °C przez noc, sterylizowano przez autoclaw i przechowywano w 4 °C.
Roztwór etanolu 75% (v/v): 75 mL etanolu absolutnego wymieszano z wodą poddawaną DEPC 25 mL w celu uzyskania końcowego stężenia 75% (v/v) i przechowywano w temperaturze 4 °C.
Całkowite wyodrębnienie RNA z tkanek
Po ekstrakcji RNA oceniano integralność RNA przed transkrypcją odwrotną i analizą dalszą. 80 mg tkanki zważono za pomocą wagi elektronicznej, pocięto na małe kawałki i umieszczono w wcześniej obrobionym homogenizatorze szkła. Dodano 1 ml wstępnie schłodzonego reagenta RNA w temperaturze 4 °C, a próbkę ujednolicono na lodzie poprzez powtarzane mielenie, aż uzyskano jednolity lizat bez widocznych fragmentów tkanek, co zapobiegało powstawaniu pęcherzyków. Mieszanina ujednolicona została przeniesiona do 1,5 mL wolnej od RNazy rurki EP i inkubowana na lodzie przez 5 minut. Do każdej rurki dodano chloroform, który intensywnie wirował przez 10–15 sekund, aby zapewnić pełne mieszanie fazowe, po czym nastąpiła inkubacja na lodzie przez 5 minut. Rurki wirowano w temperaturze 4 °C, 12 000 x g przez 15 minut. Po wirowaniu górna faza wodna była ostrożnie zasysana pipetą wolną od RNazy, nie naruszając warstwy międzyfazowej w nowej tubie. Dodano równą ilość izopropanolu, wymieszano przez delikatne odwrócenie rurki 8-10 razy, aż warstwy zniknęły, i inkubowano w temperaturze -20 °C przez co najmniej 10 minut. Mieszanka była odwirowana w temperaturze 4 °C, 12 000 x g przez 10 minut. Warstwa supernatantu została odrzucona, dodano 400 μL 75% etanolu lodowatego, aby zawiesić granulkę RNA. Mieszanka była ponownie wirowana w temperaturze 4 °C, 12 000 x g. przez 5 minut. Warstwa supernatantu została odrzucona, a pellet RNA lekko wysuszony. Pellet RNA rozpuszczano w wodzie wolnej od RNazy i przechowywano w temperaturze -80 °C do przyszłego użytku.
Wykrywanie integralności RNA
Do wykrywania integralności RNA wymieszano 5 μL próbki RNA z 5 μL buforu obciążeniowego błękitu bromofenolowego, a elektroforezę wykonano na żelu agarozowym o stężeniu 2%. Integralność RNA była uznawana za akceptowalną, gdy widoczne były wyraźne pasma 28S, 18S i 5S bez widocznego rozmazania.
Transkrypcja odwrotna (RT) do syntezy cDNA
6 μL RNA było wstępnie podgrzewane w temperaturze 70 °C przez 10 minut, następnie kolejno dodawano 25 mM MgCl2 (4,0 μL), dNTP (2,0 μL), AMV (0,7 μL), 10× AMV Buffer (2,0 μL), oligo(dT) (1,0 μL), RNasin (0,5 μL) oraz wodę dejonizowaną kolejno na lód, aby uzyskać końcową objętość reakcji 20 μL, następnie delikatne mieszanie i krótka wirówka. Warunki reakcji to 25 °C przez 1 minutę, 42 °C przez 60 minut, 98 °C przez 5 minut, a następnie przechowywanie w 4 °C przez czas nieokreślony. Gdy reakcja osiągnęła 4 °C, produkt był wyjmowany z maszyny PCR, używany jako szablon cDNA do kolejnej reakcji PCR i przechowywany w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.
Wzmacnianie PCR
Dla każdej reakcji PCR mieszanina zawierała szablon cDNA (1 μL), przednią zapalkę specyficzną dla HMGA1, HAND1 lub GAPDH (1 μL), odwrotną podkładkę specyficzną dla docelowego genu lub GAPDH (1 μL), mieszankę PCR główną (10 μL) oraz wodę poddaną DEPC (7 μL), co daje łączną objętość 20 μL. Dla każdego docelowego genu przygotowano oddzielne reakcje (HMGA1, HAND1) oraz genu kontroli wewnętrznej (GAPDH), przy czym każda reakcja zawiera odpowiednią dla genu parę starterów do przodu i do tyłu.
Całkowita objętość reakcji wynosiła 20 μL. Po delikatnym wymieszaniu składników reakcji i krótkim wirowaniu przez 5–10 sekund z niską prędkością, rurka została umieszczona w podgrzanej maszynie PCR i wzmocniona zgodnie z warunkami reakcji z Tabeli 2.
Potwierdzenie i analiza produktów amplifikowanych PCR
Przygotowanie żelu
Zważono 2 g agarozy i umieszczono w trójkątnej kolbie. Dodano 2 mL buforu elektroforezy TAE 50× oraz 100 mL wody destylowanej (przygotować żel agarozowy o stężeniu 2%), a następnie podgrzewano w mikrofalówce z przerywanym wirowaniem (co 15–20 sekund), aż agaroza całkowicie się rozpuściła. Po schłodzeniu do około 55 °C dodano 10 μL roztworu EB i dokładnie wymieszano. Żel następnie wlewano do czystej tacy żelowej w temperaturze pokojowej (20–25 °C), myto wodą destylowaną, a następnie wkładano grzebień, aby utworzyć doły do próbek. Grubość żelu wynosiła 0,4 cm. Tackę umieszczano na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez 30 minut, aż żel całkowicie stwardniał. Grzebień został ostrożnie usunięty.
Próbki ładowania
4 μL każdej próbki DNA dodawano do dołków żelu, a marker DNA do lewej dołki.
Elektroforeza
Załadowana pojemnik żelowy umieszczono w zbiorniku elektroforetycznym wypełnionym buforem elektroforetycznym TAE, co zapewnia, że poziom buforu pozostaje około 1 mm powyżej powierzchni żelu. Jeden koniec otworów znajdował się przy katodzie (aby umożliwić migrację DNA w kierunku anody). System elektroforezy był podłączony do zasilania i pracował z napięciem 120 V i 60 mA przez około 45 minut, aż bufor obciążający przesunął się poza linię środkową żelu, po czym zasilanie zostało wyłączone.
Obserwacja wyników i obrazowanie
Po elektroforezie żel został starannie usunięty, a wyniki obserwowano pod transiluminatorem UV i porównano z markerem DNA, aby ustalić, czy masa cząsteczkowa amplifikowanych fragmentów pojawiła się w oczekiwanych miejscach. System obrazowania żelowego został użyty do rejestrowania obrazów i zapisywania wyników na komputerze.
Ustawienia sterowania
Zamiast cDNA użyto wody destylowanej jako negatywnej kontroli.
Analiza półilościowa
Wyniki elektroforezy żelowej agarozy zostały przeanalizowane i zarejestrowane za pomocą systemu obrazowania żelowego. Do analizy jasności pasm używano oprogramowania do analizy obrazów. Zmierzono bezwzględne zintegrowane wartości OD w paśmie amplifikacji genów docelowych oraz odpowiadającym mu pasie amplifikacji genów kontroli wewnętrznej. Wyniki wyrażono jako stosunek bezwzględnej zintegrowanej wartości OD docelowego pasma do bezwzględnej całkowitej wartości OD odpowiadającego wewnętrznego pasma kontrolnego.
To znaczy, ekspresja względna = wartość OD genu docelowego / wartość OD genu wewnętrznej.
Analiza statystyczna
Wszystkie dane były organizowane w Excelu i analizowane za pomocą oprogramowania statystycznego. Zmienne ciągłe wyrażono jako średnią ± odchyleniu standardowym (SD) i porównano między dwiema grupami za pomocą testu t z niezależnymi próbami. Nominalne zmienne kategoryczne, w tym immunohistochemiczne wskaźniki pozytywnej ekspresji, zostały przeanalizowane za pomocą testu χ2 . Analizowano zmienne kategoryczne porządkowe, w tym stopień patologiczny i stadium kliniczne, za pomocą testu sumy rangi (test Mann-Whitney U dla porównań dwóch grup, tam, gdzie to dotyczy). Korelacja między ekspresją HMGA1 a HAND1 została oceniona za pomocą analizy korelacji liniowej. Wszystkie testy były dwustronne; P < 0,05 uznano za istotne statystycznie, a P. < 0,01 za wysoce istotne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki detekcji immunohistochemicznej
Przedstawiono reprezentatywne obrazy barwienia hematoksylinowo-eozynowe (HE) ilustrujące morfologię histologiczną sąsiedniej prawidłowej błony śluzowej krtani i LSCC o różnym stopniu różnicowania (well, medium i low). Konkretnie, Rysunek 1A pokazuje sąsiednie prawidłowe błony śluzowej krtani, Rysunek 1B dobrze zróżnicowany LSCC, Rysunek 1C pokazuje um...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Rak krtani, jeden z najczęstszych guzów głowy i szyi, wykazuje w ostatnich latach wzrost częstości, prawdopodobnie związany z czynnikami środowiskowymi i stylem życia. Podobnie jak inne złośliwe guzy, jego nawroty i przerzuty pozostają głównymi przyczynami śmierci. Dzięki postępowi w biologii molekularnej zidentyfikowano wiele czynników związanych z rozwojem raka krtani, jednak mechanizmy powstawania i przerzutów wciąż nie są w pełni poznane. HMGA1, jako regulator transkrypcji, stał się w ostatnich latach przedmiotem bad...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy pragną podziękować swojej instytucji oraz wszystkim osobom, które przyczyniły się do tego badania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Automatyczna maszyna do osadzania tkanek | Sakura Finetek, Tokio, Japonia | Tissue-Tek TEC 5 | Osadzanie parafiny |
| Mikrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy | RM2135 | Podział (4 μ m) |
| Suszarka typu slide | Xiaogan Hongye Medical Instrument Co., Ltd., Chiny | CS-VI | Suszenie na szkiełkach |
| Inkubator grzewczy | Shanghai Yangguang Experimental Instrument Co., Ltd., Chiny | 303-4A | Inkubacja kontrolowana temperaturą |
| Mikroskop optyczny | Olympus Corporation, Tokio, Japonia | BX41 | Obserwacje histologiczne |
| System przechwytywania obrazu | QImaging, Kanada | QCapture Pro 7 | Obrazowanie mikroskopowe |
| Czysty bench | Fabryka Sprzętu Półprzewodnikowego Xicheng w Pekinie, Chiny | SW-CJ-1FD | Sterylne miejsce pracy |
| Chłodzenie w wirówce | Fabryka Naprawy Medycznych w Pekinie, Chiny | LXJ-64-01 | Separacja RNA |
| Wirówka stołowa | Shanghai Peiqing Technology Co., Ltd., Chiny | PQ-1600A | Przetwarzanie RNA/DNA |
| Mieszadło magnetyczne | Fabryka Narzędzi Medycznych Jinsu Jintan, Chiny | HJ-3 | Przygotowanie roztworu |
| Mini Mixer | Shanghai Peng' s Industrial Co., Ltd., Chiny | H-1 | Miksowanie próbek |
| Elektroniczna waga | METTLER Toledo, Szwajcaria | PB3002-S | Ważenie próbek |
| Wzmacniacz PCR | Eppendorf AG, Niemcy | Mastercycler 5333 | Wzmacnianie PCR |
| Zasilacz elektroforezy | Fabryka Instrumentów Liuyi w Pekinie, Chiny | DYY-6C | Sterowanie napięciem |
| Zbiornik elektroforezy | Fabryka Instrumentów Liuyi w Pekinie, Chiny | DYCZ-24DN | Elektroforeza żelowa |
| Piekarnik mikrofalowy | Instytut Badań Zastosowań Medycznych Shanghai Zhongda, Chiny | WD800SL23 | Przygotowanie agarozy |
| Transiluminator UV | Fabryka Instrumentów Liuyi w Pekinie, Chiny | WD-9403B | Wizualizacja DNA |
| System obrazowania żelowego | Anlai Co., Ltd., Chiny | AlphaImager HP | Dokumentacja żelowa |
| Lodówka (4 i stopnie; C) | Haier Biomedical, Chiny | BC-165D | Przechowywanie próbek |
| Zamrażarka o ultra-niskiej temperaturze | Haier Biomedical, Chiny | DW-86L388 | Przechowywanie (-80 & f; C) |
| Lodówka | Shanghai Fuzhi Technology Co., Ltd., Chiny | FZ-IB-20L | Transport próbki |
| Worki do przechowywania kriogenicznego | Shanghai Yili Technology Co., Ltd., Chiny | YL-ULT-50 | Zachowanie próbek |
| Pipety badawcze | Eppendorf AG, Niemcy | Research Plus | Obsługa cieczy |
| Odczynnik do ekstrakcji RNA (TRIzol) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific), USA | 15596026 | Ekstrakcja RNA |
| Zestaw do odwrotnej transkrypcji | Takara Bio Inc., Japonia | RR037A | Synteza cDNA |
| PCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japonia | RR820A | Wzmacnianie PCR |
| dNTP Mix | Takara Bio Inc., Japonia | 4030 (typowe) | Komponent PCR |
| Inhibitor RNazy (RNazyn) | Promega, USA | N2111 | Ochrona RNA |
| Oligo(dT) Primer | Takara Bio Inc., Japonia | 3806 (typowe) | Primer syntezy cDNA |
| Agarose | Sigma-Aldrich, USA | A9539 | Przygotowanie żelu |
| TAE Buffer (50& razy;) | Sigma-Aldrich, USA | TAE50X-1L (typowy) | Bufor elektroforezy |
| Marker DNA (Ladder) | Takara Bio Inc., Japonia | DL2000 (3421A) | Odniesienie do rozmiaru |
| Bromek etidy (EtBr) | Bio-Rad, USA | 1610433 | Wizualizacja DNA |
| Bufor PBS | Gibco (Thermo Fisher Scientific), USA | 10010023 | Bufor do prania |
| Woda uzdatniana przez DEPC | Invitrogen, USA | AM9916 | Ochrona RNA |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, USA | C2432 | Ekstrakcja RNA |
| Izopropanol | Merck, Niemcy | 109634 | Wytrącanie RNA |
| Etanol (absolut) | Merck, Niemcy | 100983 | Odwodnienie |
| Metanol | Merck, Niemcy | 106009 | Blokowanie nadoksydazy |
| Nadtlenek wodoru (H2O2) | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Endogenne blokowanie peroksydazy |
| Ksylen | Sigma-Aldrich, USA | 534056 | Deparafinizacja |
| Bufor odzyskiwania antygenu cytrynowego | Abcam, Wielka Brytania | ab93678 | Pobieranie antygenów |
| Rozcieńczalnik przeciwciał | Dako, Dania | S3022 | Rozcieńczenie przeciwciał |
| Przeciwciało główne HMGA1 | Abcam, Wielka Brytania | ab129153 | Rozcieńczenie 1:150 |
| Przeciwciało główne HAND1 | Abcam, Wielka Brytania | ab200040 | Rozcieńczenie 1:100 |
| Przeciwciało wtórne (sprzężone z HRP) | Dako, Dania | K5007 | System detekcji |
| Zestaw do podłoża DAB | Dako, Dania | K3468 | Detekcja chromogeniczna |
| Barwienie hematoksyliny | Sigma-Aldrich, USA | H9627 | Barwienie jądrowe |
| Eosin Stain | Sigma-Aldrich, USA | E4009 | Barwienie cytoplazmatyczne |
| Neutralne medium mocujące balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Chiny | 10004160 | Montaż zamka |
| Spłony HMGA1 | Syntezowane na zamówienie (np. IDT/Sangon) | Nie ma | Wzmacnianie genów |
| Spłony HAND1 | Syntezowane na zamówienie (np. IDT/Sangon) | Nie ma | Wzmacnianie genów |
| Primery GAPDH (kontrola wewnętrzna) | Własne syntezatory | Nie ma | Gen housekeeping |
| APES (aminopropyltrietoksysilan) | Sigma-Aldrich | Nie ma | Powłoka zamka |
| Rurki mikrowirówki wolne od RNazy | Eppendorf | Nie ma | Obsługa RNA |
| Porady dla pipet wolnych od RNazy | Eppendorf | Nie ma | Obsługa cieczy |
| Żelowa taca i grzebień do odlewania z żelu agarozowego | Ogólne | Nie ma | Przygotowanie żelu |
| Oprogramowanie do projektowania primerów | Integrated DNA Technologies, USA | Narzędzie PrimerQuest | Konstrukcja spłonka |
| Oprogramowanie do analizy obrazów | Media Cybernetics, USA | Image-Pro Plus 6.0 | Ilościowość pasmowa |
| Oprogramowanie do analizy statystycznej | IBM Corp., USA | SPSS Wersja 13.0 | Analiza statystyczna |