Artykuł metodologiczny

Mapowanie odporności niemowląt przy minimalnym układzie: Integracyjne profilowanie jednokomórkowe i wielokomórkowe

DOI:

10.3791/70279

⸱

3 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje pobieranie i przechowywanie próbek krwi od noworodków i dzieci oraz zastosowanie scRNA-seq, proteomiki i spektralnej cytometrii przepływowej do charakteryzacji populacji komórek odpornościowych z tych próbek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przy narodzinach noworodkowy układ odpornościowy nagle staje w obliczu radykalnie innego środowiska, bogatego w bodźce mikrobiologiczne i środowiskowe. Rosnące dowody sugerują, że odporność we wczesnym okresie życia nie jest tylko niedojrzała, ale jest wyjątkowo przystosowana do spełnienia specyficznych wymagań tego okna rozwojowego. W tym okresie układ odpornościowy jest bardzo dynamiczny, przechodząc szybkie zmiany, aby dostosować się do zmieniającego się krajobrazu zewnętrznego. Zrozumienie tego złożonego i ewoluującego krajobrazu odpornościowego wymaga bezpośrednich badań u noworodków. Jednak głównym ograniczeniem w takich badaniach jest niska całkowita objętość krwi u noworodków (~100 mL/kg), co ogranicza ilość bezpiecznie pobieraną do badań, szczególnie u bardzo niskiej masy urodzeniowej (ELBW) lub u bardzo wcześniaków. W naszych ostatnich badaniach odniesiemy to ograniczenie, pokazując, jak można przeprowadzić wysokowymiarowe profilowanie immunologiczne przy użyciu mikroskopicznych ilości krwi noworodkowej. Wprowadzamy zestaw zoptymalizowanych protokołów dla próbkowania podłużnego we wczesnym okresie życia i stosujemy zaawansowane techniki, w tym cytometrię przepływową, proteomikę oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek, aby zmaksymalizować informacje uzyskane z minimalnego inputu. Razem te metody umożliwiają kompleksowy obraz sygnatur transkryptomicznych i proteomicznych krążących komórek odpornościowych u noworodków, oferując nowe spojrzenie na unikalną trajektorię odporności we wczesnym życiu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten jest zoptymalizowany dla próbek krwi o pojemności 100-250 μl przetwarzanych w ciągu 12 godzin od pobrania, zarówno krioprezerwowanych, jak i natychmiastowych. Przy narodzinach układ odpornościowy noworodka zostaje wprowadzony w zupełnie inne środowisko, wzbogacone o bodźce mikrobiologiczne i środowiskowe, które wcześniej były nieobecne w chronionym środowisku wewnątrzmacicznym 1,2. Ta zmiana wymaga od układu odpornościowego adaptacji i reagowania na ogromną liczbę nowych antygenów, co jest niezbędne do przetrwania, ale jednocześnie stawia poważne wyzwania 1,2. Coraz więcej dowodów sugeruje, że odporność we wczesnym okresie życia nie jest po prostu niedojrzała ani miniaturowa wersja dorosłego układu odpornościowego. Zamiast tego jest on wyjątkowo dostosowany do specyficznych potrzeb tego krytycznego okresu rozwoju 3,4. W tym okresie noworodkowym składniki komórkowe układu odpornościowego, w tym różne typy limfocytów T, B i komórek szpikowych, dojrzewają i rozwijają unikalne cechy oraz funkcje specyficzne dla wczesnego życia 5,6,7,8. Pomimo swojego znaczenia, odporność noworodkowa pozostaje trudna do bezpośredniego badania ze względu na ograniczenia etyczne i praktyczne. Głównym ograniczeniem jest niewielka objętość krwi u noworodków, średnia ~100 mL/kg 9,10. Problem ten staje się jeszcze bardziej widoczny przy pobieraniu krwi od bardzo wcześniaków (urodzonych przed 30. tygodniem ciąży) oraz niemowląt ELBW, które mogą ważyć zaledwie 400 g przy zaledwie 40 ml krążącej krwi. Ogranicza to, ile krwi można bezpiecznie pobrać, podkreślając potrzebę podejścia maksymalizujących dane z minimalnej ilości próbek. Aby sprostać temu wyzwaniu, nasze prace demonstrują zoptymalizowane protokoły do wysokowymiarowego profilowania odpornościowego z wykorzystaniem mikroskopicznych objętości krwi (100-250 μL), takich jak te pobierane od niemowląt ELBW.

Najnowsze postępy w pobieraniu i przetwarzaniu krwi umożliwiły badanie odpowiedzi immunologicznych w populacjach, gdzie pobieranie próbek tradycyjnie jest trudne. Urządzenia mikroigłowe, takie jak systemy Tasso i Touch Activated Phlebotomy, zostały początkowo opracowane do wygodnego pobierania krwi w domu u dorosłych. Od tego czasu zostały one przystosowane do stosowania u niemowląt, umożliwiając opiekunom podstawowym i zespołom klinicznym pobieranie próbek przy minimalnym dyskomfortie. Dodatkowo można je stosować w domu bez stresu związanego z powtarzanymi wizytami klinicznymi, co ułatwia przestrzeganie przepisów i dostępność. Mikrorurka z etylendiaminetetraoctowym (EDTA) powinna być używana wraz z urządzeniem i wysyłana przez noc do laboratorium z przestrzeganiem odpowiednich protokołów zagrożeń biologicznych. Następnego ranka, gdy próbki dotrą, powinny zostać przetworzone metodami lizy czerwonych krwinek (RBC), aby wychwycić krążące komórki odpornościowe6. Warto zauważyć, że rurki EDTA umożliwiają izolację żywych komórek, ale ważne są kwestie czasowe. W przypadku testów funkcjonalnych ze stymulacją próbki muszą być przetwarzane w ciągu mniej niż 4 godzin, a najlepiej w mniej niż 2 godzinach od pobrania. W przypadku niefunkcjonalnych, fenotypowych testów przedstawionych poniżej, próbki powinny zostać przetworzone w ciągu 12 godzin, aby umożliwić wysyłkę w ciągu nocy i zapewnić odzyskanie energii, ponieważ żywotność komórek maleje w czasie12. W porównaniu do tradycyjnego rozdziału gęstości i gradientu Ficoll, liza jest szybsza, mniej pracochłonna i daje wyższy odzysk13. Jednak izolacja jednojądrowych komórek z krwi obwodowej za pomocą lizy może pozostawić zanieczyszczające granulocyty, zmniejszając czystość, ale może być korzystna dla badań zainteresowanych tymi typami komórek14. Te kompromisy podkreślają, jak adaptacje metodologiczne równoważą wykonalność i dokładność podczas badania rzadkich lub wrażliwych próbek klinicznych, takich jak te od noworodków. Dalsza obsługa izolowanych komórek również zyskała na udoskonaleniu metodologicznym. Kriokonserwacja z użyciem surowicy płodowej bydła (FBS) i dimetylosulfoksydu (DMSO) pozostaje solidnym podejściem dla komórek odpornościowych, szczególnie we krwi płodowej i noworodkowej, gdzie żywotność i regeneracja komórek są kluczowe. Oprócz optymalizacji procesu pobierania krwi, wprowadziliśmy także techniki dalsze, które pozwalają na wydobycie maksymalnej ilości informacji z małych objętości próbek. Wprowadzamy zestaw zoptymalizowanych protokołów, które ułatwiają pobieranie próbek we wczesnym życiu, umożliwiając szczegółową analizę dynamiki układu odpornościowego w czasie. Nasze podejście wykorzystuje zaawansowane techniki, takie jak cytometria przepływowa spektralna, proteomika oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek, które łącznie oferują niezrównany obraz sygnatur proteomicznych i transkrypcyjnych krążących komórek odpornościowych we wczesnym życiu. Dodatkowo, cytometria przepływowa spektralna daje możliwość uzyskania funkcjonalnego wglądu przy minimalnym wkładzie komórek.

Na przestrzeni lat stosowano różne techniki, takie jak pełne morfologie krwi (CBC), do analizy komórek odpornościowych pochodzących z krwi15, podczas gdy inne analizowały proporcje komórek odpornościowych w próbkach pełnej krwi noworodków za pomocą metylacji DNA16,17. Chociaż te techniki pomogły w poznawaniu proporcji znanych komórek odpornościowych, wciąż istnieją ograniczenia w naszej możliwości uzyskania dogłębnych informacji o komórkach bez systemu multi-omics. CBC dostarczają jedynie szerokich miar głównych typów komórek krwi, co czyni je przydatnymi do określania ogólnego stanu odpornościowego w warunkach klinicznych, ale mają ograniczone możliwości rozróżniania podtypów lub stanów funkcjonalnych. Najnowsze badania zaczęły rozwiązywać to ograniczenie, stosując zmiany transkryptomiczne i metabolomiczne pochodzące z osocza u niemowląt już od pierwszego tygodnia życia18 roku. Proteomika oparta na spektrometrii mas została zaadaptowana do badania profili odpornościowych w próbkach noworodków19. To podejście jest skuteczne w bezstronnym pomiarze szerokiego zakresu białek oraz w identyfikacji potencjalnych biomarkerów. Jednak kluczowe ograniczenia to wymóg stosunkowo dużego spożycia białek oraz brak bezpośrednich informacji o tożsamości komórki, mimo że można wychwycić zarówno białka rozpuszczalne, jak i nierozpuszczalne. Ukierunkowany multipleksowy test proteomiki (TMPA) oferuje alternatywy dla próbek o niskim wejściu. Metody te wykorzystują ukierunkowane wykrywanie oparte na przeciwciałach, zapewniając profilowanie o wysokiej czułości dla próbek z ograniczoną ilością materiału. Jeden z nich, w szczególności, został wykorzystany do śledzenia trajektorii rozwoju immunologicznego we wczesnym okresie życia wzdłużnie20.

Cytometria przepływowa umożliwia ilościową analizę białek komórek odpornościowych na poziomie pojedynczych komórek poprzez przepuszczenie komórek znakowanych fluorescencją przez skupioną wiązkę laserową oraz pomiar powstałych sygnałów rozpraszania światła i fluorescencji. W tej technice fluorescencyjnie znakowane przeciwciała wiążą się z konkretnymi białkami powierzchniowymi lub wewnątrzkomórkowymi. Pozwala to na jednoczesne wykrywanie i ilościowe określenie wielu podtypów komórek odpornościowych oraz ich cech definiujących na podstawie profili fluorescencji. Cytometria przepływowa spektralna rozszerza to podejście, rejestrując pełne spektrum emisji każdego fluorochromu, umożliwiając precyzyjne rozmieszanie spektralne i jednoczesne wykrywanie ponad 35 markerów w jednym testie 21,22,23. Umożliwia to analizę znacznie większej liczby markerów niż konwencjonalne panele cytometrii przepływowej, które są ograniczone do ~8-12 markerów. Uzupełniając te techniki cytometryczne, sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) zrewolucjonizowało badania immunologiczne, umożliwiając wysokorozdzielcze, obiektywne profilowanie transkryptomiczne na podstawie minimalnego materiału wejściowego24. Pomimo wyższych kosztów i zależności od żywotności komórek, scRNA-seq dostarcza niezrównanych informacji na temat nierówności immunologicznej we wczesnym życiu w porównaniu z sekwencjonowaniem zbiorowym. Razem te osiągnięcia pokazują, jak innowacje w zbieraniu, konserwacji i analizie są dostosowywane, aby pokonać unikalne wyzwania związane z badaniem odporności płodowej i noworodkowej.

Protokół ten został zoptymalizowany do analizy krioprezerwacji obwodowych komórek odpornościowych izolowanych za pomocą szeregowej lizy RBC. Naukowcy powinni rozważyć ten protokół, jeśli ich badania wymagają profilowania odpornościowego o wysokiej rozdzielczości na podstawie małych objętości krwi (100-500 μL), zwłaszcza gdy analiza podłużna jest kluczowa. Metoda ta jest szeroko stosowalna zarówno do noworodków terminowych, jak i przedwczesnych i jest kompatybilna z szerokim zakresem dalszych analiz, co czyni ją odpowiednią dla różnorodnych pytań badawczych w zakresie immunologii noworodków i dzieci.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z Instytucjonalną Radą Przeglądową Uniwersytetu Yale (IRB) zapewniono świadomą zgodę rodziców oraz pełną zgodność z odpowiednimi krajowymi przepisami etycznymi. Zgodnie z zatwierdzonym protokołem IRB, rodzice zostali skontaktowani przez zespół badawczy w pierwszym tygodniu po narodzinach dziecka, aby uzyskać zgodę przed zapisem do szkoły. Nie rozpoczęto żadnych procedur badawczych z udziałem materiałów pochodzących od człowieka przed udokumentowaną akceptacją etyki.

1. Zbieranie, przetwarzanie i przechowywanie próbek (Rysunek 1)

  1. Pobieranie krwi w szpitalu
    1. Pobierz i przetworz próbki niemowląt po ich otrzymaniu, przechowuj w temperaturze 4 °C i przetwarzaj w ciągu 12 godzin od pobrania.
    2. Pobierz ~250 μL pełnej krwi i przechowuj ją w probówce do pobrania krwi EDTA z antykrzepliwością. Odwróć probówkę 8 razy, aby wymieszać antykoagulant.
    3. Przeprowadzić przetwarzanie całej krwi za pomocą czerwonej lizy krwi, zgodnie z Sekcją 1.3 (przetwarzanie próbki krwi całej).
    4. Aby zebrać suche plamy krwi, użyj sterylnego lanceta, aby zrobić nakłucie na czystym palcu/pięcie.
      1. Alternatywnie, pipetować ~25-30 μL krwi z rurki EDTA na papier filtracyjny. Delikatnie dotknij papierem filtrującym kroplę krwi.
    5. Napełnij co najmniej jedno krąg swobodnie płynącą krwią, po jednej kropli na krąg. Pozwól plamce krwi wyschnąć. Trzymaj papier filtracyjny otwarty, aż plamy krwi całkowicie wyschną.
    6. Odpowiednio oznacz czas pobrania, datę przetwarzania, punkt czasu oraz identyfikację próbki.
    7. Włóż do przezroczystej plastikowej torby na zamek. Przechowuj karty krwi w temperaturze −20 °C lub −80 °C dla dłuższej stabilności do czasu przygotowania do analizy proteomicznej.
  2. Ambulatoryjne pobieranie krwi
    UWAGA: Za zgodą Instytucjonalnej Rady Przeglądowej Uniwersytetu Yale, rodzice uczestników pacjentów ambulatoryjnych otrzymali możliwość pobierania próbek krwi w domu za pomocą urządzenia do samopobierania mikronakłutek. Urządzenie to pobiera krew naczyniowato włosowate za pomocą lanceta przyłożonego do skóry. Rodzice, którzy wybrali tę metodę, przeszli szkolenie w klinice z wykorzystaniem zestawów demonstracyjnych, a następnie otrzymali szczegółowe pisemne instrukcje oraz zestawy do zbierania do użytku domowego.
    1. Przed użyciem umyj ręce i załóż rękawiczki. Zbierz wszystkie niezbędne przedmioty, w tym lustro, jeśli tylko jeden z rodziców wykonuje pobieranie krwi.
    2. Wyjmij urządzenie z zestawu narzędzi i odkręć korek z kompatybilnej rurki.
    3. Wciśnij rurkę do urządzenia, aż będzie ciasno z liniami wypełniającymi skierowanymi na zewnątrz.
    4. Zdejmij pieluchę niemowlęcia i przytrzymaj je pionowo.
    5. Postępuj zgodnie z instrukcjami z ogrzewczym wkładem, aby aktywować.
      UWAGA: Jeśli plecak nie jest dostępny, użyj innej metody ogrzewania, na przykład ręki.
    6. Trzymaj okład grzewczy na miejscu (pośladku) przez 2-4 minuty, aby ogrzać i zwiększyć przepływ krwi.
    7. Oczyść to miejsce podkładką alkoholową i pozwól wyschnąć.
    8. Zdejmij przezroczystą okładkę z czerwonego przycisku. Odklej zaczep z urządzenia i mocno przyklej się do najgłębszej części pośladków niemowlęcia, trzymając je pionowo.
      UWAGA: Dostosuj ich postawę w razie potrzeby, aby rurka była całkowicie pionowa i zapewnić prawidłowe pobieranie krwi.
    9. Naciśnij przycisk do końca raz i puść. Ustaw timer na 5 minut. Obserwuj, jak rurka się napełnia, korzystając z lustra w razie potrzeby.
    10. Krew może nie pojawić się przez pierwsze 1-2 minuty. Usuń urządzenie maksymalnie po 5 minutach lub wcześniej, jeśli krew wypełni się do górnej linii wskaźnika przed 5 minutami.
    11. Delikatnym skrętem wyjmij rurkę z urządzenia i pociągnij w dół. Szybko zatrzasnąć korek całkowicie do rurki. Odwróć rurkę co najmniej 10 razy, upewniając się, że krew dotyka koreka przy każdej inwersji, aby zapobiec krzepaniu.
    12. Wysyłaj próbki na noc po pobraniu.
  3. Przetwarzanie próbki pełnej krwi
    1. Przetwarzaj próbki krwi w szafce bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Ostrożnie przelej 250 μL krwi do stożkowej probówki o pojemności 50 mL zawierającej 10 mL buforu lizycznego RBC. Przepłucz probówkę do pobierania krwi 10 ml buforu lizycznego do wyczerpania krwinki. Pozostawić komórki do lizy w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut.
    3. Po zakończeniu lizy dodaj ~30 mL PBS w RT, aby przemyć i wirować w 430 × g przez 5 minut w 4 °C. Aspiruj supernatant w próżni, nie naruszając granulki.
    4. Kontynuuj przenoszenie i płukanie próbki zgodnie z krokiem 1.3.2, aż osad komórkowy okaże się wolny od widocznych czerwonych krwinek. Wirówkuj w 430 × g przez 5 minut, a następnie ostrożnie usuń supernatant, nie zakłócając granulki.
    5. Na każde 250 μL pobranej krwi należy ponownie zawiesić powstały granulek komórkowy w 2 mL mroźnego medium (10% DMSO w FBS) i podzielić na dwie krioviale dla zachowania.
    6. Sprawdzam żywotność komórek, licząc komórki zawieszone w ośrodku feezującym za pomocą hemocytometru za pomocą wykluczenia trypana niebieskiego.
    7. Przenieś 1 mL z kroku 1.3.5 do każdego kriovialu. Odpowiednio oznacz czas pobrania, datę przetwarzania, punkt czasowy oraz identyfikację próbki.
    8. Przechowuj kriovial(y) pośrednio w temperaturze -80 °C w mroźnym pojemniku z izopropanolem. Po 24 godzinach przelej kriovial do ciekłego azotu, aż będzie gotowy do analizy.

2. TMPA z zaschniętych plam krwi (DBS) (Rysunek 2)

  1. W dniu obróbki przynieś papier filtrujący do RT. Używając dziurkarki o średnicy 3 mm, perforuj 2-3 kółka na papierze filtracyjnym tam, przez które przeszła krew, tak centralnie jak to możliwe na miejscu krwi.
  2. Każdy dziurcz o średnicy 3 mm podnieś pęsetą i dodaj do wnętrka z płytką 96-dołkową lub niskowiążącą rurkę PCR zawierającą 20 μL buforu elucijnego (1x PBS, 1x inhibitor proteazy, 0,05% Tween 20). Upewnij się, że dziurk jest pokryty buforem elucijnym.
  3. Zamknij rurki lub przykryj płytę plastikową spódnicą i umieść je na Digital Vortex obracającym się z prędkością 600 obr./min przez 60 minut w trybie RT.
  4. Po zakończeniu inkubacji ostrożnie przenieś eluat do nowej niskowiążącej probówki lub płytki z 96 dołkami. Usuń rurki lub płytę z dziurkami filtra.
  5. Ilościowo określ zawartość białka za pomocą testu BCA.
    1. Pobieraj po 2 μL każdej próbki lub standardu BSA, aby uzyskać seryjne rozcieńczenia 1:10 i 1:100 w wodzie. Przygotuj próbki i standardy w duplikacie, dodając 15 μL rozcieńczonych próbek lub standardu do 200 μL roztworu roboczego 1x roboczego. Inkubuj próbki przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Odczyt sygnału z częstotliwości 562 nm na czytniku tablicowym. Oblicz końcowe stężenie białka na podstawie standardowego nachylenia BSA i tła buforu elucijnego.
  6. Wytwarzaj aliquoty o pojemności 30 μL dla próbek 0,5-1 mg/mL w niskowiążących mikrotubkach z nakrętką 1,5 mL. Próbki zamrażać w temperaturze -80 °C, aby później je przetworzyć za pomocą usługi TMPA.

3. Cytometria przepływowa spektralna krwi lizowanej przez RBC (Rysunek 3)

  1. W dniu eksperymentu szybko rozmroz fiolkę z komórkami lizowanymi przez RBC w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko jedna mała kropla lodu.
  2. Dodaj zawiesinę ogniwową do stożkowej rurki o pojemności 15 mL zawierającej 10 mL podgrzanego (37 °C) pełnego RPMI (przygotowanej przy użyciu 500 mL RPMI 1640, 50 ml FBS, 5,6 mL penicyliny-streptomycyny oraz 5,6 mL suplementu glutaminy). Wirówka w 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant.
  3. Delikatnie zawiesić pellet w 3 mL pełnego RPMI i określić liczbę komórek odpowiednią metodą.
  4. Obracaj ponownie zawiesowane komórki w dawce 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Aspiruj i odrzucaj supernatant.
  5. Dostosuj stężenie komórek do 1× 106 komórek/mL przy pełnym RPMI. Podawaj 100 μL na dołek (0,1 × 10⁶ ogniw) do płyty z 96 dołkami w kształcie litery V. Wirówka na 764 × g przez 2 minuty w 4 °C i usuwa nadmiar.
  6. Dodaj 100 μL barwnika żywego/martwego w PBS w rozcieńczeniu 1:2 000 z blokiem Fc i blokiem monocytów (rozcieńczenie 1:100) do wszystkich próbek, z wyjątkiem kontroli bez barw. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Przemyj 100 μL PBS i wiruj w 764 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wyrzuć supernatant.
    UWAGA: Konieczne jest stosowanie bloku Fc i bloku monocytów, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.
  8. Dodaj 100 μL koktajlu powierzchniowego rozcieńczonego (rozcieńczenie 1:200) w buforze FACS (500 mL PBS, 2,5 g prowincji surowicy bydłej (BSA), 2 mM EDTA, pH 8,5) do wszystkich próbek, z wyjątkiem kontroli bez barwienia. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Przemyj 100 μL buforu FACS i wiruj w temperaturze 764 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wyrzucaj supernatant.
  10. Ustalić komórki, dodając do każdej próbki 100 μL 4% paradehydu. Inkubuj przez 15 minut w RT w ciemności.
  11. Przemyj 100 μL buforu FACS, wiruj w 764 × g przez 2 minuty w 4°C i ponownie zawiesij w 200 μL buforu FACS.
  12. Przygotuj ultra-komperlikty jako jednokolorowe kontrolki. Bejcuj jednokolorowe kulki kontrolne według tego samego protokołu co próbki, w tym fiksację, jeśli próbki były utrwalone.
  13. Przygotuj sterowanie fluorescencyjne minus jeden (FMO) według tej samej procedury co dla próbek.
    UWAGA: Ważne jest, aby potraktować jednokolorowe sterowanie i FMO tak samo jak próbki. Na przykład, jeśli próbki są utrwalone po barwieniu, FMO i sterowanie jednokolorowe również powinno zostać naprawione.
  14. Uruchom próbki, sterowanie jednokolorowe, sterowanie bez barwienia oraz sterowanie FMO na konwencjonalnym/spektralnym cytometrze przepływowym. Analizuj dane za pomocą oprogramowania.
  15. Ustaw bramki w oparciu o odpowiednie kontrole izotypu i FMO. Najpierw komórki bramkowe wybierają populację leukocytów za pomocą wykresu rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC), który pomaga wykluczyć zanieczyszczenia i wybierać komórki na podstawie rozmiaru i ziarnistości.
  16. Po selekcji leukocytów komórki bramkowe wykluczają dublety, używając wykresu powierzchni rozpraszania do przodu (FSC-A) względem wysokości rozpraszania do przodu (FSC-H).
    UWAGA: Zapewnia to wybór pojedynczych komórek (singletów), przy czym komórki znajdujące się po przekątnej są traktowane jako singlety, natomiast dublety i skupiska są wyłączone.
  17. Komórki bramkowe dla żywotności za pomocą barwnika żywotności, aby wykluczyć martwe komórki, zapewniając, że kolejna analiza obejmuje tylko żywe komórki.
  18. Po tych początkowych etapach gateingu kolejne aktywne pojedyncze komórki pod kątem konkretnych markerów linii geneatycznych, aby podkategoryzować różne populacje komórek odpornościowych. Podziel żywe pojedyncze komórki na komórki szpikowe CD33+ i limfocyty CD33- na podstawie ekspresji CD33.
  19. W populacji CD33+ różnicować monocyty CD14+ i identyfikować komórki dendrytyczne CD11c+ (DC) jako komórki ekspresujące CD11c, ale nie CD14.
  20. W populacji limfocytów CD33 należy zidentyfikować podzbiory limfocytów T CD3+ i pod-bramek CD4+ i CD8+ .
  21. Dodatkowo zidentyfikować komórki CD56+ naturalnego zabójcy (NK) na podstawie ekspresji CD56 oraz zidentyfikować komórki typu CD19+ B poprzez ekspresję CD19.

4. scRNA-seq krwi lizowanej przez RBC (Rysunek 4)

  1. Rozmroź jedną fiolkę z krioprezerwowanymi komórkami RBC w kąpieli wodnej 37 °C. Dodaj próbkę do 10 mL nośnika limfocytów T w stożkowej probówce o pojemności 15 mL. Wirówka w 430 × g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant.
  2. Dodaj kolejne 10 ml 1x PBS do próbki. Wirówka w 430 × g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant.
  3. Policz komórki i oceń żywotność trypanowym niebieskim. Jeśli żywotność jest mniejsza niż 70%, przejdź do usuwania martwych komórek za pomocą zestawu do usuwania martwych komórek.
    1. Usuwanie martwych komórek
      1. Rozcieńcz 20x Binding Buffer Stock za pomocą sterylnej, podwójnie destylowanej wody, aby uzyskać 1x działający roztwór.
      2. Zawiesz pellet komórkowy w 100 μL mikrokulek usuwających martwe komórki na 1 × 10 7 komórek. Dokładnie wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      3. Włóż kolumnę separacyjną magnetyczną do odpowiedniego stojaka magnetycznego. Przepłukaj kolumnę 500 μL buforu wiązającego 1x, aby wyrównać przed użyciem.
      4. Zwiększ objętość komórek do 500 μL z buforem wiązającym 1x. Załóż zawiesinę ogniwa do kolumny i zbieraj przepływ w nowej rurce mikrowirówki o pojemności 1,7 mL.
      5. Przemyj 2x z 500 μl buforu wiązania. Zbieraj przepływ w tej samej rurce mikrowirówki.
      6. Wiruj eluat w 300 × g przez 10 minut. Usuń nadmiar.
    2. Policz komórki i oceniaj ich żywotność trypanowym niebieskim.
    3. Ponownie zawiesz 20 000 żywotnych komórek w 40 μL PBS o stężeniu 0,04% BSA w nowej probówce mikrowirówki o pojemności 1,7 mL.
    4. Natychmiast wysłać komórki na lód do ośrodka rdzenia genomowego na generowanie i sekwencjonowanie. Zbieraj wyniki sekwencjonowania w formacie wyjść Cell Ranger.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebraliśmy karty DBS od 10 bardzo przedwcześniaków w trzech punktach czasowych: 1 tydzień (n = 12), 1 miesiąc (n = 7) oraz 2 miesiące (n = 3) do analizy proteomicznej TMPA6 (Rysunek 2A). Próbki te analizowano wraz z płodną krwią pępowinową niemowląt (TCB; n = 4) oraz krwią zdrowych dorosłych (AB; n = 5). Znormalizowana ekspresja białek (NPX) 92 białek immunologicznych została zmierzona za pomocą platformy TMPA (Rysunek 2B). Analiza statys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzyskanie wysokiej jakości danych immunologicznych z minimalnych ilości krwi noworodkowej i niemowlęcej wymaga metodologicznych adaptacji w wielu etapach. W tym protokole opisujemy cztery uzupełniające się strategie: (i) zoptymalizowane pobieranie krwi i krioprezerwację w celu zachowania żywotnych komórek do dalszego użytku, (ii) zastosowanie spektralnej cytometrii przepływowej do wieloparametrycznego immunofenotypowania, (iii) scRNA-seq do rozwiązania heterogeniczności układu odpornościowego w wysokiej rozdzielczości or...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy za następujące kluczowe obiekty na Yale: Yale Flow Cytometry core; Centrum Analizy Genomu Yale. Dziękujemy Yale Center for Clinical Investigation, Yale Office of Physician-Scientist and Scientist Development oraz Pediatric Critical Care and Trauma Scientist Development Program/NICHD. Badania respirometryczne przeprowadził Chemical Metabolism Core na Uniwersytecie Yale. Prace te zostały sfinansowane z grantów do: P01 AI179570 (L.K.), R01AI171980 (L.K.), R01DK129552 (L.K.), R01HL163043 (L.K.), Cystic Micosis Foundation (L.K.); K08 AI177743 (N.N.B.), NAGRODA Hartwella (N.N.B.); K08DK133687 (O.O.), Yale School of Medicine, Katedra Pediatrii (O.O.); R01AI123204 (C.R.O). Treść jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne poglądy Narodowych Instytutów Zdrowia. Rysunek 1 został stworzony w BioRender. Gawon, K. (2025) https://BioRender.com/7embw10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific  15575-038 
1x bufor lizyczny RBC Invitrogen 3177165 
Zestaw do testów białek BCA  Abcam ab287853 
BD Microtainer MAP MicrotubeFisher Scientific  22-253-270
Bel-Art Krio-Bezpieczny -1 stopień; C Freeze Controller Millipore Sigma 41122800 
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich A9647-100G 
Brilliant Ultra Violet 496 Anti-Human CD3 Thermo Fisher Scientific  364-0038-42 
Brilliant Ultra Violet 661 anty-ludzki CD11c BD BioScience 612968 
Brilliant Vil750 Anti-Human CD14 BioLegend 367135 
Brilliant Violet 570 Anti-Human CD8a BioLegend 301038 
Brilliant Violet 711 Anti-Human CD56 BioLegend 318336 
cOmplete, mini, bez-EDTA-inhibitor inhibitorów proteazyMillipore Sigma 11836170001 
Zestaw do usuwania martwych komórek  Miltenyi Biotec 130-090-101 
Dimetylsulfotlenek (DMSO)  Thermo Fisher Scientific  BP231-100 
Dulbecco' s Fosforanowa sól fizjologiczna buforowana (DPBS), bez wapnia, bez magnezu i bbsp;Thermo Fisher Scientific  14190144 
Serum bydlęce płodu (FBS)  Gibco  A5256801 
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific  02215418 
Bufor Fiksacyjny BioLegend 420801 
Suplement GlutaMAXGibco  35050061 
MACS MultiStand  Miltenyi Biotec 130-042-303 i nbsp;
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201 i nbsp;
NazwaFirmaNumer katalogowy
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 
Pacific Blue Anti-Human CD4 BioLegend 344619 
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific  15140-122 
RB780 Anty-Human CD33 BD Biosciences 755606 
Diewkacz metalowy Rierdge 3mm & nbsp;Rierdge SDD231031pc-01 
RPMI 1640 MediumGibco  11875-093 
Spark UV 387 Anty-Human CD19 BioLegend 302289 
Zestawy kolekcjonarskie TassoTasso Nie ma
Mikrorurki Thermo Scientific z nakrętkąThermo Fisher Scientific  14-755-287 
Whatman 309 ProteinsaverCytiva 41111700 
Zestaw do naprawienia zombie NIR Habitability Kit & Nbsp;BioLegend 423105 
oprogramowanie i pakiety
Adobe Illustrator2024
bbknn1.5.1
FlowJo10.8.1
GraphPad Prism9.4.0
NazwaWersja
Skandalny1.9.1
Srublet0.2.3
Komercyjne
Chromowy Single Cell 5' ZestawGenomika 10XPN-1000263
Olink  Panel zapalny Reveal lub Target 96Olinkhttps://olink.com/products/olink-target-96

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  2. Jain, N. The early-life education of the immune system: moms, microbes and (missed) opportunities. Gut Microbes. 12 (1), 1824564(2020).
  3. Konnikova, L., et al. Fetal and neonatal T cell immunity: unique features and challenges. Front Immunol. 11, 594939(2020).
  4. Pieren, D. K. J., Boer, M. C., De Wit, J. The adaptive immune system in early life: the shift makes it count. Front Immunol. 13, 1031924(2022).
  5. Brodsky, N. N., et al. Early-life human CD8+ T cells exhibit rapid, short-lived effector responses and a unique transcription factor landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (31), e2421106122(2025).
  6. Olaloye, O., et al. A single-cell atlas of circulating immune cells over the first 2 months of age in extremely premature infants. Sci Transl Med. 17, eadr0942(2025).
  7. Watson, N. B., et al. The gene regulatory basis of bystander activation in CD8+ T cells. Sci Immunol. 9 (92), eadf8776(2024).
  8. Maymí, V. I., et al. Neonatal CD8+ T cells resist exhaustion during chronic infection. J Immunol. 212 (5), 834-843 (2024).
  9. Kandasamy, R., Kollmann, T. R. Challenges in neonatal immunology. Front Immunol. 8, 1756(2017).
  10. Howie, S. R. Blood sample volumes in child health research: review of safe limits. Bull World Health Organ. 89 (1), 46-53 (2011).
  11. Gross, R., et al. Researching COVID to enhance recovery (RECOVER) pediatric study protocol: rationale, objectives and design. medRxiv. , (2023).
  12. Bourguignon, P., et al. Processing of blood samples influences PBMC viability and outcome of cell-mediated immune responses in antiretroviral therapy-naïve HIV-1-infected patients. J Immunol Methods. 414, 1-10 (2014).
  13. Urbansky, A., et al. Rapid and effective enrichment of mononuclear cells from blood using acoustophoresis. Sci Rep. 7 (1), 17161(2017).
  14. Najar, M., et al. Proliferative and phenotypical characteristics of human adipose tissue-derived stem cells: comparison of purification methods. Cytotherapy. 16 (9), 1220-1228 (2014).
  15. Abebe, D. Diagnostic significance of complete blood cell count and hemogram-derived markers for neonatal sepsis. World J Clin Pediatr. 13 (2), 1-13 (2024).
  16. Martino, D., et al. DNA methylation signatures underpinning blood neutrophil to lymphocyte ratio during first week of human life. Nat Commun. 15, 8157(2024).
  17. Jones, M. J., et al. DNA methylation differences between cord and adult white blood cells reflect postnatal immune cell maturation. Commun Biol. 8, 237(2025).
  18. Lee, A. H., et al. Dynamic molecular changes during the first week of human life follow a robust developmental trajectory. Nat Commun. 10, 1092(2019).
  19. Mithal, L. B., et al. Evolution of the umbilical cord blood proteome across gestational development. Sci Rep. 15 (1), 2233(2025).
  20. Olin, A., et al. Stereotypic immune system development in newborn children. Cell. 174 (5), 1277-1292.e14 (2018).
  21. Spasic, M., et al. Spectral flow cytometry methods and pipelines for comprehensive immunoprofiling. Cancer Res Commun. 4 (3), 895-910 (2024).
  22. Park, L. M., Lannigan, J., Jaimes, M. C. OMIP-069: forty-color full spectrum flow cytometry panel. Cytometry A. 97 (10), 1044-1051 (2020).
  23. Sahir, F., et al. Development of a 43-color panel for comprehensive immune cell characterization. Cytometry A. , (2020).
  24. Tang, F., et al. mRNA-seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 6, 377-382 (2009).
  25. Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19, 15(2018).
  26. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets. Cell Syst. 8 (4), 281-291.e9 (2019).
  27. Polanski, K., et al. BBKNN: fast batch alignment of single-cell transcriptomes. Bioinformatics. 36 (3), 964-965 (2020).
  28. Li, Y., et al. DMSO-free cryopreservation improves recovery and function of human T and NK cells. Cell Transplant. 31, 1-12 (2022).
  29. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
  30. Wohnhaas, C., et al. RNA integrity in cryopreserved immune cells enables robust single-cell transcriptomics. Front Immunol. 10, 204(2019).
  31. Daae, L. N. W., et al. Comparison of haematological parameters in capillary and venous blood samples from hospitalized children. Scand J Clin Lab Invest. 51 (7), 651-654 (1991).
  32. Meites, S. Skin-puncture and blood-collecting technique for infants. Clin Chem. 34 (9), 1890-1894 (1988).
  33. Grüner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots: preparing and processing. J Vis Exp. (97), e52619(2015).
  34. Waaijer, L. A., et al. Spectral flow cytometry panel for comprehensive immunophenotyping. Cytometry A. 107 (4), 226-232 (2025).
  35. Thieme-Ehlert, M. T., et al. OMIP-114: a 36-color spectral flow cytometry panel. Cytometry A. 107 (6), 364-371 (2025).
  36. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods. BMC Genomics. 22, 66(2021).
  37. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  38. Grandi, F. C., et al. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  39. Kim, N., et al. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

profilowanie pojedynczych kom reknoworodkowy uk ad odporno ciowycytometria przep ywowapod u ne profilowanie immunologicznesygnatury proteomicznesekwencjonowanie RNA pojedynczych kom rekklastry kom rek odporno ciowychminimalna obj to krwi

Powiązane artykuły