Artykuł metodologiczny

Technika stabilizacji białek błonowych w nanodyskach

DOI:

10.3791/70283

⸱

30 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Biology, Hunan University, 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology, Guangxi University, 3Jinshan Hospital, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie opisuje procedurę rekonstrukcji błonowego białka TWIK, kanału K+ wrażliwego na kwasy 2 (Zadanie 2) w nanodyski. Pomyślny montaż potwierdzono za pomocą mikroskopii krio-elektronowej z pojedynczą cząstką, która dała dobrze określone dwuwymiarowe średnie klasowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele białek błonowych wykazuje słabą stabilność, utratę aktywności oraz heterogeniczność próbek podczas ekstrakcji w środowiskach detergentowych, co stanowi poważne wyzwanie dla analizy krio-elektronowej mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Technologia nanodysku rozwiązuje te ograniczenia, wykorzystując białka rusztowania błonowego (MSP) oraz fosfolipidy do rekonstrukcji białek docelowych w natywną dwuwarstwę lipidową. W tym badaniu ludzki kanał potasowy Task2 został wyparowany, rozpuszczony i oczyszczony w obecności odpowiednich detergentów przed montażem nanodysku. Powstały protokół ustanawia powtarzalny workflow dla rekonstrukcji nanodysku Task2, co potwierdzają kluczowe etapy walidacji: wyraźna zmiana profili chromatografii wykluczeń rozmiarowych (SEC) potwierdzające powiększenie cząstek, współmigracja Task2 i MSP na SDS-PAGE oraz dobrze określone średnie klas 2D z widocznymi cechami struktury wtórnej. Wstępna rekonstrukcja 3D dodatkowo potwierdza integralność białka osadzonego w nanodysku. Poprzez poprawę czystości, jednorodności i jakości cząstek próbki, to podejście zapewnia solidną platformę do wysokorozdzielczych badań strukturalnych Zadania 2 oraz oferuje ramy metodologiczne zastosowane do innych białek błonowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka błonowe odgrywają kluczową rolę w transdukcji sygnałów komórkowych, transporcie metabolitów, utrzymaniu integralności struktury komórki oraz odpowiedzi immunologicznych. Zaburzenia regulacji białek błonowych są powiązane z różnymi chorobami, co czyni je głównymi celami rozwoju leków1. Pojawienie się mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) umożliwiło badania strukturalne dużych i dynamicznych białek błonowych2. Głównym wyzwaniem w uzyskaniu struktur o wysokiej rozdzielczości jest wydobycie tych białek z ich rodzimych dwuwarstw lipidowych, przy jednoczesnym zachowaniu ich naturalnych konformacji i funkcji biochemicznych. Ponadto wysoce dynamiczna konformacja białek błonowych oraz złożoność badań przesiewowych przeciwciał stanowią dodatkowe przeszkody w odkrywaniu ukierunkowanych leków 3,4. Tradycyjne metody ekstrakcji białek błonowych często wykorzystują detergenty, aby naśladować właściwości hydrofobowej dwuwarstwy lipidowej. Jednak takie podejście często zaburza stabilność białka błonowego, prowadząc do agregacji lub częściowego rozwijaniasię 5. Dodatkowo detergenty mogą usuwać niezbędne cząsteczki lipidów kluczowe do stabilizacji konformacji białek, potencjalnie zmieniając konformację białek lub nawet upośledzając ich funkcję, ograniczając tym samym ich zastosowanie w przesiewaniu przeciwciał i innych dalszych zastosowaniach6.

Technologia nanodysków została po raz pierwszy wprowadzona przez Sligara i współpracowników7. Ta samoorganizująca się struktura jest zazwyczaj tworzona przez pochodne apolipoproteiny A1 (ApoA1), czyli MSP, wraz z syntetycznymi lub naturalnymi lipidami, zapewniając stabilne środowisko dla białek błonowych 7,8,9. MSP tworzy strukturę w kształcie dysku, otaczając hydrofobowe krawędzie dwuwarstwy lipidowej. Ta struktura ma powierzchnię hydrofobową, która oddziałuje z ogonami lipidowymi acyklu, stabilizując białko błonowe, oraz powierzchnię hydrofilową skierowaną na zewnątrz, co pozwala białkowi błony pozostać rozpuszczalną w roztworach wodnych10. Nanodyski służą jako wszechstronna platforma do badań białek błonowych. Poprzez zachowanie oczyszczonych białek błonowych w środowisku niemal naturalnym lipidowym, pokonują ograniczenia tradycyjnych metod detergentowych i zachowują konformację oraz funkcję biologiczną białek in vitro. W konsekwencji ta metoda stała się potężnym narzędziem do badań strukturalnych białek błonowych. W porównaniu z tradycyjnymi środowiskami detergentowymi, dwuwarstwa lipidowa w nanodyskach zapewnia wsparcie strukturalne dla białek błonowych, stabilizując ich natywną konformację — cechę kluczową dla białek podatnych na inaktywację, takich jak receptory sprzężone z białkiem G i kanały jonowe11. Dodatkowo, wysoce jednolity charakter cząstek nanodysku po złożeniu zapewnia silniejsze wsparcie dla uzyskania wysokiej jakości danych krio-EM oraz wiarygodnych danych kinetycznych rezonansu plazmonu powierzchniowego/interferometrii biowarstw12.

W ciągu ostatniej dekady technologia nanodysku stała się potężnym narzędziem do badania białek błonowych w naturalnych środowiskach lipidowych. Na przykład Vilela i13 współpracowników stworzyli systematyczne ramy montażu nanodysku poprzez optymalizację warunków rekonstrukcji i weryfikację jakości końcowych komponentów. Konkretnie, połączyli chromatografię wykluczenia rozmiaru (SEC) z ilościowymi wskaźnikami (w tym efektywnością montażu i symetrią szczytów), aby obiektywnie ocenić jednorodność próbek13. Obecnie nanodyski stały się wszechstronną platformą. Stosując krio-EM pojedyncząstkowe do wykrywania złożonych białek rekonstytuowanych na nanodysku, można uzyskać struktury błonowe o wysokiej rozdzielczości i ich zastosowanie zostało utrwalone. Cecha gęstości podwójnego pierścieni w pasie MSP jest decydującym dowodem strukturalnym na skuteczne wiązanie 10,14,15. Ponadto nanodyski stanowią cenne narzędzie zarówno do analizy funkcjonalnej białek błonowych w środowiskach dwuwarstwowych lipidów, jak i ich zastosowania w badaniach rezonansu magnetycznego jądrowegoroztworu 16,17.

Protokół ten opisuje metodę składania ludzkiego białka błonowego Task2 w nanodysku. Human Task2 jest członkiem pH-gatedowanym członkiem rodziny kanałów K+ (K2 P) z domeną dwuporową K+ (K2P)18,19. Podobnie jak inne kanałyK2P, Task2 jest homodymerem z zamianą domeny, z każdym łańcuchem protomerowym zawierającym cztery helisy rozpięte przez błonę (TM1–TM4), dwie helisy porowe reentrantów (PH1 i PH2), dwa filtry selektywności (SF1 i SF2) oraz dwie zewnętrzno-formujące helisy (CH1 i CH2). Białko docelowe było skróconą formą Task2, pozbawioną aminokwasów C-terminalnych 166 — obszaru przewidywanego jako w dużej mierze nieustrukturyzowanego — co stwierdzono, że poprawia ekspresję białek i stabilność biochemiczną. Masa cząsteczkowa rekombinowanego Task2 wynosi około 72 kDa przy użyciu tagu GFP. Wcześniej został rozpuszczony i oczyszczony za pomocą detergentu. Był łączony z lipidami i MSP w precyzyjnie obliczonym stosunku stechiometrycznym. Po usunięciu detergentu za pomocą Bio-Beads próbka została dodatkowo oczyszczona chromatografią wykluczenia rozmiarowego (SEC), aby uzyskać preparat odpowiedni do kriogenicznej terapii (EM). Następnie wygenerowano dwuwymiarowe (2D) średnie klasy z danych krio-EM z pojedynczych cząstek, aby zweryfikować integralność próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie zapasu lipidowego

  1. Przygotowanie lipidów
    1. Przygotować mieszaniny lipidowe z użyciem trzech fosfolipidów: 1,2-Dioleoyl-SN-glicero-3-fosfoetanolaminy (DOPE), 2-oleoyl-1-palmitoylglicero-3-fosfocholiny (POPC) oraz 1-palmitoyl-2-oleoilofosfatydyseryny (POPS).
    2. Używaj gotowych roztworów tych lipidów w chloroformie, każdy w stężeniu 25 mg/mL.
      UWAGA: Przy obsłudze chloroformu wymagany jest osobisty sprzęt ochronny, a wszystkie procedury muszą być wykonywane w okapie spalinowym. Przechowuj chloroform w dedykowanej szafce chemicznej.
    3. Ze względu na lotność chloroformu, mierząc mikrostrzykawką, sprawdź, czy objętość roztworu lipidowego odpowiada pierwotnie zarejestrowanej objętości przed każdym użyciem. Jeśli nastąpi odparowanie, uzupełnij roztwór czystym chloroformem do pierwotnej objętości i dokładnie wymieszaj.
      UWAGA: Przed każdym pomiarem przepłukaj mikrostrzykawkę dwukrotnie chloroformem.
    4. Przygotuj mieszankę lipidową o pojemności 100 μL o stosunku masowym DOPE:POPC:POPS = 2:1:1. Na podstawie tego stosunku połącz 50 μL VDOPE, 25 μL VPOPC oraz 25 μL VPOPS. Zmierz odpowiadającą objętość zgodnie z obliczoną liczbą. Dodaj go do szklanej probówki i dokładnie wymieszaj.
    5. Umieść szklaną probówkę w kąpieli wodnej, aby ograniczyć ulotność chloroformu i utrzymać stabilną temperaturę otoczenia.
  2. Przygotowanie filmu lipidowego
    1. Odparuj chloroform pod delikatnym strumieniem azotu, aż cała ciecz zostanie usunięta i na dnie probówki utworzy się przezroczysta, jednorodna, żelowata folia.
      UWAGA: Upewnij się, że na dnie szklanej rurki widoczna jest jednolita, sucha warstwa lipidowa, bez pozostałości cieczy. Unikaj nadmiernego przepływu azotu, ponieważ może on powodować bąbelki i uniemożliwiać całkowite wyschnięcie chloroformu.)
    2. Dodaj około 2 mL n-pentanu kropelami do szklanej probówki. Następnie odparuj rozpuszczalnik metodą suszenia azotem opisaną w 1.2.1, aby uzyskać suchą, przezroczystą warstwę lipidową. n-Pentan jest odparowywany w szklanej probówce ze względu na swoją chemiczną obojętność i kompatybilność z rozpuszczalnikami organicznymi. Szkło zapobiega wymywaniu lub degradacji plastiku związanemu z wieloma plastikowymi materiałami laboratoryjnymi, zachowując czystość lipidów podczas formowania się warstw.
      UWAGA: n-Pentan musi być przechowywany w dedykowanej szafce odczynnikowej i, gdy jest używany, traktowany ostrożnie w okapie wyparowym, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego.
    3. Poluzuj nakrętkę probówki i umieść ją w próżniowym suszarce. Osuszaj osuszacz i utrzymuj go pod próżnią, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalników. Umieść samoczynny żel krzemionkowy na dnie osuszacza, aby pochłaniał wilgoć.
      UWAGA: Odparowanie pozostałości chloroformu i n-pentanu do wyschnięcia w okapowaniu.
  3. Nawodnienie lipidów i przygotowanie roztworu bulwarowego
    1. Usuń warstwę lipidową z próżniowego osuszacza i nawilż ją, dodając 250 μL buforu niskosolnego (LSB) bez detergentów (Tabela uzupełniająca 1). Daje to końcowe stężenie lipidów 10 mg/mL.
      UWAGA: Wybrano bufor na bazie jonów potasu, ponieważ Task2 to kanał jonowy potasowy
    2. Po ponownym zawieszeniu lipidu podziel go równomiernie na cztery szklane rurki i sonikuj zawiesiny, aż staną się przezroczyste i przejrzyste, co wskazuje na pomyślne powstanie liposomów (około 1,5 h). Wykonaj sonifikację z amplitudą 60%, stosując cykl 4 sekundy włączone i 6 sekund wyłączone.
    3. Zgromadzić roztwór klarowanego lipidu i zachować 1,5 mL w pojedynczych rurkach mikrowirówki. Natychmiast przepłucz przestrzeń nad głową każdej rurki gazem azotowym i przechowuj ją w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

2. Nadmierna ekspresja i oczyszczanie MSP

  1. Prokariotyczna ekspresja MSP
    1. Transformacja plazmidów: Użyj plazmidu MSP1D1 z tagiem 7×HIS, aby przekształcić komórki kompetentne do E. coli BL21 (DE3). Nakładaj mieszaninę transformacji na płyty agarowe Luria-Bertani (LB) zawierające kanamycynę (50 μg/mL) i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C, aby uzyskać pojedyncze kolonie.
    2. Amplifikacja hodowla: Wybierz pojedynczy klon i zaszczep go w 5 mL podłoża LB zawierającego kanamycynę oraz inkubuj przez noc w 37 °C z potrząsaniem. Zaszczep nocną hodowlę w płynnym medium LB w stosunku 1:100, następnie rosnąć w temperaturze 37 °C z potrząsaniem, aż gęstość optyczna na 600 nm (OD600) osiągnie 2,0–3,0.
    3. Indukcja ekspresji białek: Indukuj ekspresję MSP poprzez dodanie izopropylowego β-d-1-tiogalaktopyranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 0,5–1 mM. Kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 16 °C przez 16–20 godzin z potrząsaniem.
  2. Zakłócenia komórek
    1. Zbieranie pelletów: Wirówka kultury bakteryjnej w 4 °C przez 10 minut. Usuń supernatant i zachowaj pellet komórkowy.
    2. Liza bakterii: Ponownie zawiesijcie pellet uzyskany z 1 L hodowli w 100–150 mL buforu lizyzowego (Tabela Uzupełniająca 1). Dokładnie ujednolicz do uzyskania jednolitej zawieszki bez widocznych grudek. Dodaj PMSF do zawiesiny, aby hamować proteazy i zmniejszyć powstawanie pieni.
    3. Sonikowanie: Użyj chłodzonego ultradźwiękowego disruptora komórek, aby rozbić bakterie. Ustaw moc na 35% i stosuj cykle po 3 sekundy, po których następują 6 sekund przerw. Aby zapobiec przegrzaniu, pozwól na 2-minutowy odpoczynek po każdym 15 minutach łącznego czasu sonifikacji. Kontynuuj, aż lizat stanie się przezroczysty i jasnobrązowy.
    4. Wyjaśnienie: Wirówka lizatu w dawce 30 000 g przez 45 minut w 4 °C i pobieranie supernatantu do kolejnych etapów.
  3. Oczyszczanie MSP
    1. Przygotowanie żywicy Ni-NTA: Weź 3–5 mL żywicy Ni-NTA i zapakuj ją do kolumny grawitacyjnej (rozmiar: 26,4×134,8 mm). Przemyj żywicę objętościami 3 kolumny (CV) wody destylowanej i wyrównuj ją 3 CV buforu płukania 1 (Tabela Uzupełniająca 1).
    2. Wiązanie MSP z żywicą: Po wirowaniu lizatu komórkowego miesza się supernatant z wyrównaną żywicą Ni-NTA. Dodaj imidazol do końcowego stężenia 5 mM i inkubuj mieszankę w temperaturze 4 °C przez 2 godziny, delikatnie obracając w ciemności.
    3. Wash w celu usunięcia zanieczyszczeń: Sekwencyjnie przemywaj z gradientami Wash Buffer 1, Wash Buffer 2 (Tabela Uzupełniająca 1) i Wash Buffer 3 (Tabela Uzupełniająca 1), używając co najmniej 50 mL każdego bufora. Monitoruj absorpcję UV przy 280 nm (A 280) przepływu i kontynuuj płukanie, aż wartość A280 spadnie poniżej 0,01.
    4. Elution: Eluć docelowe białko buforem Elution (Tabela Uzupełniająca 1) i zebrać frakcje eluatu. Kontynuuj proces elucii, zbierając ułamki, aż A₂₈₀ eluatu spadnie poniżej 0,01.
    5. Monitorowanie i analiza procesów: Zbieraj próbki z kluczowych etapów oczyszczania — w tym supernatantu, osadu, przepływu, frakcji płukania i frakcji elucijnych. Przeanalizuj je za pomocą SDS-PAGE, aby ocenić efektywność oczyszczania (Rysunek Uzupełniający 1).
    6. Dializa w celu wymiany buforowej: Przelej zgromadzony eluat do rurek dializycznych i poddaj go buforowi dializyjnemu (Tabela Uzupełniająca 1) w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając przez noc.
    7. Ultrafiltracja i stężenie: Skoncentruj roztwór zdializowany za pomocą urządzenia ultrafiltracyjnego do końcowego stężenia MSP 2–5 mg/mL. Oczyszczony i skoncentrowany MSP jest obecnie gotowy do użycia w montażu nanodysków błonowych białek.

3. Aktywacja bio-koralików

  1. Ważenie
    1. Waż około 250 mg Bio-Beads w rurce wirówki o pojemności 50 mL przy użyciu wagi analitycznej.
  2. Płukania metanolowe
    1. Dodaj 25–30 ml metanolu do rurki. Dokładnie obróć lub zawortuj mieszankę w ciemności, a następnie inkubuj przez 20 minut. Ostrożnie odrzuć supernatant po inkubacji.
    2. Powtórz ten etap mycia metanolem łącznie trzy razy.
      UWAGA: Ze względu na lotność metanolu, procedura ta musi być wykonywana w okapie oparowym z odpowiednim środkiem ochrony osobistej. Zbieraj zużyty metanol i traktuj go jako biologiczną ciecz odpadową.
  3. Przepływy wodne
    1. Dodaj 25–30 mL ddH2O do koralików. Potrząśnij lub obróć tubę, aby wymieszać i inkubować przez 20 minut.
    2. Usuń nadmiar. Powtórz ten etap mycia wodą trzy razy.
  4. Równowaga z LSB
    1. Dodaj 25–30 ml bezdetergentowego LSB do kulek. Potrząsaj lub obróć tubkę na obracającym się stole, aby wymieszać i inkubować przez 20 minut.
    2. Usuń nadmiar. Powtórz ten krok równoważenia LSB trzy razy, aby w pełni ukształtować kulki.
  5. Alicytat i przechowywanie
    1. Podziel aktywowane Bio-Kulki równomiernie na trzy mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Upewnij się, że koraliki pozostają nawilżone niewielką ilością LSB.
    2. Owiń rurki folią aluminiową, aby chronić je przed światłem i przechowuj na lodzie do natychmiastowego użycia.

4. Montaż nanodysku

  1. Przygotowanie lipidów i MSP
    1. Oczyszczanie zapasów lipidowych: Pobierz jedną alikwotę przygotowanego zapasu lipidowego i rozmroz go. Natychmiast odwiruj probówkę w 7 000 x g przez 5 sekund w 4 °C, aby zebrać zawartość na dnie.
    2. Ultrasonikuj w kąpieli wodnej i monitoruj klarowność oraz temperaturę co 5–10 minut, aby zapobiec przegrzaniu. Wykonaj sonifikację z amplitudą 60%. Ultrasonikuj lipidowy zapas, aż stanie się przezroczysty i przejrzysty.
    3. Rozmrażanie MSP: Rozmrażanie 1 aliquota przygotowanego roztworu MSP w kąpieli lodowodowodniej.
  2. Przygotuj bufor zgodnie z stosunkiem stechiometrycznym.
    1. Ilościowa ilość białka błonowego: Wyizoluj oczyszczone białko błonowe (Zadanie 2), rozpuszczone w 0,025% DDM/0,005% CHS, za pomocą chromatografii wykluczenia rozmiaru (SEC). Wstrzyknąć objętość próbki 500 μL z przepływem 0,5 mL/min do kolumny Superose 6 Increase (Cytiva). Zbierz szczyt eluujący w 14,8 mL i skoncentruj go (Rysunek 1). Określ stężenie białka za pomocą NanoDrop.
    2. Oblicz ilość trzonowca białka: Oblicz molową ilość (n) białka błony docelowej według wzoru: n = C × V, gdzie C to stężenie molowe, a V to objętość.
    3. Określ MSP i objętości lipidów: Oblicz wymagane objętości roztworów MSP i zapasów lipidów na podstawie molowego stosunku stechiometrycznego białka docelowego: MSP : lipid = 1 : 5 : 250.
    4. Przygotuj mieszankę główną: Na podstawie wyników obliczeń połącz odpowiednie objętości lipidów i MSP, aby przygotować mieszankę główną o pojemności 300 μL.
      UWAGA: Upewnij się, że w tej mieszance jest detergent, aby utrzymać stężenie zgodne z roztworem białkowym, zapobiegając tym samym przedwczesnemu agregacji.
  3. Usuwanie detergentów i montaż nanodysku
    1. Inkubacja początkowa z mieszanką rekonstytucyjną: Inkubuj przygotowany bufor mieszanki (Tabela uzupełniająca 1) na lodzie przez 10 minut. Następnie powoli dodaj 50 μL mieszanki do skoncentrowanego roztworu białkowego, delikatnie mieszając przez pipetowanie, aby zapewnić jednorodność.
    2. Wyrównanie mieszaniny białko-lipidowej: Umieść połączoną mieszankę na lodzie na 1 godzinę. Delikatnie odwracaj tubkę co 15 minut, aby dokładnie wymieszać.
    3. Pierwsza inkubacja z bio-kulkami: Krótko wiruj mieszankę w 7 000 x g przez 5 sekund w temperaturze 4 °C, aby zebrać roztwór białkowy na dnie probówki. Weź jedną alikwotę z preaktywowanych Bio-Kulek, aspiruj resztki LSB, dodaj roztwór białkowy do kulek i inkubuj w ciemności przez 1 godzinę, aby zapobiec degradacji białka wywołanej światłem.
    4. Druga inkubacja z bio-kulkami: Wiruj mieszankę w 7 000 x g przez 5 sekund w 4 °C, a następnie ostrożnie przelej supernatant do drugiej aliquoty Bio-Beads (z której również zasysano LSB) i dobrze wymieszaj przez delikatną inwersję w ciemności przez 4–8 godzin lub przez noc.
    5. Ostateczna inkubacja z Bio-Kulkami: Pobierz roztwór białkowy po inkubacji przez noc, krótko go odwiruj i przelej supernatant do trzeciej i ostatniej części preaktywowanych Bio-Kulek. Inkubuj z rotacją w temperaturze 4 °C w ciemności przez 1 godzinę.
    6. Po krótkim wirowaniu przelej supernatant do czystej rurki mikrowirówki i wiruj w temperaturze 17 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut, aby usunąć kruszywo.
      UWAGA: Utylizuj zużyte bio-kulki jako odpady biologiczne.
    7. Oczyszczanie nanodysków: Oczyść kompleksy nanodysków Task2 za pomocą chromatografii wykluczenia rozmiaru (SEC): Wstrzyknąć objętość próbki 500 μL z przepływem 0,5 mL/min do kolumny Superose 6 Increase i pobrać pik uwolniający w 15 mL (Rysunek 2).
    8. Stężenie produktu końcowego: Zgromadzić pikowe frakcje z elucii SEC i skoncentrować je do końcowego stężenia nanodysku Task2 na poziomie 1,2–1,5 mg/mL, odpowiedniego do przygotowania próbek kriogenicznych.

5. Weryfikacja, że montaż nanodysku jest pomyślny

  1. Analiza SDS-PAGE: Próbki aliquotów z frakcji oczyszczonych przez SEC.
    1. Przeanalizuj próbki przy użyciu 12% SDS-PAGE, aby potwierdzić obecność kluczowych składników (np. MSP i docelowego białka błonowego), co wskazuje na pomyślny montaż nanodysku (Rysunek 3).
  2. Przygotowanie i analiza próbek krio-EM.
    1. Skoncentruj pomyślnie złożoną próbkę do końcowego stężenia 1,2–1,5 mg/mL do przygotowania próbki kriogenicznej.
    2. Rozpocznij od wirowania próbki w temperaturze 17 000 x g i 4 °C przez 10 minut. Na świeżo rozświetlone złote siatki Quantifoil R1.2/1.3 (siatka 300, dziurkowy węgiel) naniesie kroplę 3 μL.
    3. Inkubuj w temperaturze 4 °C i wilgotności 100% przez 5 sekund. Osusz siatkę na 4 sekundy w Vitrobot Mark IV i zanurz w ciekłym etanie utrzymywanym w temperaturze ciekłego azotu.
    4. Zbieraj stosy filmów o superrozdzielczości za pomocą oprogramowania EPU na krio-EM Titan Krios G4 pracującym przy napięciu 300 kV i wyposażonym w bezpośredni detektor elektronów Falcon G4i.
    5. Ustaw czas naświetlania na 2,78 s, co odpowiada rozmiarowi piksela 0,73 Å (165k ×) i całkowitej dawce akumulowanej około 50 e⁻/Å2 na stos filmowy EER.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne przygotowanie zapasu lipidowego było widoczne przez utworzenie przezroczystego, przezroczystego roztworu po sonikacji. W MSP chromatografia niklowo-powinowactwa dała produkt o wysokiej czystości o stężeniu około 3 mg/mL. Montaż nanodysków został potwierdzony przez SEC, który wykazał charakterystyczny profil elucji (Rysunek 2). W porównaniu z profilem SEC Task2 uzyskanym przed montażem nanodysku (Rysunek 1), pik białka przesuwa się do większej objętości elucyjnej (późniejszej elucji)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta służy do rekonstytucji białek błonowych rozpuszczalnych w detergentach w nanodysku poprzez usuwanie detergentów, co zapewnia bardziej natywne środowisko lipidowe dwuwarstwowe. Sukces tego procesu montażu zależy od kilku kluczowych czynników. Najważniejszym z nich jest precyzyjny stosunek stechiometryczny między białkiem błonowym, MSP i lipidami. Nieprawidłowe stosunki stechiometryczne mogą prowadzić do agregacji białek lub nieudanego składania. Na przykład pierwsza próba złożenia nanodysków z użyciem proporcji ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują pracownikom Centrum kriogenicznej EM na Uniwersytecie Henan oraz profesorowi Wei Wangowi za ich fachowe wsparcie. Finansowanie zapewniła Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych Chin (granty 32371261 dla B.L. i 32301011 dla R.Z.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bio-koralikiBio-rad1523920
Hemisukcynian cholesterioluAnatraceCH210
ChloroformŚrodek sinoreagentZastosowanie w okapie wyparowym
SUPERAvanti850725P
MetanolŚrodek sinoreagent
n-Dodecyl-beta-D-maltozydAnatraceD310
N-pentanAdamasZastosowanie w okapie wyparowym
POPCAvanti850457P
POPSAvanti840034P
SECBio-radStosuj się do protokołu producenta w zakresie prawidłowego stosowania
Rurka do dializ SnakeSkinThermo68011
Superose  6 Increase10/300 GLCytiva29091596
Kolumny spinowe ultrafiltracji Amicon ultra-15MilliporeUFC905008

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nat. Rev. Drug Discov. 10 (8), 579-590 (2011).
  2. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  3. Dodd, R., Schofield, D. J., Wilkinson, T., Britton, Z. T. Generating therapeutic monoclonal antibodies to complex multi-spanning membrane targets: overcoming the antigen challenge and enabling discovery strategies. Methods. 180, 111-126 (2020).
  4. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. MAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  5. Kotov, V., et al. High-throughput stability screening for detergent-solubilized membrane proteins. Sci. Rep. 9 (1), 10379(2019).
  6. Barrera, N. P., Zhou, M., Robinson, C. V. The role of lipids in defining membrane protein interactions: insights from mass spectrometry. Trends Cell Biol. 23 (1), 1-8 (2013).
  7. Bayburt, T., Grinkova, Y., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Lett. 2 (8), 853-856 (2002).
  8. Carlson, J. W., Jonas, A., Sligar, S. G. Imaging and manipulation of high-density lipoproteins. Biophys. J. 73 (3), 1184-1189 (1997).
  9. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).
  10. Vinogradova, O. Nanodiscs and solution nuclear magnetic resonance. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103067(2025).
  11. Popot, J. L. Amphipols, nanodiscs, and fluorinated surfactants: three nonconventional approaches to studying membrane proteins in aqueous solutions. Annu. Rev. Biochem. 79, 737-775 (2010).
  12. Li, S. Detergents and alternatives in cryo-EM studies of membrane proteins. Acta Biochim. Biophys. Sin. 54 (8), 1049-1056 (2022).
  13. Vilela, F., Sauvanet, C., Bezault, A., Volkmann, N., Hanein, D. Optimizing transmembrane protein assemblies in nanodiscs for structural studies: a comprehensive manual. Bio Protoc. 14 (21), e5099(2024).
  14. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid nanodiscs as a tool for high-resolution structure determination of membrane proteins by single-particle cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  15. Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. Nanodisc-reconstitution for single particle cryo-EM structure determination of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103072(2025).
  16. Yokogawa, M., Fukuda, M., Osawa, M. Nanodiscs for structural biology in a membranous environment. Chem. Pharm. Bull. 67 (4), 321-326 (2019).
  17. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  18. Enyedi, P., Czirják, G. Molecular background of leak K+ currents: two-pore domain potassium channels. Physiol. Rev. 90 (2), 559-605 (2010).
  19. Reyes, R., et al. Cloning and expression of a novel pH-sensitive two pore domain K+ channel from human kidney. J. Biol. Chem. 273 (47), 30863-30869 (1998).
  20. Notti, R. Q., Walz, T. Native-like environments afford novel mechanistic insights into membrane proteins. Trends Biochem. Sci. 47 (7), 561-569 (2022).
  21. Pocanschi, C. L., Kleinschmidt, J. H. The thermodynamic stability of membrane proteins in micelles and lipid bilayers investigated with the ferrichrom receptor FhuA. J. Membr. Biol. 255 (4-5), 485-502 (2022).
  22. Hiotis, G., Notti, R. Q., Bao, H., Walz, T. Nanodiscs remain indispensable for cryo-EM studies of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 92, 103042(2025).
  23. Nakao, K., et al. Home is where the lipids are: a comparison of MSP and DDDG nanodiscs for membrane protein research. Soft Matter. 21 (33), 6596-6602 (2025).
  24. Dalal, V., et al. Lipid nanodisc scaffold and size alter the structure of a pentameric ligand-gated ion channel. Nat. Commun. 15 (1), 25(2024).
  25. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  26. Tao, X., Zhao, C., MacKinnon, R. Membrane protein isolation and structure determination in cell-derived membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 120 (18), e2302325120(2023).
  27. Zhang, S., et al. One-step construction of circularized nanodiscs using SpyCatcher-SpyTag. Nat. Commun. 12 (1), 5451(2021).
  28. Ren, Q., et al. DeFrND: detergent-free reconstitution into native nanodiscs with designer membrane scaffold peptides. Nat. Commun. 16 (1), 7973(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technologia nanodyszk wbia ka rusztowaniowe b ondwuwarstwa lipidowakana potasowy Task2rekonstytucja bia ekchromatografia wykluczania cz steczekSDS PAGEkriomikroskopia elektronowaoczyszczanie bia ek

Powiązane artykuły