Fructus xanthii Ekstrakt łagodzi chorobę zwyrodnieniową stawów poprzez zachowanie integralności chrząstki

Podsumowanie

Protokół tego badania został zaprojektowany w celu systematycznego zbadania potencjalnych chondroprotectywnych efektów ekstraktu Fructus Xanthii w osteoartrozie poprzez zintegrowane analizy multi-omiczne i eksperymenty in vivo.

Streszczenie

Osteooartroza (OA) jest postępującym, zwyrodnieniowym zaburzeniem stawowym, dla którego obecne interwencje farmakologiczne i chirurgiczne głównie łagodzą objawy, zamiast odwrócić podstawowe zmiany patologiczne, co podkreśla pilną potrzebę nowych środków terapeutycznych. Niniejszy protokół miał na celu zbadanie potencjalnych chondroprotekcyjnych efektów ekstraktu z Fructus Xanthii przeciwko OA. Po pierwsze, nieukierunkowane profilowanie metabolomiki przeprowadzono za pomocą chromatografii cieczowej ultra-wysokiej wydajności połączonej z tandemową spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UHPLC-HRMS/MS) w celu scharakteryzowania składników chemicznych ekstraktu. Następnie zastosowano zintegrowaną strategię łączącą farmakologię sieciową i głębokie przeszukiwanie transkryptomu w celu zidentyfikowania aktywnych biologicznie składników i przewidywanych celów ekstraktu, po czym przeprowadzono analizę krzyżową z genami dysregulowanymi związanymi z OA w celu uzyskania genów docelowych rdzeniowych. Analizy wzbogacenia Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) zostały przeprowadzone w celu adnotacji głównych procesów biologicznych i szlaków sygnałowych modulowanych przez ekstrakt. Do walidacji in vivo wykorzystano modele uszkodzeń chrząstki u rybki labiryntkowej i modele OA u myszy w celu oceny chondroprotekcyjnych efektów ekstraktu. Sekwencjonowanie RNA (RNA-seq) zostało dodatkowo zastosowane do analizy zmian transkryptomowych w chondrocitach po leczeniu, koncentrując się na szlakach związanych z OA i profilach ekspresji genów; następnie przeprowadzono enzymową próbę immunosorbentową (ELISA) w celu zweryfikowania poziomów ekspresji kluczowych białek/receptorów przesiewanych przez RNA-seq, aby dalsze potwierdzić efekty regulacyjne ekstraktu z Fructus Xanthii na rdzeniowe cele OA. Niniejszy zintegrowany protokół wieloukładowy i eksperymentalny zapewnia systemowe podejście do badania potencjału ekstraktu z Fructus Xanthii jako obiecującego botanicznego kandydata do interwencji w OA.

Wprowadzenie

Zwyrodnienie stawów (OA) jest zaburzeniem zwyrodnieniowym stawów charakteryzującym się postępującą degradacją chrząstki stawowej, stwardnieniem kości podstawowej, zapaleniem błony maziowej i tworzeniem ostefitów¹. Zgodnie z badaniem Global Burden of Disease (GBD), częstość występowania OA stale wzrosła w 204 krajach i terytoriach w latach 1990–2020², a trend ten ma się przyspieszyć wraz z globalnym starzeniem się populacji³. Obecne szacunki wskazują, że ponad 250 milionów osób na całym świecie jest dotkniętych tym schorzeniem, co powoduje znaczne obciążenie dla dobrego samopoczucia jednostek, systemów opieki zdrowotnej i struktur społeczno-ekonomicznych⁴. Obecne leczenie skupia się głównie na łagodzeniu objawów, a najczęściej stosowanymi interwencjami są niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) i dostawy do stawów kwasu hialuronowego (HA) w celu zwiększenia lepkości mazi stawowej^5,6. Niestety, te podejścia oferują ograniczony efekt kliniczny i wiążą się z znacznymi działaniami niepożądanymi^5,6. Podkreśla to krytyczną potrzebę opracowania skutecznych leków modyfikujących przebieg choroby (DMOADs).

Tradycyjna Medycyna Chińska (TCM) od dawna jest stosowana w leczeniu OA, opierając się na koncepcji „kości bi”, podtypu „syndromu bi”⁷. W tym ujęciu patogeneza OA jest przypisywana głównie niedoborowi esencji wątroby i nerki, niedostateczności qi i krwi oraz następczemu najeździe wiatru, zimna i wilgoci⁸. W związku z tym, strategie terapeutyczne koncentrują się na rozpraszaniu wilgoci i wiatru, rozpraszaniu zimna i odblokowywaniu kanałów⁹. Leczenia TCM cenione są za ich działanie wielocelowe, korzystne działania uboczne oraz klinicznie znaczącą skuteczność¹⁰. Warto wymienić takie preparaty jak Kapsułki Buqi Tongluo (BQTL) i Dekokcja Fuzi (FZD), które wykazały wyraźne działanie przeciw OA w praktyce klinicznej, podczas gdy Du Huo Ji Sheng Tang (DHJST) łagodzi objawy OA poprzez hamowanie szlaku inflammasomu NLRP3, co jest potwierdzone wielowiekowym doświadczeniem empirycznym. Podobnie, Mieszanka Shenjinhuoxue (SHM) łagodzi ból i zwyrodnienie chrząstki poprzez obniżenie ekspresji prozapalnych mediatorów takich jak IL-1β i TNF-α^11,12,13. Na poziomie monomerów, związki takie jak icariina (Cyanoside A, CyA) i erianina, pochodzące z roślin leczniczych, miały wpływ na proliferację chondrocytów, hamowanie uwalniania cytokin zapalnych i utrzymanie homeostazy stawów^14,15. Łącznie, TCM oferuje kompleksowe podejście terapeutyczne z właściwościami przeciwzapalnymi, chondro-ochronnymi i łagodzącymi objawy. Jednakże, złożoność mechanizmów i problemy związane z standaryzacją wymagają ciągłych i rygorystycznych badań.

Suszone dojrzałe owoce Fructus Xanthii (Compositae), powszechnie znane jako „Cang-Er-Zi”, zostały udokumentowane jako wykazujące szeroki zakres działań farmakologicznych, w tym przeciwdrobnoustrojowe, przeciwzapalne, przeciwutleniające, przeciwbólowe, przeciwnowotworowe i immunomodulujące¹⁶. Kwasy fenolowe izolowane z Fructus Xanthii skutecznie zmniejszają nadmierną proliferację błony maziowej w reumatoidalnym zapaleniu stawów (RA)¹⁷. Wśród nich, kwas chlorogeniczny (CGA), reprezentatywny pochodny kawoilchinolinowych, stymuluje proliferację i różnicowanie osteoblastów, hamując jednocześnie osteoklastogenezę pośredniczoną przez RANKL, utrzymując w ten sposób homeostazę szkieletu¹⁸. Inne kwasy fenolowe zidentyfikowane w tym samym ekstraktach, takie jak neochlorogenic acid (5-CQA), kryptochlorogenic acid (CCA) i kwas protokatechuowy, również wykazują działanie przeciwdrobnoustrojowe, przeciwzapalne, przeciwnowotworowe i przeciwutleniające^19,20,21. Oprócz kwasów fenolowych, różne metabolity wtórne obecne w Cang-Er-Zi przyczyniają się do tych działań biologicznych^{16,20,22,23,24,25}. Jednakże, dokładna rola i podstawowe mechanizmy działania ekstraktu Fructus Xanthii w OA pozostają w dużej mierze niezbadanymi.

Nieukierunkowana chromatografia ciekła z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) w metabolomice charakteryzuje się możliwością bez hipotezowego, przepływowego i globalnego zakresu. Umożliwia jednoczesne wykrywanie tysięcy cech metabolitów, zapewniając panoramiczny widok sieci metabolicznych, i pozwala na systematyczne odkrywanie nowych biomarkerów i aberracyjnych szlaków metabolicznych bez wcześni

Protokół

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem próbek klinicznych i myszy przeprowadzono zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet Etyczny ds. Badań nad Biotechnologią Medyczną w Shandong Provincial Medical Biotechnology Research Center. Użyte odczynniki i sprzęt są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Izolacja i hodowlą ludzkich chondrocytów stawowych

Próbki ludzkiego chrząstki stawowej uzyskano od pacjentów poddawanych operacjom artroskopowym lub zastępczej operacji stawu w Pierwszym Szpitalu Uniwersyteckim Shandong First Medical University. Kawałki chrząstki były transportowane do laboratorium na lodzie w ciągu 30 min od wycięcia podczas operacji. Tkankę dokładnie przemyto zimnym buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS; 3–5 przemywania), a następnie drobno posiekano za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych do fragmentów o wymiarach około 1 mm³. Przeprowadzono sekwencyjną enzymatyczną digezję, zaczynając od predygezji za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA przez 30 min w 37 °C. Proces digezji był monitorowany aż do momentu, gdy fragmenty chrząstki stały się cieńsze, zmniejszyły się w rozmiarze i stały się przezroczyste, po czym fragmenty chrząstki zebrano przez wirowanie (200 × g, 5 min) w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadzono nocną digezję (8 h, 37 °C) z 0,2% kolagenazą typu II pod ciągłym delikatnym wstrząsaniem. Proces digezji był monitorowany aż do całkowitego rozpuszczenia wszystkich makroskopowo widocznych fragmentów chrząstki. Uwolnione komórki zebrano przez wirowanie (200 × g, 5 min) w temperaturze pokojowej, ponownie zawieszono w pełnym DMEM uzupełnionym o 10% sterowane płodowe surowicy wołowej, 100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny i wysiano do 75 cm² kolb hodowlańczych. Komórki utrzymywano w 37 °C w zwilżonej atmosferze zawierającej 5% CO₂. Adherujące chondrocyty oddzielono za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA, a komórki były poddawane podziałowi w stosunku 1:3, gdy adherujące komórki osiągnęły 80% konfluencji powierzchni kolby hodowlańczej.

2. Przygotowanie ekstraktu z Fructus Xanthii

Wysuszone dojrzałe owoce Xanthium strumarium L. (Fructus Xanthii) zebrano z naturalnie występujących populacji w północnych Chinach i zostały uwierzytelnione przez starszego farmakologa. Proba została zdeponowana w zielniku Shandong First Medical University. 20 g drobno zmielonych Fructus Xanthii umieszczono w lejku ekstrakcyjnym, a wyczerpującą ekstrakcję Soxhleta przeprowadzono za pomocą 95% etanolu (około 250 ml) aż do ukończenia siedmiu do ośmiu cykli syfonowych. Ekstrakt etanolowy przefiltrowano, a filtrate skoncentrowano do suchości pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze 45 °C za pomocą wirówki rotującej. Powstały osad przetrząsnięto w 60 ml podwójnie destylowanej wody i sukcesywnie podziałano za pomocą 60 ml ethylooctanu w lejku oddzielającym. Mieszaninę energicznie wstrząsnięto i pozostawiono do oddzielania fazowego w 4 °C przez 24 h. Następnie zebrano warstwę wodną, wysuszono ją liofilizując i przechowywano w -80 °C do dalszego użycia.

3. Standaryzowany przepływ pracy dla niecelowej metabolomiki LC-MS/MS

1. Analiza metabolomiki niecelowej oparta na UHPLC-HRMS/MS
   Profilowanie metabolomiki niecelowej przeprowadzono na platformie ultra-wysokowydajnej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UHPLC-HRMS/MS). Metabolity szybko zgaszono i wyekstrahowano za pomocą chłodzonego systemu metanol-woda. Rozdzielanie chromatograficzne osiągnięto na systemie UHPLC wyposażonym w kolumnę chromatograficzną C18/T3 (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) utrzymywaną w 40 °C. Zastosowano gradient binarny (0–28 min) składający się z 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (A) i 0,1% kwasu mrówkowego w acetonie (B) przy przepływie 0,3 ml/min. Wykrywanie spektrometryczne mas przeprowadzono na hybrydowym urządzeniu z czterema elektrodami-Orbitrap działającym w trybie pełnego skanowania MS/zależnego od danych MS2 (Full MS/dd-MS2) z pełnym zakresem skanowania m/z 70–1050 i rozdzielczością 120 000 (FWHM przy m/z 200). Fragmentację z wyższą energią zderzeń (HCD) przeprowadzono przy 20, 40 i 60 eV, z dynamicznym wyłączeniem ustawionym na 10 s.
2. Surowe dane przekształcono na format mzXML za pomocą ProteoWizard. Wybór szczytów, dopasowanie czasu retencji i usuwanie izotopów przeprowadzono w XCMS Online przy użyciu parametrów zoptymalizowanych dla HRMS (ppm = 5, bw = 5, snthresh = 6). Wykluczono funkcje zawierające więcej niż 50% brakujących wartości wśród próbek i normalizowano pozostałe obszary szczytów do całkowitego prądu jonów (TIC). Metabolity zaanotowano przez dopasowanie dokładnej masy, widm MS2 i czasu retencji do wewnętrznej bazy danych referencyjnych z tolerancją błędu masy ≤ 5 ppm i progiem wyniku iloczynu skalarnego ≥ 80.
   UWAGA: Przez cały przepływ pra

Wyniki

Ocena jakości i krajobraz metabolizmu danych LC-MS/MS bezcelowych

Próbki QC wykazały doskonałą odtwarzalność, co potwierdzają bardzo nakładające się chromatogramy TIC zarówno w trybie jonów dodatnich, jak i ujemnych, przy czym dryf czasu retencji pozostawał poniżej 0,05 min w całym analitycznym paczce. Dane surowe przeszły przetwarzanie wstępne oparte na XCMS, które obejmowało wykrywanie szczytów, integrację i ujednolicenie czasu retencji. Putatywne metabolity zostały zanotowa...

Dyskusja

OA jest rozpowszechnionym zwyrodnieniowym zaburzeniem stawu i jedną z głównych przyczyn niepełnosprawności na całym świecie³⁶. Jego patogeneza jest złożona i wieloczynnikowa, obejmująca biochemiczne, komórkowe i molekularne zmiany w tkankach stawowych. Kiedyś uważano ją za prosty zjawisko "zużycia" chrząstki stawowej, OA jest obecnie powszechnie rozpoznawana jako przewlekła, cało-stawowa choroba charakteryzująca się degradacją chrząstki, stanem zapalnym błony maziowej, tworzeniem się wyrostków kos...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4% PFA	Biosharp, China	BL539A	pH 7.4, sterylne
C57BL/6 Mice	Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd, China	N/A	Male, 8-10 weeks old, 20-25g
Chondroitin sulfate	MCE, America	HY-B2162	Purity ≥98%
ClusterProfiler (R Package)	Bioconductor	Dostęp bezpłatny	Zintegrowane z R v4.2.2
Collagenase, Type II, powder	Gibco, America	17101015	≥125 U/mg
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Dostęp bezpłatny (https://cytoscape.org/)	v3.9.1 (z CytoHubba)
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Dostęp bezpłatny	Wersja 3.9.1
DESeq2 (R Package)	Bioconductor	Dostęp bezpłatny	Zintegrowane z R v4.2.2
DMEM, high glucose	Gibco, America	11965092	Środki sterylne
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China	10009218	Stopień analityczny, 95%
Ethyl acetate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China	10009418	Stopień analityczny
Fetal bovine serum (FBS)	Cellmax, China	SA102.02	Inaktywowane termicznie
Fluorescence Microscope	Nikon, Japan	Eclipse Ti2-U	Wyposażone w filtr GFP (488nm wzbudzenie) & aparat cyfrowy
GEO Database	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r	Narzędzie analizy GEO2R
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC, America	Komercyjne	Wersja 9.5.1
Hematoxylin-Eosin(HE) Stain Kit	Solarbio, China	G1120	Gotowy zestaw
HERB Database	Chinese Academy of Sciences	http://herb.ac.cn/	V2.0
Human MMP-1 ELISA Kit	Yamei Biotechnology, China	HJ088	Dla ludzi, płytka 96-well
Human Progesterone Receptor (PR) ELISA Kit	Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., China	ml05997	Dla ludzi, płytka 96-well
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	Dostęp bezpłatny	Wersja 1.53t
Light Microscope	Olympus, Japan	BX53	Obiektywy 10×/20× & aparat cyfrowy
Lyophilizer	Christ, Germany	Alpha 1-4 LDplus	System liofilizujący
Modified Saffron-O And Fast Green Stain Kit	Solarbio, China	G1120	Do barwienia kości/chrząstki
Neutral Balsam	Solarbio, China	G8590	Środek montażowy
Penicillin-Streptomycin	Gibco, America	15070063	100×, sterylne
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sparkjade, China	CR0013-500ML	pH 7.2-7.4, sterylne
R software	R Foundation for Statistical Computing	Dostęp bezpłatny (https://www.r-project.org/)	v4.4.1 (z ggvenn)
Serum-free Cell Freezing Medium	Biosharp, China	BL203B	Sterylne
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 25923	Sztam standardowy
STRING Database	STRING Consortium	https://string-db.org/	Analiza interakcji białkowych
TCMID Database	Shaanxi Qinling Qiyao Collaborative Innovation Center	https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php	V3.0
Tg(col2a1a:EGFP) Zebrafish	Zebrafish International Resource Center (ZIRC)	N/A	Larwy (2 dpf), odmiana AB
TRIzol Reagent	Thermo Fisher, America	15596018CN	Do ekstrakcji całkowitego RNA
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco, America	25200056	Roztwór sterylny
Ultra-high Performance Liquid Chromatography (UHPLC)	Thermo Fisher, America	Q Exactive Focus	Sparowane z HRMS/MS
XCMS-online	Scripps Research Institute	Dostęp bezpłatny	Platforma internetowa