Bex-Plex Umożliwia jednoczesne wizualizowanie markerów białkowych i transkryptów kwasów rybonukleinowych dla głębokiego profilowania przestrzennego nienaruszonych tkanek

Summary

Przedstawiamy tutaj protokół łączenia iteracyjnego barwienia białek (IBEX) z technologią hybrydyzacji in situ RNAscope dla głębokiego przestrzennego fenotypowania nienaruszonych zamrożonych tkanek do zastosowań o wysokiej rozdzielczości profilowania przestrzennego.

Abstract

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający jednoczesne przestrzenne profilowanie markerów białkowych i kwasów rybonukleinowych (RNA) z rozdzielczością pojedynczych komórek w nienaruszonych tkankach. Jednym z głównych problemów związanych z rakiem tkanki twardej jest niemożność przewidywania reakcji pacjenta na interwencję terapeutyczną. Rozwikłanie tych złożonych problemów wymaga ilościowego pomiaru zachowań komórkowych, interakcji i fenotypu w nienaruszonych tkankach. W szczególności proteom i transkryptom dostarczają pokrywających się, ale nieredundantnych informacji, które mogą być kluczowe dla projektowania racjonalnych immunoterapii. Jednak obecnie nie ma prostego i opłacalnego sposobu na głębokie profilowanie zarówno stanu transkrypcyjnego, jak i funkcjonalnego wszystkich komórek w mikrośrodowisku guza, zachowując ich krytyczne informacje o lokalizacji przestrzennej. W tym celu z powodzeniem połączyliśmy platformę IBEX (iteracyjne blanszowanie zwiększa wielość) z HiPlex RNAscope, aby jednocześnie wizualizować markery białkowe i transkrypty kwasów rybonukleinowych (RNA) z wysoką wielością z rozdzielczością pojedynczych komórek. To podejście obejmuje zmodyfikowany krok odzyskiwania docelowego RNA, aby zachować morfologię jądra i umożliwić dokładne wyrównanie obrazu między cyklami. “Bex-Plex” pozwala nam na wykonanie niezmodyfikowanego protokołu IBEX na zamrożonych tkankach po czym protokół HiPlex RNAscope, w którym stosujemy zmodyfikowany krok odzyskiwania docelowego RNA, aby zapewnić wyrównanie na poziomie jądra z cyklami IBEX. Ten protokół jest zoptymalizowany dla zamrożonych tkanek i umożliwia zintegrowaną przestrzenną analizę stanów komórkowych transkrypcyjnych i funkcjonalnych. Możliwość profilowania na tym poziomie pojedynczych komórek nie tylko dostarcza głębokiego źródła informacji o tkankach, ale może również umożliwić przewidywania dotyczące subtelnych interakcji komórkowych, które napędzają reaktywność terapeutyczną, zapewniając ramy dla badania biologii przestrzennej w mikrośrodowiskach nowotworowych i powiązanych systemach.

Introduction

Od czasu ich wprowadzenia w 2011 roku, immunoterapie nowotworów, które zmniejszają supresję cytotoksycznych limfocytów T poprzez blokowanie inhibitorów cząstek kontrolnych odporności, takich jak PDL-1 i CTLA-4, stały się standardem złotym w leczeniu guzów zwłóknionych¹. Jednak pomimo szerokiego stosowania u pacjentów, kliniczne efekty tych leków różnią się znacznie, ponieważ wiele nowotworów zwłóknionych albo wrodzona ma albo ostatecznie generują odporność na te terapie². W wielu przypadkach jest to spowodowane niezwykle zróżnicowaną naturą guzów zwłóknionych, nawet wśród tego samego rodzaju raka³. Bardziej szczegółowe zrozumienie relacji komórkowych zachodzących w guzach zwłóknionych jest kluczowym elementem do opracowania lepszych metod leczenia. Dlatego też, zidentyfikowanie dokładnych mechanizmów i interakcji, które generują i utrzymują tę odporność, jest na czołowej pozycji badań nad rakiem. W tym miejscu, naszym celem jest opracowanie metody, która umożliwi zintegrowaną przestrzenną analizę ekspresji białek i RNA w nienaruszonych tkankach, aby lepiej scharakteryzować te złożone interakcje komórkowe.

Mikrośrodowisko nowotworowe (TME) składa się z nierakowych komponentów komórkowych i strukturalnych, które kształtują wzrost guza i odpowiedź immunologiczną, w tym fibroblastów związanych z rakiem, napływających komórek odpornościowych, komponentów naczyniowych i macierzy pozakomórkowej⁴. Ostatnio stało się jasne, że skład i organizacja TME wpływa znacząco na to, czy guzy są dopuszczalne czy odporne na infiltrację immunologiczną, co jest jednym z głównych czynników decydujących o odpowiedzi na immunoterapię⁵. W wielu przypadkach raka, fenotyp “pustyni immunologicznej”, charakteryzujący się niską liczbą limfocytów T i obecnością wysoce immunosupresyjnych populacji komórek szpiku, koreluje ze słabą odpowiedzią na terapie blokujące punkty kontrolne^6,7. Sygnalizowanie chemiokinami reguluje wiele z tych dynamiki rekrutacji. Na przykład, CXCL1 i CCL2 przyciągają immunosupresyjne komórki szpiku, podczas gdy oś CXCR3-CXCL9/CXCl10 rekrutuje zarówno cytotoksyczne, jak i regulacyjne komórki T do guza⁸. W konsekwencji, niszowe środowisko sygnałowe może potężnie wpływać na fenotypy i funkcje komórek. Na przykład u pacjentów z rakiem jelita grubego, oś CCL5-CCR5 kontroluje funkcję supresyjną makrofagów związanych z guzem (TAM) i blokowanie tego sygnału przesuwa TAM w kierunku fenotypu przeciwnowotworowego i koreluje z poprawą odpowiedzi klinicznych⁹. Ponadto, bezpośrednie interakcje między komórkami odpornościowymi, fibroblastami związanymi z rakiem i/lub komórkami nowotworowymi poprzez ICAM i PDL-1 mogą indukować wyczerpanie odporności i osłabiać odporność antytumorową¹⁰. Razem, te odkrycia podkreślają znaczenie przestrzennie rozdzielonych analiz w zrozumieniu, jak TME wpływa na skuteczność terapii.

Fluorescencyjne obrazowanie immunologiczne (IF) pozostaje podstawowym podejściem do wizualizacji ekspresji białek i interakcji komórka-komórka w tkankach. Pole to posunęło się od konwencjonalnego 3-4 kolorowego IF do przepływów obrazowania o wysokiej zawartości, które opierają się na iteracyjnym barwieniu i obrazowaniu. W tych metodach, duże zestawy danych są generowane poprzez powtarzające się cykle oznaczania przeciwciałami, obrazowania i inaktywacji lub usuwania fluoroforów, aby dodatkowe markery mogły być barwione i obrazowanie¹¹. Iteracyjne blaknięcie rozszerza wielokanałowość (IBEX) zostało niedawno wprowadzone jako przyjazny dla użytkownika i opłacalny iteracyjny system obrazowania¹². Kompatybilny z użyciem komercyjnych przeciwciał i konwencjonalnych mikroskopow, IBEX wykorzystuje borowodór litu (LiBH₄) do gaszenia fluorescencji większości najczęściej używanych barwników bez uszkodzenia epitopów tkankowych, pozwalając na nabycie do 75 parametrów dla pojedynczej tkanki¹³. Obrazy uzyskane z tego cyklicznego barwienia są wyrównane za pomocą otwartoźródłowego oprogramowania SimpleITK, aby wyprodukować zestawy danych złożone, które nadają się do przestrzennej analizy wysokowymiarowej.

Komplementarnie do fenotypu na poziomie białka, metody przestrzennej transkryptomiki mogą dostarczyć cennych informacji o stanie transkrypcyjnym komórek w ich natywnym środowisku. Warto zauważyć, że hybrydyzacja in situ (ISH) jest popularną techniką do identyfikacji lokalizacji sekwencji DNA lub RNA w konkretnej tkanki¹¹. RNAscope jest dobrze ugruntowanym podejściem ISH, który używa sond z unikalną chemią Z, aby specyficznie wzmacniać transkrypty RNA w rozdzielczości pojedynczej molekuły i jest kompatybilny z wieloma różnymi typami próbek¹⁴. Jako szeroko stosowana i komercyjnie dostępna platforma przez Advanced Cell Diagnostics (ACD), RNAscope oferuje zweryfikowane sondy przeciwko szerokiej gamie docelów, upraszczając projektowanie eksperymentów dla różnorodnych zastosowań.

Protocol

Procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użytkowania Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego (numer protokołu S24049). Do eksperymentów tych użyto myszy samców i samic w wieku 7-12 tygodni, posiadających genotyp C57BL/6 i hodowanych w warunkach swobodnych od specyficznych patogenów.

1. Przygotowanie tkanki

1. Wyłącz myszy eksperymentalne za pomocą zatwierdzonych podstawowych i wtórnych środków (np. eutanazja CO₂ i dyslokacja szyjna) i zebraj tkanki interesujące do uzupełnionego pożywka.  
2. Przygotuj świeżo przygotowany roztwór utrwalający tkanki przez rozcieńczenie 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) do stężenia 0,5% lub 1% PFA w buforze PBS 1X. Użyj 0,5% PFA dla tkanek o niższej objętości, takich jak węzły chłonne, a 1% PFA dla tkanek o wyższej objętości, takich jak guzy..   
   UWAGA: Paraformaldehyd jest łatwopalny i toksyczny w przypadku połknięcia lub przełknięcia. Obsługiwać z odpowiednią OPP i unikać kontaktu ze skórą lub oczami.
3. Przenieś tkanki do płytki 24-dołkowej z 2 ml utrwalającego na dołek i inkubować w temperaturze 4°C przez noc.
   Uwaga: Inkubacja przez ponad 16 godzin może prowadzić do problemów z nadmiernym utrwaleniem.
4. Wypełnij dołki nowej płytki 24-dołkowej buforem PBS 1X i przenieś tkanki z płytki utrwalającej.
   Punkt przerwy: Jeśli jest to konieczne, tkanki można przechowywać w buforze PBS 1X w temperaturze 4°C przez okres do 7 dni.
5. Usuń nadmiar tkanki tłuszczowej/szczątków z tkanek jednej po drugiej za pomocą mikroskopu do sekcji i narzędzi. Dodaj niewielką objętość buforu PBS 1X bezpośrednio do tkanki, aby zapobiec odwadnianiu podczas przycinania.
6. Przygotuj 30% roztwór sacharozy (mas./obj.) poprzez rozcieńczenie proszku sacharozy w buforze PBS 1X.
7. Przenieś tkanki do płytki 24-dołkowej z 2 ml 30% sacharozy na dołek i inkubować w temperaturze 4°C przez noc w celu odwodnienia. Tkanki są odpowiednio odwodnione, gdy opadają na dno dołków.
8. Wypełnij oznaczone foremki cryomianu OCT i umieść tkanki jedno po drugim w foremkach. Orientacja tkanek będzie zależna od pochodzenia, ale naszą standardową rekomendacją jest, aby największa powierzchnia była równoległa do dna foremki cryomianu. Upewnij się, że tkanki są całkowicie zanurzone w OCT.
9. Umieść na suchym lodzie przez 10 minut, aby zamrozić i przechowywać w temperaturze -80°C.

2. Sekcjonowanie tkanki

Uwaga: Wszystkie reagenty i materiały laboratoryjne użyte w tym protokole muszą być wolne od RNazy. Zwróć uwagę na unikanie skażenia podczas manipulacji szklanymi szlachetkami.

1. Nakłuj szlachetki bez RNazy 15 µL kleju chromowo-aluminium i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 60°C w piekarniku. Pokryte chromaluminium szlachetki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej (RT) do miesiąca przed użyciem.
2. Wyjmij tkanki zagnieżdżone w OCT z zamrażarki -80°C i umieść w kryostatach/kryotomie -20°C, aby wyrównać przez co najmniej 20 minut.
3. Przekroić tkanki na szlachetkach pokrytych chromaluminium o grubości 10-15 µm.
4. Przechowuj szlachetki z przekrojonymi sekcjami w temperaturze 4°C lub, jeśli barwienie ma nastąpić tego samego dnia, pozostawić szlachetki do wyrównania w temperaturze pokojowej. Przekrojone szlachetki mogą być przechowywane w temperaturze 4°C do 5 dni przed użyciem.

3. Barwienie białek

1. W wannie do zanurzania, mocz szlachetkę do barwienia w wolnej od RNazy buforze PBS 1X przez 5 minut, aby usunąć nadmiar OCT z tkanek.
2. Użyj hydrofobowego pióra do rysowania pudełek wokół tkanek na szlachetce i pozostawić do wyschnięcia przez 2 minuty.
3. Przygotuj roztwór blokujący z 10 µg·mL^-1 anty-mysiej blokady receptora FC w buforze PBS 1X wolnym od RNazy.  Dodaj bufor blokujący do próbek na szlachetce, używając wystarczającej ilości, aby stworzyć bańkę, która całkowicie pokrywa tkankę (100-150 µL·sekcji^-1).
   Uwaga: Czasami dodatek surowicy FBS lub BSA (zazwyczaj 1-2%) do bufora blokującego jest wymagany dla trudnych tkanek i/lub markerów.
4. Inkubować szlachetki w temperaturze pokojowej w wilgotnej skrzynce do barwienia przez 1 godzinę, a następnie wypłukać, całkowicie zanurzając je w wannie do zanurzania wypełnionej buforem PBS 1X wolnym od RNazy przez 5 minut.  
5. Przygotuj roztwór barwnika pierwotnego w

Results

Rysunek 1 : Przegląd przepływu pracy Bex-Plex.
Układom tkanki zamrożonej na ślizgach pokrytych chromem glinowym poddaje się do 3 cyklów standardowego IBEX, a następnie do trzech cykli RNAScope HiPlex, w których początkowy krok odbicia docelowego przeprowadza się w 60°C przez 1 godzinę. Obrazy z osobnych cykli są następnie rejestrowane i wyrównywane za pomocą znaku orientacyjnego (np. DAPI), aby utworzyć zestaw danych wielofunkcyjnych do dalszej analizy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykorzystaliśmy opisany wyżej protokół do sporządzenia profilu mikrośrodowiska nowotworu (TME) modelu gruczołowego przewodowego raka trzustki u myszy (PDAC) (Rysunek 1). Linia nowotworowa izolowana od myszy Kras^LSL-G12D/+;Trp53^L/+;Pdx1-Cre;Rosa26^YFP/YFP (KPCY), które spontanicznie rozwijają raka trzustki i odtwarzają wiele kluczowych cech ludzkiego PDAC, została podwłoniowo wstrzyknięta do boku myszy C57BL/6⁷. Myszy z nowotworem były następnie leczone kombinacją immunoterapii składającej się z przeciwciał anty-PD^-1 (i.p. 200 µg•mysz^-1 , RMP1-14) i anty-CTLA-4 (i.p., 200 µg•mysz^-1, 9H10) podawane w dniu 10 po implantacji i kontynuowane co 3 dni do końca eksperymentu. Agonista anty-CD40 (i.p., 100 µg•mysz^-1, FGK45) była podawany jako pojedyncza dawka w dniu 13 po implantacji. Razem nazywamy to “FPC”, jak wcześniej opublikowano7,16. Trzy nowotwory z każdej grupy eksperymentalnej zostały zebrane w 16 dniu po implantacji i zamrożone sekcje zostały zamontowane na ślizgach pokrytych chromem glinowym na potrzeby Bex-Plex.

Rysunek 2: Przedstawiające wyniki IBEX + RNAscope (Bex-Plex).
(A) Połączone barwienie IBEX i RNAscope w sekcjach nowotworu gruczołowego przewodowego raka trzustki (PDAC) wykazuje współwykrywanie białek i docelowych RNA oraz wyrównanie kanałów fluorescencji. Skala, 10 µm. (B) Kwantyfikacja składników układu odpornościowego opartych na markerach białkowych: komórek T (CD3+ CD11b-), makrofagów (CD11b+ CD68+) i komórek miałego (CD11b+ CD68- Ly6G +/-). Wykresy przedstawiają średnią gęstość komórek dla każdego typu komórek w grupie leczonej, n=3 nowotwory. (C) Kwantyfikacja komórek wyrażających transkrypty Pdl1 i Il10 w składnikach układu odpornościowego wcześniej zidentyfikowanych przez białko. Wykresy przedstawiają średnią gęstość komórek w grupie leczonej, n=3 nowotwory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Cykl barwienia białek został przeprowadzony na trzech guzach leczonych FPC i trzech guzach leczonych izotypową kontrolą, aby ocenić wpływ na komórki linii miałej między grupami leczenia. Zdobyto siedem parametrów, choć tutaj koncentrujemy się na trzech wskaźnikach zainteresowania: CD11b, Ly6G i CD68 (Rysunek 2A). Po nabyciu obrazu fluorofory z barwienia białek zostały wybielone i przeprowadzono jedną rundę RNAscope za pomocą sond przeciwko Il10 i Pdl1 (Rysunek 2A). Osobne obrazy zostały następnie wyrównane za pomocą DAPI jako orientacyjnego (Rysunek 2A). Kwantytatywna średnia intensywność fluorescencji CD11b, CD68, Ly6G i CD3 ujawnił tendencję do mniejszej liczby makrofagów i komórek miałych w guzach leczonych FPC w porównaniu z kontrolami (Rysunek 2B). Kwantytatywne porównania zostały przeprowadzone na wszystkich próbkach, a dane są przedstawione jako średnie wartości. Ponadto liczba komórek wyrażających Pdl1, Il10 lub kombinację obu transkryptów zarówno w składnikach makrofagowych jak i miałych wykazała tendencję spadkową po leczeniu FPC w porównaniu z kontrolami (Rysunek 2C). Wyniki te wskazują na potencjalne zmniejszenie liczby immunosupresyjnych populacji komórek po leczeniu, zgodnie z oczekiwanymi odpowiedziami biologicznymi.

Discussion

Przepływ pracy Bex-Plex integruje iteracyjną platformę barwienia białek, IBEX, z hybrydyzacją in situ RNAscope, aby umożliwić jednoczesne wykrywanie białek i transkryptów RNA na poziomie pojedynczych komórek. Głównym celem tego protokołu jest zapewnienie powtarzalnej metody zintegrowanej analizy przestrzennej ekspresji białek i RNA w całych tkankach. Możliwość pomiaru zarówno ekspresji białek, jak i RNA w tej samej tkance, wcześniej stanowiła wyzwania techniczne: wysokie koszty, skomplikowane kroki odbicia antygenu, ograniczona zdolność multiplexu, ograniczenia rozdzielcze (nie na poziomie pojedynczych komórek), nieliniowe wzmacnianie sygnału i rozległe biblioteki bioinformatyczne do przetwarzania wtórnego ^17,18,19. W porównaniu z istniejącymi podejściami, takimi jak multiplexowa immunofluorescencja, barwienie OPAL/TSA i platformy sekwencji przestrzennych, Bex-Plex umożliwia powtarzalne, ilościowe i wielobarwne jednoczesne wykrywanie przy zachowaniu kontekstu przestrzennego i morfologii jąder dla dokładnego dopasowania obrazu. Ponadto, Bex-Plex można wykonać w standardowym środowisku laboratoryjnym i generuje dane na poziomie pojedynczych komórek, które są łatwe do przetworzenia. Wykorzystanie tego protokołu do uzyskania kompleksowego zrozumienia interakcji między komórkami w różnych kontekstach tkankowych, takich jak w mikrośrodowisku nowotworowym, będzie niezbędne dla opracowania bardziej skutecznych terapii immunologicznych i poprawy wyników leczenia pacjentów w różnych stanach chorobowych.

Nasza metoda jest wykonywana na tkankach utrwalonych, osadzonych w OCT i przebiega zgodnie ze standardowym przepływem pracy IBEX bez modyfikacji, a następnie lekko zmodyfikowanym protokołem RNAscope HiPlex. Kluczowa różnica polega na etapie odbicia docelowego na początku przepływu pracy hybrydyzacji RNA: zamiast zalecanej przez producenta temperatury 99°C przez 5 min, odbicie jest wykonywane w 60°C przez 1 godzinę. Ta zmiana zachowuje architekturę jądra, co jest niezbędne do dokładnego dopasowania obrazów między cyklami białek i RNA. Krytycznymi krokami tego protokołu są utrzymanie spójnej temperatury odbicia docelowego, wydajne blaknięcie fluoroforów za pomocą LiBH₄ i minimalizowanie degradacji RNA poprzez szybką obróbkę i stosowanie środków bez RNAzy. Najważniejsze jest zapewnienie użycia nagrzane wcześniej środków do odbicia docelowego w temperaturze 60°C; nieprzestrzeganie tego może powodować puchnięcie jąder nawet przy zmienionym etapie inkubacji.

Chociaż wykazano, że 15 minut inkubacji z LiBH₄ jest wystarczających, aby wyłączyć wiele powszechnie stosowanych fluoroforów, zaleca się indywidualne zweryfikowanie tego procesu dla każdego cyklu białek przed uruchomieniem całego protokołu Bex-Plex. W początkowych publikacjach IBEX dobrze scharakteryzowano, że nie wszystkie flurofory kompatybilne z IBEX są równie łatwo blaknięte¹². Ponadto nasze laboratorium zaobserwowało, że niektóre markery strukturalne o dużej obfitości, takie jak wimentyna, mogą wymagać dłuższego czasu blaknięcia. Potwierdzenie, że fluorofor i markery używane w połączeniu będą odpowiednio blaknięte, powinno zapobiec pozostałościom sygnału w kolejnych cyklach białek i RNA. Strona społeczności IBEX ma doskonałe zasoby do projektowania paneli kompatybilnych z IBEX i jest specjalnie przeznaczona, aby zmniejszyć obciążenie nowych użytkowników poprzez wskazanie skuteczności przeciwciał i czasów blaknięcia fluoroforów²⁰. Co więcej, iteracyjne barwienie i blaknięcie nie powinny wpływać na jakość transkryptów RNA, jednak ważne jest, aby zakończyć cykle białek tak szybko, jak to możliwe i używać środków bez RNAzy, aby zminimalizować degradację RNA, która może nastąpić z czasem. Nieprzestrzeganie tego może wpłynąć na hybrydyzację sond i prowadzić do zmniejszenia sygnału dla dowolnych wykonanych cykli RNAscope, szczególnie dla transkryptów o niskiej obfitości. Typowe problemy, które pojawiają się podczas protokołu, obejmują słaby sygnał RNA, niekompletne blaknięcie fluoroforów i niedopasowanie między cyklami obrażowania, które można zminimalizować poprzez optymalizację warunków barwienia i parametrów obrażowania.

Należy ograniczyć czas między wykonywaniem barwienia białek a hybrydyzacją sond RNA do mniej niż 5 dni. Podczas wykonywania Bex-Plex na wielu slajdów, zaleca się przetwarzanie jednego slajdu na raz, aby zmniejszyć zmienność w degradacji RNA. Podobnie ogranicz czas między hybrydyzacją sond a obrażowaniem. Chociaż pomyślnie obrażaliśmy do 3 dni po amplifikacji, dłuższe przechowywanie nie jest zalecane. Jeśli po wielu cyklach barwienia lub hybrydyzacji stwierdzi się zmniejszenie sygnału, może być konieczne zwiększenie szybkości w całym protokole. Idealnie zalecamy pracować tak szybko, jak to możliwe, ponieważ opóźnienia zmniejszają integralność RNA i mogą osłabić amplifikację. Inne podejścia obejmują zmniejszenie liczby wykonywanych cykli białek, aby łatwiej pasowały one do ograniczeń czasowych protokołu, lub zmianę projektu panelu sond RNA, aby obejmował bardziej obfite docelne transkrypty. Przed połączeniem IBEX i

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeablization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retreival reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023