Method Article

Model urazu hipoksji i reoxygenacji u samoorganizujących się ludzkich kardioidów

DOI:

10.3791/70310

⸱

March 17th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University School of Medicine, 2Department of Pathology, Duke University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samoorganizujące się ludzkie organoidy sercowe (hCO) to nowy system modelowania rozwoju i chorób serca u człowieka. Tutaj przedstawiono metodologię generowania i urazu hCOs przy użyciu hipoksji i reoxygenacji oraz szczegóły oczekiwanych wyników histologicznych i funkcjonalnych po urazie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bez szybkiej rewaskularizacji choroba niedokrwienna serca prowadzi do nieodwracalnej utraty kardiomiocytów, powstawania blizn oraz obniżenia funkcji serca. Możliwość modelowania urazów spowodowanych niedotlenieniem i reoxygenacją oraz ocena potencjalnych interwencji terapeutycznych w tkankach ludzkich jest niezaspokojoną potrzebą. Ludzkie organoidy sercowe (hCO) to nowy system modelowy, ale rozpoczęcie pracy z hCOs może być trudne ze względu na ich niewielki rozmiar, wymagania dotyczące hodowli zawiesin oraz zmienność efektywności różnicowania. Ten protokół oferuje przyjazny dla użytkownika przewodnik po generowaniu i utrzymywaniu samodzielnie składających się hCOs pochodzących z ludzkiego iPSC; metody przetwarzania i analizy histologicznej hCO; oraz podejście do urazu hCom poprzez niedotlenienie i reoxygenację, które naśladuje włóknienie i apoptozę obserwowane przy ludzkiej niedokrwieniu/reperfuzji. Protokół ten dostarcza wskazówek dotyczących stosowania hCOs jako uzupełnienia modeli zwierzęcych urazów niedokrwieniowo-reperfuzyjnych i może być wykorzystywany do identyfikacji oraz testowania czynników mogących przyspieszyć regenerację mięśnia sercowego u człowieka.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba niedokrwienna serca jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie, dotykając co najmniej 20,5 miliona osób tylko w Stanach Zjednoczonych 1,2,3. Bez odpowiedniej perfuzji przedłużona hipoksja prowadzi do śmierci kardiomiocytów (CM) i dysfunkcji mięśnia sercowego. Niedokrwienie mięśnia sercowego jest przede wszystkim leczone rewaskularizacją poprzez interwencję przezskórną, terapię trombolitową lub przeszczep pomostowania tętnic wieńcowych. Jednak rewaskularyzacja to miecz obosieczny i może powodować dodatkowe uszkodzenia poprzez uwalnianie reaktywnego tlenu 4,5. Chociaż strategie reperfuzji okazały się niezwykle skuteczne, metody ograniczające utratę CM podczas niedokrwiennych infarktów lub po reperfuzji były bardziej trudne do uchwycenia. Chociaż wiele prób ratowania tkanek zawałowych okazuje się skutecznych w modelach zwierzęcych reperfuzji niedokrwiennej, te same terapie w dużej mierze nie przyniosły znaczących korzyści w badaniach na ludziach, co rodzi potrzebę stosowania modeli ludzkich do oceny terapii oszczędzających lub uzupełniających CM 6,7,8,9,10,11,12.

Platformy ludzkie wykorzystywane do modelowania urazów serca obejmują tkanki pierwotne oraz systemy pochodzące z ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych (hiPSC)13,14. Ponieważ tkanki pierwotne są ograniczone dostępnością próbek, systemy hiPSC stały się dominującą platformą ludzką do modelowania chorób serca, z wyraźnymi zaletami w postaci genetycznej podatności i skalowalności 15,16,17,18,19. Tradycyjne kultury kardiomiocytów pochodzących od hiPSC (hiPSC-CM) 2D są ograniczone przez niedojrzałość powstałych CM, brak złożonej architektury tkanek oraz niemożność odtworzenia pełnej różnorodności komórkowej obecnej w ludzkim sercu15,20. Aby zniwelować te niedociągnięcia, coraz częściej stosuje się inżynieryjne tkanki serca 3D (EHT) 20,21,22,23,24,25,26. Podejścia EHT obejmują mieszanie predyferencowanych komórek serca w sferoidy24 lub zasiewanie zróżnicowanych komórek serca do rusztowań lub form 21,22,27. Chociaż EHT lepiej modelują heterotypowe interakcje komórkowe i mają stosunkowo większą dojrzałość niż kultury 2D, wymagania dotyczące niestandardowych rusztowań lub bioreaktorów do tworzenia i utrzymania EHT obecnie ograniczają ich skalowalnośćna 21,27,28.

Samoorganizujące się organoidy sercowe (hCO), czyli kardioidy, to nowy i potężny system modelowy in vitro dla człowieka 20,25,26,29. HCoS mają kilka zalet. Po pierwsze, mogą obejmować wiele typów komórek, w tym komórki śródbłonka, fibroblasty i komórki naepisercyjne, bez potrzeby stosowania wielu specjalistycznych protokołów różnicowania 26,29,30. Po drugie, większość ich różnicowania odbywa się w hodowli zawiesin 3D, eliminując wymagania dotyczące specjalistycznych form lub matrycy tkankowej 25,26,29,30. Wreszcie, hCOs mają stereotypową morfologię sferyczną z centralną jamą, co umożliwia analizy morfologiczne. Dzięki temu hCOs mają skalowalność podobną do systemów hodowli 2D, zachowując jednocześnie część złożoności tkankowej EHT. hCOs były wykorzystywane do testów toksyczności leków, modelowania chorób specyficznych dla pacjenta oraz do modelowania aspektów rozwoju serca20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Choć obiecujące, hCOs mają kilka ograniczeń w porównaniu do EHT, w tym brak możliwości bezpośredniego pomiaru siły wyjściowej. Ponadto w opisanych modelach hCO nie ma rodzimej populacji komórek odpornościowych, choć możliwe jest zapełnienie hCOs makrofagami. Niemniej jednak hCOs to rozwijający się i szybko ewoluujący system modeli ludzkich 20,26,30,31,32,333,34,35,36,37,38,39.

Do tej pory modelowanie urazów serca z użyciem hCOs było ograniczone. Opisano model kriourazów, ale urazy są bardzo zmienne, a konieczność indywidualnego uszkodzenia hCOs ogranicza skalowalność29. Niniejszy manuskrypt opisuje przyjazny dla użytkownika protokół generowania i uszkadzania samosamodzielnie składających się hCOs z urazami spowodowanymi niedotlenieniem i reoxygenacją (H/R). W porównaniu z innymi protokołami generowania hCO, ten protokół wykorzystuje uproszczone medium różnicowania i zawiera strategię różnicowania mezodermy 2D-3D, opisaną przez Hofbauera i in.29. Protokół dotyczący urazu H/R można wykonać w dowolnym momencie po rozpoczęciu bicia hCO, co zazwyczaj następuje około dnia różnicowania 8 (D8) do D11. Czas trwania H/R można stopniowo zmierzać od 6 do 24 godzin, aby osiągnąć pożądany poziom urazu, od minimalnej do niemal całkowitej utraty CM. Dodatkowo, hCOs stereotypowo rozwijają kolagenowe jądro z komórkami Vimentin+ po urazie H/R, które również skaluje się w zależności od czasu trwania H/R. Ten wysokoprzepustowy, skalowalny model hCO urazu H/R potencjalnie odpowiada na potrzebę rozwoju i testowania nowych metod terapeutycznych wspierających regenerację lub regenerację CM po urazie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury obsługi ludzkich linii komórkowych powinny być zgodne z lokalnymi protokołami biobezpieczeństwa. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na linii komórkowej iPSC DU11, która jest pozyskiwana ze zdrowych fibroblastów noworodków męskich w głównym ośrodku iPSC na Uniwersytecie Duke.

1. Generowanie hCOs

UWAGA: Ta sekcja opisuje standardowy protokół generowania hCOs z iPSC (Rysunek 1). Wszystkie kroki opisane w tym protokole powinny być wykonywane w laminarnym okapu, aby zapewnić bezpłodność. Zobacz Tabelę 1 , aby poznać przepisy na podłoża różnicujące.

DzieńKoncentracja zasobówKoncentracja roboczaWspółczynnik rozcieńczaniaBase Media
D010 mM CHIR9902110 μM CHIR990211:1000 RPMI-1640, 2% B27 minus insulina
100 mg/mL kwasu askorbinowegoKwas askorbinowy 50 μg/mL1:2000
10 mg/mL Activin A60 ng/mL Aktywność A1:167
D15 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 minus insulina
100 mg/mL kwasu askorbinowegoKwas askorbinowy 50 μg/mL1:2000
D25 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 minus insulina
100 mg/mL kwasu askorbinowegoKwas askorbinowy 50 μg/mL1:2000
10 mM Thiazovivin2 μM Thiazovivin1:5000
D35 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 minus insulina
100 mg/mL kwasu askorbinowegoKwas askorbinowy 50 μg/mL1:2000
D45mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2% B27 minus insulina
D6+Nie maNie maRPMI-1640, 2% B27 plus insulina

Tabela 1: Tabela mediów różnicowania. Stężenia stockowe, stężenia robocze oraz współczynnik rozcieńczenia dla każdego czynnika różnicującego w dniach różnicowania 0-6. Przygotuj wszystkie działające produkty świeże w momencie podawania.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat różnicowania hCO. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Utrzymanie iPSC
    1. Całkowicie przykryj dno każdej studni płyty 12-dołkowej matrycą błony podstawowej w stosunku 1:100, rozcieńczoną w zimnym medium DMEM/F12. Inkubuj płyty impregnowane w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić polimeryzację. Jeśli nie są używane od razu, płytki można zamknąć folią i przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni, a następnie inkubować przez co najmniej 60 minut w 37 °C przed użyciem.
  2. Dzień różnicowania -3 (D-3): poszywanie iPSC do dalszej różniczkowania
    1. Przygotuj płytki pokryte matrycą błony podstawnej, zgodnie z krokiem 1.1.1.
    2. Aspiruj medium podtrzymujące z hodowli iPSC i dodaj wystarczającą ilość roztworu do odłączania komórek, aby całkowicie pokryć komórki (~500 μL na dołek na 12-dołkowej płycie lub 1 mL na dołek 6-dołkowej płytki). Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    3. Dodaj równą ilość nośnika utrzymującego iPSC do każdego dołka i delikatnie stuknij w płytkę, aby pomóc odłączyć komórki. Przechyl płytkę w swoją stronę i delikatnie pipetuj w górę i w dół po dnie dołka, aby jeszcze bardziej odłączyć przylegające komórki, nie więcej niż 3 razy. Użyj pipety, aby przenieść zawiesinę ogniwa do stożkowej rurki o pojemności 15 mL.
    4. Ogniwa na pellety przez wirowanie w 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w wirówce z kołyszącym się wiadrem. Aspiruj supernatant i delikatnie zawiesz komórki w 1 mL nośnika podtrzymującego iPSC.
    5. Przenieś 10 μL zawiesiny ogniwowej do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Dodaj 10 μL Trypan blue i pipety do wymieszania. Dodaj 10 μL mieszaniny iPSC/Trypan Blue do hemocytometru i licz żywe komórki.
    6. Rozcieńcz zawiesinę komórkową do końcowego stężenia 100 000-200 000 komórek/mL w ośrodku podtrzymującym iPSC za pomocą inhibitora ROCK (ROCKi). Dodaj 1 mL/dołek zawiesiny komórkowej do każdej dołki płytki 12-dołkowej pokrytej matrycą błony podstawowej.
      UWAGA: Gęstość powłoki przed różnicowaniem zależy od tempa wzrostu danej linii komórkowej. Gęstość powłoki może wymagać korekty dla każdej linii iPSC. Stężenie ROCKi może wymagać stopniowego stopniowego zwiększania w zależności od marki i stosowanej formuły.
  3. Różnicowanie D-2: Wymiana nośników w celu usunięcia ROCKi
    1. Wymień media na 1 mL świeżego iPSC medium podtrzymującego bez ROCKi. Komórki powinny zacząć tworzyć małe kolonie. Kolonie powinny wyglądać na płaskie (Rysunek 2A). Jeśli komórki wyglądają na brukowate, cienkie lub wydłużone, jest to oznaka spontanicznej różnicowania, a skuteczność różnicowania może zostać obniżona.
  4. Różnicowanie D-1: Kontynuuj inkubację komórek bez leczenia.
  5. Różnicowanie D0: Rozpoczęcie różnicowania i indukcji mezodermy
    1. Za pomocą mikroskopu sprawdź gęstość komórek, aby zapewnić 70%-90% zbieżności (rysunek 2B) w momencie różnicowania. Jeśli jest subkonfluentny, zakarm komórki nośnikiem podtrzymującym iPSC i odczekaj 24 godziny. Jeśli komórki są zbyt zbiegłe, podziel je jak w kroku 1.2
    2. Przygotuj 12 mL na 12-dołkowy płytkę z pożywką indukcyjną D0 mezodermy (10 μM CHIR99021, 50 μg/mL kwasu askorbinowego, 60 ng/mL Aktywiny A w RPMI-1640 z 2% suplementem B27 minus insulina (RB-)).
    3. Usuń istniejące podłoże i zamień go na 1 mL/well medium indukcyjnego mezodermy D0. Zwróć uwagę na czas wymiany mediów.
  6. Różnicowanie D1: Specyfikacja mezodermy serca
    1. Dokładnie 24 godziny po dodaniu pożywki indukcyjnej mezodermy D0, należy wymienić medium za podłoże specyfikacji mezodermy serca D1 (5 μM IWP2, 50 μg/mL kwasu askorbinowego w RB).
  7. Różniczkowanie D2: powstawanie hCO
    1. Dodaj wystarczającą ilość odczynnika do dysocjacji komórek, aby pokryć komórki i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5 minut (rysunek 2C). Dodaj równą ilość podłoża międzydermy serca D2 do każdej dołki i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby uwolnić przylegające komórki. Przenieś zawiesinę ogniwa do stożkowej rurki o pojemności 15 mL.
    2. Ogniwa na pellety przez wirowanie w 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesz w 1 mL podłoża specyjnego dla mezodermy serca D2 (5 μM IWP2, 50 μg/mL kwasu askorbinowego w RB-).
    3. Weź 10 μL zawiesiny ogniwa i dodaj do niej 10 μL niebieskiego trypana. Licz komórki dowolną preferowaną metodą. Rozcieńcz komórki do stężenia 100 000 komórek/mL w ośrodku specyfikacji mezodermy serca D2, z użyciem 2 μM tiazowiwiny. Użyj 10 ml zawiesiny ogniwowej na płytkę o ultra-niskim mocowaniu 96 dołków.
    4. Przenieś zawiesinę ogniwa do odpowiednio wielkościowego zbiornika odczynnikowego i użyć pipety wielokanałowej, aby przenieść 100 μL do każdej dołki płytki 96-dołowej o ultra-niskim przyczepieniu, co daje końcowe stężenie 10 000 komórek na dołek.
    5. Aby wywołać powstawanie hCO w hodowli zawiesiny, należy wirować płyty o pojemności 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu powstaje duża ilość komórek (rysunek 2D) – jeśli ten osad nie jest ograniczony, powtórz wirowanie.
      UWAGA: Nie wszystkie komórki włączą się do hCO, który pojawi się jako ograniczony osad komórkowy, a poszczególne komórki będą widoczne na mikroskopii jasnego pola. Niektóre pojedyncze zanieczyszczenia w płycie otaczającej hCO są normalne.
  8. Różnicowanie D3: Dodawanie mediów w celu rozcieńczenia ROCKi
    1. Przygotuj 10 mL podłoża D3 (5 μM IWP2, 50 μg/mL kwasu askorbinowego w RB-) na płytę. Używając pipety wielokanałowej, dodaj 100 μL nośnika D3 do każdej studni, nie usuwając żadnego nośnika.
      UWAGA: Na tym etapie hCOs skondensują się w ciemną, dobrze ograniczoną sferoidę. Pojedyncze komórki nie będą widoczne (Rysunek 2E).
  9. Różnicowanie D4: Wymiana na media D4
    1. Usuń 100 μL medium D3 i zamień go na 100 μL nośnika D4 (5 μM IWP2 w RB-). Aby zmniejszyć ryzyko aspiracji, pochyl płytkę do siebie pod kątem około 45° i trzymaj pipetę wielokanałową pod kątem około 90° względem bocznej ścianki płytki. Umieść pipetę wielokanałową mocno na bocznej ściance dołka i powoli zasysaj 100 μL medium, co jakiś czas sprawdzając końcówki pipety pod kątem zasysanych hCO.
      UWAGA: hCOs są w hodowli zawiesin, a zasysanie hCOs podczas usuwania mediów jest powszechne. Aby zmniejszyć ryzyko zasytania, pochyl płytkę do siebie pod kątem około 45° i trzymaj pipetę wielokanałową pod kątem około 90° względem bocznej ścianki płytki. Umieść pipetę wielokanałową mocno na bocznej ściance dołka i powoli zasysaj 100 μL medium, co jakiś czas sprawdzając końcówki pipety pod kątem zasysanych hCO.
    2. Zamień na 100 μL nośnika D4.
  10. Różnicowanie D6: medium utrzymujące hCO
    1. Usuń 100 μL z nośnika D4 i zamień go na 100 μL nośnika D6+ (RPMI-1640 z suplementem 2% B27 (RB+)).
  11. Różniczkowanie D8
    1. Kontynuuj wymianę mediów co 2 dni, usuwając 100 μL i zastępując je 100 μL świeżym medium D6+. hCOs powinny rosnąć, zachować gładkie krawędzie i zacząć bić około D6-11, jeśli zostaną skutecznie zróżnicowane (rysunek 2F). HCOs nadal będą wyglądać jako ciemne, dobrze ograniczone sferoidy, a pojedyncze komórki nie będą widoczne.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Oś czasu różnicowania hCO. Oś czasu różnicowania organoidów. (A) kolonie iPSC na 1 dzień przed rozpoczęciem różnicowania (D-1). Zwróć uwagę na wyraźne, płaskie kolonie. (B) iPSC w dniu inicjacji różnicowania (D0) przy ~90% konfluencji. (C) Organoid różnicujący się D2 bezpośrednio po utworzeniu organoidu w płytkach o ultra-niskim przyczepie 96 dołków. Arrow oznacza przykład igiełowatych kryształów IWP2. (D) Organoidy na dyferencjacji D3. Zwróć uwagę na znaczące zagęszczenie organoidów spowodowane powstawaniem połączenia komórkowego; na tym etapie normalne są nieinkorporowane odpady komórkowe. (E) Organoidy na dyferencjacji D10. (F) Strzałka wskazuje kolonię iPSC z wydłużonymi, cienkimi komórkami o wyglądzie brukowatym, co wskazuje na potencjalną spontaniczną różnicację. Pasek skali = 1000 μm dla paneli A-E, belka skali = 400 μm dla panelu F. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Zbieranie i utrwalanie hCOs do immunobarwienia

  1. Używając pipety 1000 μL z odciętą końcówką, przenieś hCOs do rurki mikrowirówki o pojemności 1,7 mL. Gdy wszystkie hCOs zostaną przeniesione, poczekaj, aż opadną na dno rurki i delikatnie usuń nadmiar materiału. Przemyj hCOs 1x PBS, odczekaj kilka sekund, aż hCOs opadają na dno rurki i delikatnie usuń nadmiar PBS.
  2. Napraw hCOs 4% PFA przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Niektóre przeciwciała mogą wymagać wiązania acetonu lub metanolu dla optymalnej wydajności. Zapoznaj się z wytycznymi producenta.

3. Immunobarwienie całego montażu

  1. Przenieś pożądaną liczbę stałych hCOs do rurki mikrowirówki o pojemności 1,7 mL. Usuń roztwór utrwalający i przepłucz PBS zawierającym 0,1% Tween-20 (PBS-T).
    1. Aby wymknąć hCO, usuń jak najwięcej nadmiaru utrwalacza. Uważaj, żeby nie ruszyć hCOs na dnie rurki. Dodaj ~1 mL PBS-T i poczekaj kilka sekund, aż hCOs opadają na dno rurki, zanim przejdziesz do kolejnego kroku.
  2. Rozcieńcz przeciwciało główne do pożądanego stężenia w roztworze barwniczym (10% surowicy noworodkowej, 1% DMSO w 0,1% PBS-T). Dodaj 50-100 μl pierwotnego roztworu przeciwciał na każdą rurkę mikrowirówki (lub wystarczającą objętość, aby pokryć wszystkie hCOs w każdym probówce).
  3. Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 4 °C na shakerze/bujace. Usuń nadmiar przeciwciał pierwotnych, a następnie wykonaj trzy płukania po godzinie w PBS-T w temperaturze pokojowej. Wykonaj ostatnie mycie na noc w PBS-T w temperaturze 4 °C, aby upewnić się, że usunięto nadmiar przeciwciał.
  4. Rozcieńcz przeciwciało wtórne do pożądanego stężenia w roztworze barwniczym i dodaj 50-100 μL roztworu przeciwciał na probówkę mikrowirówki (lub wystarczającą objętość, aby pokryć wszystkie hCOs w każdej probówce).
  5. Inkubuj hCOs z przeciwciałem wtórnym przez 24 godziny w temperaturze 4 °C na platformie do trzęsania. Usuń nadmiar przeciwciał wtórnych, a następnie wykonaj trzy płukania po godzinie w PBS-T w temperaturze pokojowej. Wykonaj ostatnie mycie na noc w PBS-T w temperaturze 4 °C, aby upewnić się, że usunięto wszelkie nadmiar przeciwciał.
  6. Do obrazowania całego montażu przenosi się hCOs za pomocą pipety 1000 μL z odciętym końcówką na dodatnio naładowany szklany szkieł. Usuń nadmiar PBS-T i dodaj kilka kropli materiału montażowego, aby zakryć hCO. Ostrożnie załóż pokrywkę, aby spłaszczyć hCO.
    UWAGA: Aby zachować architekturę 3D hCO, użyj gumowej uszczelki lub taśmy dwustronnej wokół krawędzi zamka, aby podnieść wysokość pokrywy. Użycie medium montażowego oczyszczającego może pomóc poprawić obrazowanie przez hCO, zwłaszcza jeśli hCOs nie są spłaszczone.

4. Sekcjonowanie i osadzanie

  1. Po utrwaleniu pokryj hCOs 30% sacharozą na noc w 4 °C dla krioprotekcji. Używając pipety 1000 μL z odciętą końcówką, przelej pożądaną liczbę hCOs do plastikowej formy o wymiarach 12 mm x 12 mm. Ostrożnie usuń nadmiar roztworu sacharozy, uważając, by nie zasysać hCO.
    UWAGA: Warto pipetować 30% sacharozy w końcówce pipety przed przełożeniem, aby zapobiec przyklejaniu się hCOs do boku końcówki.
  2. Dodaj małą kroplę OCT, tylko tyle, żeby zakryć hCO. Używając cienkiej pęsety lub końcówki pipety, delikatnie przestaw hCOs w OCT tak, aby nie były zlepione i żeby nie było hCOs blisko krawędzi formy. Upewnij się, że wszystkie hCOs znajdują się jak najbliżej dna pleśni, aby zmaksymalizować liczbę hCOs znalezionych w pojedynczej kriosekcji.
  3. Zamroź tę początkową warstwę OCT, umieszczając formę w chłodziarce styropianowej z warstwą suchego lodu na dnie. Poczekaj kilka minut, aż OCT stwardnieje, a potem przenieś formę z suchego lodu na blat stołu. Dodaj dodatkowy OCT, aż forma zostanie wypełniona. Poczekaj, aż pierwsza warstwa OCT całkowicie się roztopi, zanim wrócisz do suchego lodu.
  4. Przechowuj zamrożone, osadzone hCOs w temperaturze -80 °C, aż do momentu gotowości do kriosekcji.
  5. Gdy będziesz gotowy do krojonu, wyrównaj blok hCO jak najlepiej i zacznij go przycinać. Okresowo umieszczaj sekcję na naładowanym szkiełku i wizualnie sprawdzaj każdą sekcję pod kątem hCO. Gdy hCOs zostaną zobrazowane, zmienimy przekroje na 6 μm.
    UWAGA: Wskaźnik zaniku hCOs podczas osadzania i sekcjonowania wynosi co najmniej 10%. Planuj odpowiednio.

5. Przekroje tkanek TUNEL i immunobarwne

  1. Użyj cytologii, aby narysować hydrofobową granicę wokół tkanek, które wymagają barwienia. Wash przesuwa się raz w PBS 0,1% Tween (PBS-T), aby rozpuścić w październiku.
  2. Dodaj bufor blokujący (10% surowicy noworodkowej cielęcia, 1% DMSO, w PBS-T) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotuj pierwotny roztwór przeciwciał. Zacznij od zalecanego przez producenta stężenia immunofluorescencji, ale stężenie może wymagać empirycznego zmierzania.
    UWAGA: Alternatywnie, barwienie TUNEL można wykonać w tym czasie, zgodnie z protokołem producenta.
  4. Usuń bufor blokujący ze ślizgu. Dodaj wystarczającą ilość roztworu przeciwciał pierwotnych, aby pokryć sekcje hCO. Inkubuj przeciwciała pierwotne przez noc w temperaturze 4 °C lub 3 godziny w 37 °C. Płucz 3 razy przez 5 minut w słoiku Coplin wypełnionym PBS-T w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotuj wtórny roztwór barwienia przeciwciał w buforze blokującym, w tym DAPI lub innym markerem pan-jądrowym. Dodaj wystarczającą ilość wtórnego roztworu barwiącego przeciwciała, aby pokryć przekroje hCO. Inkubować chroniony przed światłem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Płucz 3 razy przez 5 minut w słoiku Coplin wypełnionym PBS-T w temperaturze pokojowej. Zamontuj z pokrywką z pożądanym nośnikiem montażowym.

6. Ilościowa kolokalizacja jądra za pomocą CardioCount

UWAGA: CardioCount to metoda oparta na uczeniu głębokim do oceniania jąder CM na podstawie obrazówmikroskopowych 40. Początkowo opracowany do oceny cykli CM, CardioCount sprawdza się dobrze w przypadku wielu barwników jądrowych, w tym TUNEL40.

  1. Aby korzystać z CardioCount, pobierz pakiet CardioCount z GitHuba lub zaimportuj go do Google Colab (https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git, https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/, https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3). CardioCount Wersja 1 działa w środowisku Python 3.
  2. Eksportuj obrazy do ilościowania jako pojedyncze pliki .tif o wymiarach 512 x 512 pikseli z połączonymi kanałami czerwonym, niebieskim i zielonym, gdzie czerwony kanał to marker jądrowy CM, niebieski to ogólny marker jądrowy, a zielony to cykliczny marker jądrowy (np. Ki67) lub marker apoptotyczny (np. TUNEL). Utwórz folder nadrzędny w Google Drive dla tego eksperymentu i wgraj połączone tiffy jako podfolder.
    UWAGA: CardioCount był trenowany na barwach jądrowych wypełniających jądro. Markery rowerowe o bardziej punktacyjnym znaczeniu, takie jak Aurora B czy PH3, mogą nie być kompatybilne z CardioCount.
  3. Otwórz notes CardioCount w Google CoLab. Uruchom Cell 1.1, aby sprawdzić dostęp do jednostek graficznych (GPU). Uruchom Cell 1.2, aby połączyć CoLab Notebook z Google Drive.
  4. Uruchom Cell 1.3, aby załadować CardioCount i zależności w Google Colab. Edytuj kfile, aby odczytać nazwę ścieżki do miejsca, gdzie folder PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries został zapisany po pobraniu.
  5. W Cell 2.0 edytuj base_folder, aby odczytać nazwę ścieżki do folderu nadrzędnego zawierającego podfolder obrazów do analizy. Uruchom Cell 2.0, aby połączyć ten folder z CoLab.
  6. W komórce 2.1.1 zedytuj orig_image_folder, aby dopasować nazwę folderu zawierającego obrazy do analizy. Edytuj channel_to_remove, aby czytać zielone i new_image_folder tak, aby nazwać podfolder pod base_folder, gdzie będą zapisywane wszystkie obrazy z usuniętym zielonym kanałem (czerwonym/niebieskim). Powtórz ten krok, aby usunąć czerwony kanał, upewniając się, że new_image_folder edycja, aby odróżnić podfolder zawierający obrazy z usuniętym czerwonym kanałem (zielony/niebieski).
  7. W komórce 2.1.2 przycinaj obrazy do 512 x 512 dla obrazów czerwono-niebieskich. Upewnij się, że uncropped_image_folder odpowiada nazwie new_image_folder utworzonej w kroku 6.6. Dla obrazów czerwonych/niebieskich. Nazwa destination_image_folder oznaczać podfolder, w którym będą zapisywane przycięte, czerwone/niebieskie obrazy. Powtórz ten krok, aby przyciąć zielono-niebieskie obrazy. Na koniec powtórz ten krok, aby przyciąć oryginalne 3-kanałowe, połączone tiffy umieszczone w base_folder.
  8. Uruchom komórkę 2.2, aby wygenerować mapy prawdopodobieństwa. Nazwa data_specific_folder nazwa czerwonych/niebieskich i zielono-niebieskich obrazów wygenerowanych w destination_image_folder z komórki 2.1.2. Dla model_dir wprowadź ścieżkę do pliku zawierającego modele segmentacji. Aby segmentować jądra czerwone, użyj modelu erg_rb_opt, a dla epochy wprowadź 200. Zmień probmap_directory_name na folder, w którym będą zapisywane mapy prawdopodobieństwa na czerwono/niebieskie. Powtórz ten krok dla zielonych/niebieskich obrazów. Aby segmentować zielone jądra, użyj modelu edu_mouse_bg_opt, a dla epochy wejść 100.
  9. W komórce 2.3.1 mapy obiektów będą tworzone na podstawie map prawdopodobieństwa wygenerowanych w kroku 6.8. input_folder będzie nazwany od destination_image_folder z komórki 2.1.2, która zawiera czerwone/niebieskie obrazy map prawdopodobieństwa wygenerowane w komórce 2.1.2. Nazwij output_folder, gdzie będą przechowywane obrazy z progiem czerwonym/niebieskim. Ustaw próg poziomu ufności segmentacji jądrowej (zakres 0,0-1,0). Uruchom Cell 2.3.1. Powtórz ten krok dla zielonych/niebieskich obrazów.
    UWAGA: Progi poziomu pewności co do jąder będą zależne od zbioru danych. Zacznij od progu 0,9 i dostosuj wyższy, jeśli jest zbyt łagodny, i niższy, jeśli zbyt surowy, na podstawie losowej analizy map prawdopodobieństwa.
  10. W komórce 2.3.2 liczba komórek w mapach obiektów wygenerowanych w kroku 6.10 zostanie zliczona i wyeksportowana do pliku .csv. count_folder będzie nazwany na cześć output_folder z komórki 2.3.1, gdzie zapisywane są obrazy z progiem czerwonym/niebieskim. Aby wykluczyć obiekty stykające się z krawędzią obrazu, upewnij się, że ignore_border_cells odczytuje True. Przemianuj csv_path na ścieżkę base_folder, w której przechowywane są wszystkie podfoldery. Edytuj nazwę csv, aby odzwierciedlała liczbę obiektów czerwonych/niebieskich. Powtórz ten krok dla obrazów niebieskich/zielonych.
  11. W komórce 2.4 będą liczone zielone/czerwone podwójnie dodatnie jądra. Przemianuj img_folder na nazwę podfolderu wygenerowanego w kroku 6.8, który zawiera przycięte, trójkanałowe obrazy. Przemianuj childcell_folder na output_folder z komórki 2.3.1, gdzie zapisywane są obrazy czerwone/niebieskie z progiem. Przemianuj parentcell_folder na output_folder z komórki 2.3.1, gdzie zapisywane są obrazy progowe zielone/niebieskie. Zmień dest_folder nazwę, aby oznaczać folder, w którym będą zapisywane mapy obiektów z podwójnym dodatnim wynikiem. Zmienij nazwę csv_path na nazwę ścieżki i nazwy pliku na base_folder, w której przechowywane są wszystkie podfoldery, oraz edytuj nazwę csv, aby odzwierciedlała liczbę obiektów podwójnie pozytywnych.
  12. Sprawdź dokładność segmentacji, porównując liczbę czerwonych, zielonych i podwójnie dodatnich wygenerowanych na obraz z obrazem surowym.
    1. Jeśli CardioCount konsekwentnie zawyża liczbę jąder na obrazie względem tego, co policzyłby zaślepiony recenzent, powtórz krok 6.9 z wyższym progiem ufności i powtórz kroki 6.10-6.11. Jeśli CardioCount zaniża liczbę jąder na obrazie w porównaniu do tego, co policzyłby zaślepiony recenzent, powtórz krok 6.9 z niższym progiem ufności i powtórz kroki 6.10-6.11.
  13. Zsumuj wszystkie liczby dla każdego hCO dla jąder czerwonych, zielonych i podwójnie dodatnich. Oblicz % jąder cyklicznych jako (jądra podwójnie dodatnie / łączna liczba jąder czerwonego CM) x 100 dla każdego organoidu.

7. Uraz spowodowany hipoksją i reoxygenacją

  1. Przygotuj podłoże na niedotlenienie (119 mM NaCl, 12 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2, 20 mM mleczanu sodu oraz 5 mM HEPES, pH = 6,4)5.
  2. Do kolby do hodowli komórkowej przelej 5 mL mediów przeciwniedotlenienia na płytkę hCO o 96 dołkach. Umieść kolbę z hodowlą komórek w komorze niedotlenienia i przepłucz gazem anoksowym (5%CO2, 95% N2) przez 3 minuty. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem hipoksji.
  3. Usuń wszystkie media z hCO. Zacznij od usunięcia ~150 μL pipetą wielokanałową ze wszystkich otworów. Następnie użyj pipety o pojemności 200 μL, aby ostrożnie usunąć pozostałe media z pojedynczych dołków, nie naruszając hCO.
    UWAGA: Usunięcie wszystkich materiałów ze wszystkich studni jest kluczowe dla osiągnięcia powtarzalnego uszkodzenia.
  4. Dodaj 50 μL ośrodka hipoksji do każdego dołku. Włóż płytkę hCO do komory niedotlenienia i przepłukaj gazem beztlenowym (5%CO2, 95% N2) przez 3 minuty. Umieść komorę hipoksji w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 6 godzin.
  5. Aby rozpocząć reoxygenację, usuń hCOs z komory hipoksji i podaj 150 μL wcześniej podgrzanego medium RB+. Przed przeprowadzeniem dalszych badań należy pozwolić na co najmniej 3 godziny natlenienia w temperaturze 37 °C.

8. Badanie uwalniania dehydrogenazy mleczanowej

  1. Pobierz 20 μL podłoża z odwiertów z uszkodzonymi i zdrowymi hCOs w pożądanym momencie po rozpoczęciu reperfuzji. Rozcieńcz 1:10 w 180 μL bufora magazynującego LDH (200 mM Tris-HCl (pH 7,3), 10% glicerolu, 1% BSA). Przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu gotowości do wykonania testu. Pipetuj kilka razy, aby wymieszać materiały przed zebraniem
  2. Rozmrozić mrożone media. Dodaj 45 μL bufora LDH do jednej studni płyty 96-dołowej o czarnej ściance i przezroczystym dnie dla każdej próbki nośnika poddawanego badaniu. Dodaj 5 μL rozcieńczonego medium w skali 1:10 do każdej studni, aby uzyskać ostateczne rozcieńczenie 1:100. Przygotuj odczynnik wykrywający LDH, mieszając 50 μL mieszanki enzymów LDH i 0,25 μL substratu reduktazy dla każdej próbki do badania.
  3. Do każdego otworu dodaj 50 μL odczynnika detekcyjnego LDH zawierającego medium rozcieńczone w skali 1:100. Inkubuj w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem, przez 60 minut. Badanie sygnału bioluminescencyjnego na kompatybilnym czytniku płyt.

9. Obrazowanie wapnia

  1. Przygotuj roztwór barwnika wapnia z RPMI-1640 bez fenolu czerwonego, 0,04% pluronowym oraz 5 μM Cal520-AM. Chroń próbki przed światłem.
  2. Usuń 100 μL podłoża z każdej studni przeznaczonej do obrazowania wapnia. Dodaj 100 μL roztworu barwnika wapnia i inkubuj w temperaturze 37 °C, chroniony przed światłem, przez 30 minut.
  3. Usuń 100 μL podłoża z każdego dołku barwnikiem wapniowym i zastąp go 100 μL wolnego od fenolu RPMI-1640. Inkubuj przez 30 minut do 1 godziny w 37 °C, aby barwnik się wypłukał.
  4. Za pomocą mikroskopu z możliwością ciągłego obrazowania/strumieniowania, umieść 96-rowkowy ultra-niski panel mocujący w pozycji roboczej. Przy celu 10x zidentyfikuj podstawę hCO i obserwuj przejściowe zdarzenia Cal520.
  5. Uchwyć 30-sekundowe nagrania przejściowych zjawisk wapnia w temperaturze pokojowej. Jeśli używasz mikroskopu konfokalnego, nie będzie możliwe obrazowanie przez cały hCO. Wybierz płaszczyznę ogniskową blisko podstawy hCO, gdzie podczas przejściowych przypadków wapnia widoczne są kontury komórek.

10. Analiza przejściowych zjawisk wapnia (Rysunek 3)

  1. Analizę przejściowych zjawisk wapnia można przeprowadzić za pomocą różnych programów do analizy szczytów. Poniżej znajdują się instrukcje analizy z użyciem wtyczki Spiky ImageJ41 (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/).
  2. Dodaj pięć obszarów zainteresowania 2 x 2 pikseli (ROI) do Menedżera ROI w widocznych komórkach w każdym hCO. Uważaj, aby nie nakładać ROI na jądra komórkowe lub granice komórek, ponieważ ruch hCO może wpływać na analizę przejściowych.
  3. W sekcji Analizuj > zestaw pomiarów wybierz Średnia intensywność szarości. W menedżerze ROI wybierz Multi-Measure , aby przechwycić średnią intensywność szarości przy wszystkich ROI i wszystkich klatkach nagrania.
  4. Zapisz plik .csv zawierający średnią intensywność szarości dla wszystkich ROI. Zachowaj wszystkie pozycje zwrotu z inwestycji dla każdego obrazu na później.
  5. W nowym arkuszu kalkulacyjnym dodaj kolumnę dla Time(s). Oblicz czas w każdej klatce, dzieląc 30 sekund przez łączną liczbę klatek, a następnie mnożąc przez liczbę klatek. Zachowaj to jako zredagowany .csv.
  6. Otwórz edytowany plik .csv na Fidżi i otwórz wtyczkę Spiky. W sekcji Opcje analizy wybierz pożądane parametry analizy.
  7. Czas wykresu na osi X oraz średnia intensywność szarości dla ROI #1 na osi Y. Wybierz Analizuj szczyty i potwierdź poprawne przypisanie wartości wyjściowej, szczytu startu/końca oraz amplitudy szczytowej. Jeśli zostanie zidentyfikowana błędna liczba szczytów, zmień parametry w opcjach analizy, w tym minimalną amplitudę szczytu względem poziomu wyjściowego, i rozpocznij prog szczytu do momentu pomyślnej identyfikacji szczytów.
  8. Zapisz wszystkie pliki pośrednie. Uderzenia na minutę (bpm) można obliczyć, dzieląc 60 przez średnią z przedziałów szczytu do szczytu dla każdego zwrotu z inwestycji (ROI).
  9. Powtórz powyższą analizę dla wszystkich zwrotów z inwestycji na hCO.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Analiza przejściowych wapnia. (A) Czerwone pole wskazuje przycisk otwierający rozwijane menu do wyboru parametrów analizy. (B) Czerwone pole wskazuje przycisk do wyświetlenia czasu (s) względem średniej intensywności szarości z ROI w obrębie reprezentatywnego, zdrowego hCO. (C) Czerwone pole wskazuje przycisk do wyboru analizy szczytowej. (D) Reprezentatywna analiza przejściowych śladów wapnia i pików z nieuszkodzonego hCO. Czerwone trójkąty oznaczają maksymalny szczyt, różowe kwadraty oznaczają maksymalne nachylenie dla szczytowego ruchu w górę i w dół, zielone pole oznacza początek szczytu, a niebieskie pole oznacza linię bazową. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosowanie powyższego protokołu powinno dać dobrze uformowane hCO, które zaczynają bić między dniami różnicowania 7-12 (D7-12). Gdy hCOs dojrzewają po 25. dniu, spontaniczne skurcze mogą przestać być widoczne bez elektrycznego stymulowania. Uraz H/R może być wykonywany w dowolnym momencie po tym, jak hCOs zaczną bić – zazwyczaj wykonujemy urazy u 15-dniowych (D15) hCOs lub późniejszych.

Potwierdzenie urazu
Podobnie jak zawał mięśnia sercowego u ludzi, uszkodzenie H/R u os...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono tutaj krok po kroku protokół generowania i uszkadzania samoorganizujących się hCOs z H/R. Choroby niedokrwienne serca charakteryzują się remodelacją patofizjologiczną, w tym śmiercią kardiomiocytów, przebudową włóknistą, zaburzeniami elektrycznymi oraz spadkiem funkcji. Te zaburzenia obserwuje się w modelu hCO, w tym wzrost CM TUNEL+ , wzrost uwalniania LDH, zwiększenie powierzchni tkanek Vimentin+ oraz zmiany w obsłudze wapnia prowadzące do utraty synchronizacji funkcjonalnej. Co ważn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te są wspierane przez R01 HL157277 (RK), AHA 24PRE1186062 (LP), F30 HL175908-01 (LP) oraz program szkoleniowy dla naukowców medycznych Duke University T32 5T32GM145449-03 (LP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Roztwór akcutazySigma-AldrichA6964-500ML
Przeciwciało przeciwsercowe przeciwko troponinie TAbcamEPR20266
Suplement B-27 (50X), bez surowicyGibco17504044
Suplement B-27, bez insulinyGibcoA1895602
BioTek Synergy Neo2 Czytnik PłytBioTek
Cal-520, AMAAT Bioquest21131
CardioCount V1Laboratorium KarraPMID: 38984052
Linia komórkowa (Homo sapiens, samiec) - Linia iPSC DU11Rdzeń komórek macierzystych Uniwersytetu Duke
Szkiełka mikroskopu naładowanego, białe szkłoVWR89500-496
CHIR 99021Tocris4423
CloneRSTEMCELL Technologies5888
Corning 96-dołkowy przezroczysty mikropłytki ultra o niskim przyczepieniuFisher7007
Jednorazowe zbiorniki pipetowaniaVWR89094-678
DMEM/F-12, HEPESGibco11330057
Mikroskop fluorescencyjny EVOSEVOS
Matryca bazalnej błony Geltrex o obniżonym współczynniku wzrostu (Domain-Membrane Mine), wolna od LDEV, kwalifikowana dla komórek macientycznychGibcoA1413302
Aktywność człowieka – białko rekombinowanePEPROTECH INC/Life Technologies120-14E-50UG
IWP-2STEMCELL Technologies72124
Kwas L-askorbinowy (krystaliczny/certyfikowany ACS)Fisher ScientificA61-100
Mysz anty-VimentinDSHBAMF-17b
mTeSR PlusSTEMCELL Technologies100-0276
Wielowarstwowe płytki hodowli komórkowej itd.; 12 studniVWR10062-894
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
ReLeSRSTEMCELL Technologies100-0483
RPMI 1640 MediumGibco11875119
RPMI 1640 Medium, bez fenolu czerwonegoGibco11835-030
ThiazovivinSTEMCELL Technologies72254
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSAKURA FINETEK USA INC (VWR)25608-930
Mikroskop konfokalny Zeiss Obracający DyskZeiss

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bozkurt, B., et al. Heart failure epidemiology and outcomes statistics: A report of the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 29 (10), 1412-1451 (2023).
  2. Groenewegen, A., Rutten, F. H., Mosterd, A., Hoes, A. W. Epidemiology of heart failure. Eur J Heart Fail. 22 (8), 1342-1356 (2020).
  3. Ss, M., et al. 2025 heart disease and stroke statistics: A report of us and global data from the american heart association. Circulation. 151 (8), e41-e660 (2025).
  4. Sebastião, M. J., et al. Bioreactor-based 3d human myocardial ischemia/reperfusion in vitro model: A novel tool to unveil key paracrine factors upon acute myocardial infarction. Transl Res. 215, 57-74 (2020).
  5. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. Human tissue-engineered model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Tissue Eng Part A. 25 (9-10), 711-724 (2019).
  6. Frangogiannis, N. G. Why animal model studies are lost in translation. J Cardiovasc Aging. 2 (2), 22(2022).
  7. Forrest, M. J., et al. Torcetrapib-induced blood pressure elevation is independent of cetp inhibition and is accompanied by increased circulating levels of aldosterone. Br J Pharmacol. 154 (7), 1465-1473 (2008).
  8. Barter, P. J., et al. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary events. New Engl J Med. 357 (21), 2109-2122 (2007).
  9. Wilensky, R. L., et al. Inhibition of lipoprotein-associated phospholipase a2 reduces complex coronary atherosclerotic plaque development. Nat Med. 14 (10), 1059-1066 (2008).
  10. Investigators, T. S. Darapladib for preventing ischemic events in stable coronary heart disease. New Engl J Med. 370 (18), 1702-1711 (2014).
  11. Debenedittis, P., et al. Coupled myovascular expansion directs cardiac growth and regeneration. Development. 149 (18), dev200654(2022).
  12. Hojo, Y., et al. Expression of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. J Am College Cardiol. 35 (4), 968-973 (2000).
  13. Lodrini, A. M., et al. Modeling cardiac injury using human cardiac slices to test therapeutic approaches for cardiac regeneration and repair. Eur Heart J. 44 (Supplement_2), ehad655.730(2023).
  14. Arstall, M. A., et al. Human ventricular myocytes in vitro exhibit both early and delayed preconditioning responses to simulated ischemia. J Mol Cell Cardiol. 30 (5), 1019-1025 (1998).
  15. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: At the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev. Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  16. Narsinh, N., Narsinh, K. H., Wu, J. C. Derivation of human induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling. Circ Res. 108 (9), 1146-1156 (2011).
  17. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  18. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  19. Lyra-Leite, D. M., et al. A review of protocols for human ipsc culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 3 (3), 101560(2022).
  20. Hofbauer, P., Jahnel, S. M., Mendjan, S. In vitro models of the human heart. Development. 148 (16), dev199672(2021).
  21. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nat Commun. 8 (1), 1825(2017).
  22. Baar, K., et al. Self-organization of rat cardiac cells into contractile 3-d cardiac tissue. Faseb J. 19 (2), 275-277 (2005).
  23. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  24. Kahn-Krell, A., et al. A three-dimensional culture system for generating cardiac spheroids composed of cardiomyocytes, endothelial cells, smooth-muscle cells, and cardiac fibroblasts derived from human induced-pluripotent stem cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 908848(2022).
  25. Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells. J Vis Exp. (175), e63097(2021).
  26. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 12 (1), 5142(2021).
  27. Jackman, C. P., et al. Engineered cardiac tissue patch maintains structural and electrical properties after epicardial implantation. Biomaterials. 159, 48-58 (2018).
  28. Deluca, S., et al. Engineered cardiac tissues as a platform for crispr-based mitogen discovery. Adv Healthc Mater. 14 (1), e2402201(2025).
  29. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317.e22 (2021).
  30. Schmidt, C., et al. Multi-chamber cardioids unravel human heart development and cardiac defects. Biorxiv. , (2022).
  31. Hoang, P., et al. Engineering spatial-organized cardiac organoids for developmental toxicity testing. Stem Cell Rep. 16 (5), 1228-1244 (2021).
  32. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nat Biomed Eng. 4 (4), 446-462 (2020).
  33. Abdallah, H., Toomey, K., O'riordan, A. C., Davidson, A., Marks, L. A. Familial occurrence of discrete subaortic membrane. Pediatr Cardiol. 15 (4), 198-200 (1994).
  34. Lin, H., McBride, K. L., Garg, V., Zhao, M. T. Decoding genetics of congenital heart disease using patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs). Front Cell Dev Biol. 9, 630069(2021).
  35. Keung, W., et al. Human cardiac ventricular-like organoid chambers and tissue strips from pluripotent stem cells as a two-tiered assay for inotropic responses. Clin Pharmacol Ther. 106 (2), 402-414 (2019).
  36. Kupfer, M. E., et al. In situ expansion, differentiation, and electromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3d bioprinted, chambered organoid. Circ Res. 127 (2), 207-224 (2020).
  37. Marini, V., et al. Long-term culture of patient-derived cardiac organoids recapitulated duchenne muscular dystrophy cardiomyopathy and disease progression. Front Cell Dev Biol. 10, 878311(2022).
  38. Mills, R. J., et al. Drug screening in human psc-cardiac organoids identifies pro-proliferative compounds acting via the mevalonate pathway. Cell Stem Cell. 24 (6), 895-907.e6 (2019).
  39. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), E8372-E8381 (2017).
  40. Karpurapu, A., et al. Deep learning resolves myocardial dynamics in the failing human heart. JACC Basic Transl Sci. 9 (5), 674-686 (2024).
  41. Pasqualin, C., et al. Spiky: An imagej plugin for data analysis of functional cardiac and cardiomyocyte studies. J Imaging. 8 (4), 95(2022).
  42. Kuppe, C., et al. Spatial multi-omic map of human myocardial infarction. Nature. 608, 7924(2022).
  43. Karra, R., et al. Vegfaa instructs cardiac muscle hyperplasia in adult zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (35), 8805-8810 (2018).
  44. Ab, A., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. J CliniInvest. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  45. Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. Elife. 6, e25605(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hypoxia ReoxygenationCardiac OrganoidsHuman CardioidsIschemia ReperfusioniPSC Derived OrganoidsSuspension CultureCryosectioningFluorescence MicroscopyScar FormationCardiomyocyte Apoptosis

Related Articles