Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania produkcji tlenku azotu (NO) w kulturach nabłonka dróg oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-ciecz (ALI) poprzez pomiar azotynów w sekretach wierzchołkowych za pomocą testu chemiluminescencyjnego opartego na trijodku.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena produkcji tlenku azotu w kulturach ludzkich komórek nabłonkowych przewodów oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-płyn
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kultury nabłonka dróg oddechowych zdyferencjowanych na granicy powietrze-płyn (ALI) zapewniają fizjologicznie istotny model do badania sygnalizacji tlenku azotu (NO) w komórkach rzęskowych. Opisujemy tu protokół ilościowego wyznaczania produkcji NO przez pomiar azotynów (NO₂⁻), stabilnego produktu utleniania NO, w próbkach pobranech z zdyferencjowanych na ALI komórek nabłonka tchawicy myszy. Płukanki wierzchołkowe, podłoże podstawowe i lizaty komórkowe są pobierane i analizowane za pomocą testu chemiluminescencji opartego na trijodku sprzężonego z analizatorem tlenku azotu (NOA). Po wstrzyknięciu do naczynia reakcyjnego, azotyn jest chemicznie redukowany do NO, które jest wykrywane przez chemiluminescencję opartą na ozonie. Intensywność sygnału jest ilościowo wyznaczana i przeliczana na pikomoli azotynów za pomocą standardowej krzywej kalibracyjnej, a wartości są normalizowane do całkowitego zawartości białka komórkowego. Wykonanie testu jest zweryfikowane poprzez farmakologiczne modulowanie poziomów NO. Po leczeniu donorem NO Diethylenetriamine NONOate (DETA-NONOate) i inhibitorem syntazy NO N(ω)-Nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) obserwujemy istotne różnice w poziomach azotynów w różnych warunkach. Najbardziej mocny i powtarzalny sygnał obserwujemy w płukankach wierzchołkowych, odpowiadający ilości NO uwolnionej z nabłonka dróg oddechowych. Ta metoda niezawodnie wykrywa NO w próbkach z zdyferencjonowanych na ALI nabłonków dróg oddechowych, zapewniając dokładną platformę in vitro do ilościowego wyznaczania produkcji NO i modelowania chorób związanych z nieprawidłowym metabolizmem NO.
Wprowadzenie
Cecha charakterystyczna kilku chorób dróg oddechowych, w tym astmy, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (COPD), mukowiscydozy (CF) i pierwotnej dyskinezy rzęsek (PCD), to zmieniona homeostaza tlenku azotu (NO), mierzalna jako zmiany w poziomach NO w wydychanym powietrzu, które mogą znacznie się różnić w tych chorobach, będąc podwyższone w COPD i astmie1,2, podczas gdy drastycznie obniżone w CF i PCD3,4. Te choroby zwykle wykazują nieprawidłowości w ruchliwych rzęskach nabłonka dróg oddechowych, będących kluczowymi wykonawcami wydzieliny skrzeplinowej5. Ponieważ NO i jego ścieżki sygnałowe są krytycznymi regulatorami ruchliwości rzęsek, zrozumienie, jak produkcja i przekazywanie sygnałów przez NO są zmienione w tych kontekstach, jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów dysfunkcji skrzeplinowej. Dlatego metoda, która umożliwia precyzyjne wykrywanie produkcji i uwalniania NO w nabłonku dróg oddechowych, dostarcza cenne narzędzie do analizy regulacji i fizjologicznej roli tego cząsteczki sygnałowej. Takie podejścia są szczególnie przydatne w warunkach eksperymentalnych, gdzie bezpośrednie pomiary NO są trudne ze względu na jego krótki okres półtrwania i szybką reaktywność.
NO reguluje biogenezę i funkcję rzęsek dróg oddechowych, wpływając na polaryzację komórek rzęskowanych i skoordynowaną ruchliwość rzęsek6,7,8. Jednak mechanizmy utrzymujące homeostazę NO w drogach oddechowych pozostają niedostatecznie zrozumiałe. Kultury nabłonka dróg oddechowych zróżnicowane na interfejsie powietrze-ciecz (ALI) zapewniają cenny system in vitro do badania tych mechanizmów. Obecnie model ten jest szeroko stosowany do badania wpływu bodźców środowiskowych na nabłonek dróg oddechowych9,10,11 oraz do wyjaśnienia patofizjologii chorób dróg oddechowych12. W porównaniu z konwencjonalnymi kulturami zanurzonymi13,14, epitelium zróżnicowane w ALI bardziej wiernie odwzorowuje architekturę i funkcję natywnych dróg oddechowych, w tym polaryzację nabłonka, różnicowanie skrzeplinowe i realistyczną wymianę gaz-ciecz, czyniąc je szczególnie odpowiednimi do badania apikalnego uwalniania NO, przekazywania sygnałów i związanej z tym funkcji rzęsek. Ten system jest zatem dobrze przystosowany do eksperymentów mających na celu ilościowe określenie metabolitów pochodnych NO uwolnionych do światła dróg oddechowych, szczególnie w warunkach zróżnicowania nabłonka lub manipulacji farmakologicznej.
Dokładne pomiary stężenia NO są niezbędne, ponieważ zarówno nadmierne, jak i niedostateczne poziomy NO mogą upośledzać funkcję rzęsek. Obecnie dostępne metody oparte na sondach fluorescencyjnych (np. diaminofluoresceiny, DAF) do wykrywania NO są tylko półilościowe i ograniczone przez wrażliwość na pH, zależność od tlenu i brak specyficzności, ponieważ mogą reagować z utleniaczami i przeciwutleniaczami komórkowymi, prowadząc do półilościowych pomiarów15. Ponadto elektrochemiczne czujniki (np. amperometryczne elektrody czułe na NO) umożliwiają wykrywanie NO w czasie rzeczywistym16, ale mogą być trudne do zaimplementowania w złożonych systemach biologicznych ze względu na krótki okres półtrwania NO, zakłócenia wynikające z biofoulingu powierzchni elektrod przez gatunki aktywne redoks oraz wyzwania związane z utrzymaniem stabilnej kalibracji17. Opisano również alternatywne podejścia chemiluminescencyjne, w tym bezpośrednie wykrywanie NO w fazie gazowej i redukcyjne testy docelujące różnym gatunkom tlenku azotu, ale ich zastosowanie do kultur nabłonka dróg oddechowych nie zostało jeszcze zbadane. Ograniczenia te podkreślają potrzebę wrażliwych, ilościowych metod, które mogą niezawodnie wykrywać niskie poziomy gatunków pochodnych NO w małych objętościach próbek biologicznych. Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, ustanowiliśmy protokół ilościowego określania NO w sekretach apikalnych pobrane z zróżnicowanych nabłonków dróg oddechowych na interfejsie powietrze-ciecz za pomocą Analizatora Tlenku Azotu (NOA). NOA to wysoce wrażliwy detektor chemiluminescencyjny tradycyjnie stosowany do pomiaru metabolitów NO w próbkach chemicznych, a ostatnio dostosowany do analizy próbek biologicznych, w tym krwi, homogenatów tkankowych i nadstanów kultur komórkowych7,18,19. NO jest wysoce reaktywną cząsteczką sygnałową szybko utlenianą do azotynu w tkankach w warunkach normalnego poziomu tlenu, z wyjątkowo krótkim okresem półtrwania. Dlatego azotyn jako końcowy produkt utleniania NO służy jako wskaźnik całkowitej produkcji NO w systemach biologicznych20,21,22. Ta
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały przejrzane i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Zastosowań Uniwersytetu Maryland (Protokół nr AUP–00004632).
UWAGA: Protokół wymaga około 2 dni na izolację komórek nabłonka tchawicy myszy (MTEC), a następnie 7–10 dni na ekspansję, 5–6 dni na proliferację w wkładkach transwell, 21 dni na różnicowanie (czas potrzebny na uzyskanie wystarczającej liczby wielocyliowych komórek), 24 h leczenia lekami i jeden dodatkowy dzień na pobieranie próbek, kalibrację NOA, zastrzyki i pozyskiwanie danych.
1. Przygotowanie mediów i roztworów
UWAGA: Szczegóły dotyczące składników mediów znajdują się w Tabeli 1.
- Środek Ham’s F–12
- Przygotuj roztwór w sterylnej komorze laminarnej. Dodaj 5 mL 100× antybiotyków Penicylina/Streptomycyna i 0,5 mL Amfoteracyny B (Fungizone) do 500 mL środka Ham’s F12 w sterylnej butelce.
- Wymieszaj delikatnie odwracając butelkę 5–10 razy, aby zapewnić pełne wymieszanie. Przefiltruj sterylnie roztwór za pomocą filtra 0,22 µm w sterylnych warunkach i przechowuj w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Penicylina/streptomycyna i amfoteracyna B to środki przeciwdrobnoustrojowe, które mogą powodować podrażnienia lub reakcje alergiczne. Obsługiwać za pomocą odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym rękawic i fartucha laboratoryjnego.
- Roztwór pronazy
- Dodaj 15 mg pronazy do 10 mL sterylnego środka Ham’s F12 w sterylnym probówce, aby uzyskać 0,15% roztwór pronazy. Wymieszaj delikatnie odwracając lub pipetując w górę i w dół, aż pronaza zostanie całkowicie rozpuszczona. Przygotuj świeżo tuż przed użyciem.
- Roztwór DNAza I
- Dodaj 5 mg surowej pankreatycznej DNAzy I do 9 mL środka Ham’s F12 i 1 mL 10 mg/mL roztworu albuminy surowicy wołowej (BSA) w sterylnej probówce, aby uzyskać 0,5 mg/mL roztwór DNAzy I.
- Delikatnie wymieszaj pipetując w górę i w dół, unikając tworzenia się bąbelek. Po całkowitym rozpuszczeniu, porcjuj roztwór do 1 mL sterylnych probówek mikrowirówkowych i przechowuj w temperaturze -20 °C.
- Środek Ham’s F12 z surowicą wołową (FBS)
- Przygotuj roztwór w temperaturze pokojowej w sterylnej komorze laminarnej. Dodaj 10 mL surowicy wołowej (FBS) do 40 mL środka Ham’s F12 z antybiotykami w sterylnym stożkowym probówce, aby uzyskać 20% FBS w środku F12.
- Delikatnie wymieszaj odwracając probówkę 5–10 razy, aż roztwór będzie jednorodny. Przefiltruj sterylnie roztwór za pomocą filtra 0,22 µm w sterylnych warunkach i przechowuj w temperaturze 4 °C.
- Środek do ekspansji MTEC
- Przygotuj środek do ekspansji MTEC w temperaturze pokojowej w sterylnej komorze laminarnej, łącząc składniki wymienione w Tabeli 1 w sterylnym probówce.
- Delikatnie wymieszaj, odwracając lub wirując pojemnik, aż wszystkie składniki będą całkowicie połączone. Przefiltruj sterylnie roztwór za pomocą filtra 0,22 µm w sterylnych warunkach.
- Tuż przed użyciem dodaj inhibitor ROCK Y–27632 (roztwór 5 mM) do stężenia końcowego 10 µM i inhibitor sekretaz Notch DAPT (roztwór 10 mM) do stężenia końcowego 5 µM i delikatnie wymieszaj odwracając.
- Środek do proliferacji MTEC
- Przygotuj środek do proliferacji MTEC w temperaturze pokojowej w sterylnej komorze laminarnej, łącząc składniki wymienione w Tabeli 1.
- Delikatnie wymieszaj odwracając lub wirując, aż wszystkie składniki będą całkowicie połączone. Przefiltruj sterylnie środek za pomocą filtra 0,22 µm w sterylnych warunkach.
- Tuż przed użyciem dodaj inhibitor ROCK Y–27632 (roztwór 5 mM) do stężenia końcowego 10 µM i kwas retinowy (roztwór 5 µM) do stężenia końcowego 0,05 µM. Wymieszaj delikatnie odwracając przed użyciem.
- Środek do różnicowania MTEC
- Przygotuj środek do różnicowania MTEC w temperaturze pokojowej w sterylnej komorze laminarnej, łącząc składniki wymienione w Tabeli 1 w sterylnym pojemniku.
- Delikatnie wymie
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie poziomu tlenku azotu (NO) w hodowlach komórek nabłonka tchawicy myszy (MTEC) różnicowanych na granicy faz powietrze-ciecz (ALI). Komórki pierwotne są izolowane i różnicowane zgodnie z uznanymi protokołami27,28. W ciągu 21 dni w warunkach ALI komórki różnicują się w pseudowielowarstwowy nabłonek dróg oddechowych zawierający komórki rzęsiste27,28....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wielocząsteczkowe komórki w nabłonku dróg oddechowych są kluczowe dla syntezy i sygnalizacji NO, co z kolei jest niezbędne do regulowania ruchu rzęsek, oczyszczania śluzowo-rzęskowego i homeostazy dróg oddechowych6,7,8. NO jest bardzo reaktywną cząsteczką, a nawet niewielkie zmiany w poziomach NO są związane z chorobami dróg oddechowych1,2,3<...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr. Mark T. Gladwin (dziekan i profesor, University of Maryland School of Medicine) za wskazówki dotyczące projektu badań. Dziękujemy również Confocal Microscopy Core (Baltimore, MD) z University of Maryland School of Medicine za dostęp do zasobów mikroskopii konfokalnej. Ta praca była wspierana przez grant Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) 5R01HL168775 przyznany dr. Paoli Corti.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | rozcieńczony 1:2000 do immunobarwienia |
| 50 mL rurka do wirówki z filtrem (0,22 µm) | CellTreat | 229710 | Do przygotowania sterylnych roztworów |
| 500 mL jednostki filtracyjne | ThermoFisher Scientific | 566-0020 | Do przygotowania sterylnych mediów |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Amphoterecin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
| Wyciąg z gruczołu przytarczowego bydła | ThermoFisher Scientific | 13028014 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma | A7906 | |
| Toksyna cholery | Sigma | C8052 | |
| Kolagen I | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
| Mikroskop konfokalny | Nikon | W1 Mikroskop o obrocie dysku Ti2 z kamerą Hamamatsu sCMOS | |
| Wkładki Corning Transwell | Sigma | CLS3460 | |
| Diethylenetriamine NONOate (DETA-NONOate) | Cayman Chemical | 82120 | |
| Media DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| DNAza I | Sigma | DN25 | |
| Fetalne surowica wołowa | Sigma | F4135 | |
| Kompleks inhibitorów proteazy Halt 1X | ThermoFisher Scientific | 1860932 | |
| Mieszanka składników odżywczych Ham's F1-12 | ThermoFisher Scientific | 11765054 | |
| Roztwór insuliny | Sigma | I0516 | |
| Izoprenaline chlorowodorek | Sigma | I6504 | |
| Środki bez surowicy keratynocytowej | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
| Czynnik wzrostu naskórka mysiego | Sigma | E4127 | |
| N(G)-Nitro-L-arginina metyloester (L-NAME) | Sigma | N5751 | |
| NuSerum | Corning | 355100 | |
| Penicylina-streptomycyna | Sigma | P4333 | |
| Puffer fosforanowy (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Pronaza | Sigma | 10165921001 | |
| Kwas retinowy | Sigma | R2625 | |
| Inhibitor Rho kinazy (Y-27632 chlorowodorek) | Cayman Chemical | TOM-C837Z37 | |
| Puffer RIPA | Sigma | R0278 | |
| Media RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Azotyn sodu | Sigma | S2252 | |
| Transferyna | Sigma | T8158 | |
| Przeciwciało przeciwko α-acetylowanej tubulinie (mysz) | Sigma | T6793 | rozcieńczony 1:200 do immunobarwienia |
| Przeciwciało przeciwko α-FoxJ1 (mysz) | ThermoFisher Scientific | 14-9965-80 | rozcieńczony 1:200 do immunobarwienia |
| Przeciwciało wtórnego α-myszCy3 | ThermoFisher Scientific | A10521 | rozcieńczony 1:1000 do immunobarwienia |
| Inhibitor γ-sekretaz IX (DAPT) | Sigma | D5942 |
Bibliografia
- Alcázar–Navarrete, B., Ruiz Rodríguez, O., Conde Baena, P, Romero Palacios, P. J., Agusti, A. Persistently elevated exhaled nitric oxide fraction is associated with increased risk of exacerbation in COPD. Eur Respir J. 2018;51(1):1701457.
- Krantz, C., Janson, C., Alving, K., Malinovschi, A. Nasal nitric oxide in relation to asthma characteristics in a longitudinal asthma cohort study. Nitric Oxide 2021;106:1–8.
- Thomas, S. R., Kharitonov, S. A., Scott, S. F., Hodson, M. E., Barnes, P. J. Nasal and exhaled nitric oxide is reduced in adult patients with cystic fibrosis and does not correlate with cystic fibrosis genotype. Chest 2000;117(4):1085–9.
- Shapiro, A. J. et al. Nasal nitric oxide measurement in primary ciliary dyskinesia. A technical paper on standardized testing protocols. Ann Am Thorac Soc. 2020;17(2):e1–e12 .
- Legendre, M., Zaragosi, L. E., Mitchison, H. M. Motile cilia and airway disease. Semin Cell Dev Biol. 2021;110:19–33.
- Li, D., Shirakami, G., Zhan, X., Johns, R. A. Regulation of ciliary beat frequency by the nitric oxide–cyclic guanosine monophosphate signaling pathway in rat airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(2):175–81.
- Rochon, E. R. et al. Cytoglobin regulates NO-dependent cilia motility and organ laterality during development. Nat Commun. 2023;14(1): 8333.
- Mikhailik, A. et al. nNOS regulates ciliated cell polarity, ciliary beat frequency, and directional flow in mouse trachea. Life Sci Alliance 2021;4(5):e202000981.
- Schamberger, A. C., Staab–Weijnitz, C. A., Mise–Racek, N., Eickelberg, O. Cigarette smoke alters primary human bronchial epithelial cell differentiation at the air–liquid interface. Sci Rep. 2015;5:8163.
- Gindele, J. A. et al. Intermittent exposure to whole cigarette smoke alters the differentiation of primary small airway epithelial cells in the air–liquid interface culture. Sci Rep. 2020;10(1):6257.
- Ghosh, B. et al. Effect of sub-chronic exposure to cigarette smoke, electronic cigarette and waterpipe on human lung epithelial barrier function. BMC Pulm Med. 2020;20(1):216.
- Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. Air-liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: promises, challenges and future directions. Adv Nanobiomed Res. 2021;1(6):2000111.
- Bessa, M. J. et al. In vitro toxicity of industrially relevant engineered nanoparticles in human alveolar epithelial cells: Air-liquid interface versus submerged cultures. Nanomaterials (Basel) 2021;11(12):3225.
- Allouche, Y. et al. Comparison of submerged and air liquid interface exposure: limitations and differences in the toxicological effects evaluated in bronchial epithelial cells. Environ Res. 2025;279(Pt 2):121856.
- Li, J., LoBue, A., Heuser, S. K., Leo, F., Cortese-Krott, M. M. Using diaminofluoresceins (DAFs) in nitric oxide research. Nitric Oxide. 2021;115:44–54.
- Jiang S. et al. Real–time electrical detection of nitric oxide in biological systems with sub–nanomolar sensitivity. Nat Commun. 2013;4:2225.
- Brown M. D, Schoenfisch M. H. Electrochemical nitric oxide sensors: Principles of design and characterization. Chem Rev. 2019;119(22):11551–75.
- Corti, P. et al. Globin X is a six-coordinate globin that reduces nitrite to nitric oxide in fish red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2016;113(30):8538–43.
- Zhao, X. J. et al. Mechanisms for cellular NO oxidation and nitrite formation in lung epithelial cells. Free Radic Biol Med. 2013;61:428–37.
- Lundberg, J. O. Weitzberg E, Gladwin MT. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2008;7(2):156–67.
- Rochon, E. R., Corti, P. Globins and nitric oxide homeostasis in fish embryonic development. Mar Genomics 2020;49:100721.
- Giordano, D., Verde, C., Corti, P. Nitric oxide production and regulation in the teleost cardiovascular system. Antioxidants (Basel) 2022;11(5):957.
- MacArthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S–nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;851(1–2):93–105.
- Basu, S., Ricart, K., Gladwin, M. T., Patel, R. P, Kim-Shapiro, D. B. Tri-iodide and vanadium chloride based chemiluminescent methods for quantification of nitrogen oxides. Nitric Oxide 2022;121: 11–19.
- Brody, S. L., Yan, X. H., Wuerffel, M. K., Song, S. K., Shapiro, S. D. Ciliogenesis and left-right axis defects in forkhead factor HFH-4-null mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(1): 45–51.
- Jain, R. et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010;43(6): 731–9.
- Eenjes, E. et al. A novel method for expansion and differentiation of mouse tracheal epithelial cells in culture. Sci Rep. 2018;8(1): 7349.
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002;283(6): L1315–21.
- Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. Br J Pharmacol 1996;118(6):1433–40.
- Rochon, E. R., Corti, P., Gladwin, M. T. Hemoglobin α in Pulmonary Endothelium: Ironing Out Nitric Oxide Signaling. Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;57(6):639–41.
- van Faassen, E. E. et al. Nitrite as regulator of hypoxic signaling in mammalian physiology. Med Res Rev. 2009;29(5):683–741.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
