Workflow do wizualizacji dynamiki konformacji białek z map krio-EM z wykorzystaniem ludzkiej syntetazy asparaginy

Summary

Protokół ten określa, jak przeprowadzić analizę zmienności 3D (3DVA) w CryoSPARC oraz udoskonalanie zmienności w Phenix, aby analizować heterogeniczność konformacji danych krio-EM. Na przykładzie ludzkiej syntetazy asparaginy opisuje on, jak generować mapy zmienności, wizualizować główne składniki oraz udoskonalać odpowiadające mu modele atomowe.

Abstract

Niniejszy artykuł przedstawia kompleksowy sposób analizy heterogeniczności konformacyjnej w danych z mikroskopii krioelektronowej pojedyncząstkowej (cryo-EM) z wykorzystaniem analizy zmienności 3D (3DVA) w CryoSPARC oraz udoskonalania zmienności w Phenix. Protokół opisuje, jak obliczać mapy zmienności wzdłuż głównych składników pochodzących z obrazów cząstek, wizualizować główne tryby zmienności strukturalnej oraz doprecyzować odpowiadające zespoły modeli atomowych względem poszczególnych układów zmienności. Efektem wyjścia są seria map zmienności 3D, udoskonalone struktury atomowe wielomodelowe reprezentujące dyskretne stany konformacyjne oraz pliki wizualizacyjne odpowiednie do porównawczej analizy strukturalnej i generowania filmów. Ten sposób pracy jest szeroko stosowany w rekonstrukcjach kriogenicznych w zakresie rozdzielczości (zazwyczaj ~2,0-6,0 Å), gdzie heterogeniczność konformacyjną może być istotnie interpretowana na poziomie kręgosłupa i łańcucha bocznego. Jest szczególnie odpowiednia do rejestrowania ciągłych ruchów domenowych, ruchów zawiasów oraz skoordynowanych lokalnych przearanżowań, które nie są łatwe do rozstrzygnięcia przez samą klasyfikację dyskretną. Połączone wykorzystanie map zmienności i udoskonalonych zespołów modeli umożliwia bezpośrednie porównanie strukturalne skrajności konformacji, wspiera analizy ilościowe, takie jak obliczania fluktuacji korzeni-średni-kwadrat (RMSF), oraz dostarcza ram do łączenia dynamicznych cech strukturalnych z hipotezami biochemicznymi lub funkcjonalnymi. Ludzka syntetaza asparaginowa (ASNS) jest wykorzystywana jako przykład do demonstracji praktycznego wdrożenia tego przepływu pracy.

Introduction

Charakteryzacja heterogeniczności konformacyjnej w strukturach makrocząsteczkowych jest coraz ważniejszym aspektem analizy krio-elektronowej mikroskopii pojedynczej cząstki (cryo-EM). Celem tego protokołu jest zapewnienie praktycznego workflow do wydobywania się, wizualizacji i udoskonalania dominujących trybów zmienności strukturalnej bezpośrednio z zestawów danych krio-EM, wykorzystując analizę zmienności trójwymiarowej (3DVA) w CryoSPARC¹ połączoną z udoskonalaniem zmienności w Phenix². Niniejszy artykuł ma na celu pomóc czytelnikom w ocenie, czy takie podejście obliczeniowe jest odpowiednie dla ich danych oraz w zrozumieniu rodzajów wyników generowanych przez ten przepływ pracy.

Tradycyjne techniki eksperymentalne (np. wymiana wodor-deuter, spektroskopia NMR, spektrometria mas) dostarczają cennych informacji o ruchach białek ^3,4,5, ale często są ograniczone przez wielkość cząsteczki, wymagania dotyczące próbki lub złożoność eksperymentu. Postępy w kriogeniczności EM-y umożliwiły wysokorozdzielcze określenie struktury dla dużych i heterogenicznych układów, umożliwiając analizę zmienności konformacyjnej w populacjach cząstek. Analiza zmienności 3D (3DVA), zaimplementowana w CryoSPARC¹, rozkłada zbiory danych o cząstkach krio-EM na główne komponenty opisujące dominujące, ciągłe tryby zmienności strukturalnej. W połączeniu z udoskonalaniem zmienności w Phenix², podejście to generuje modele atomowe odpowiadające dyskretnym pozycjom każdego głównego komponentu, umożliwiając wizualizację i porównanie alternatywnych konformacji pochodzących z danych eksperymentalnych.

Protokół ten najlepiej sprawdza się w zestawach danych krio-EM rekonstruowanych z rozdzielczością bliską atomowej do średniej (zazwyczaj ~2-6 Å). Przy wyższych rozdzielczościach workflow może uchwycić przekształcenia szkieletu i ograniczoną zmienność łańcucha bocznego⁶, natomiast przy niższych rozdzielczościach jest bardziej odpowiedni do identyfikacji ruchów na poziomie domeny lub struktury wtórnej ^2,7. Metoda ta jest przystosowana do uchwycenia dominujących, ciągłych trybów ruchu szeroko rozpowszechnionych w zbiorze danych, takich jak ruchy zawiasów, oddychanie domen czy skoordynowane przemiany między domenami lub podjednostkami. Odpowiednia liczba cząstek i pokrycie kątowe są niezbędne, a interpretacja może być ograniczona w elastycznych lub słabo rozdzielczych obszarach, gdzie pozycje łańcucha bocznego pozostają niejednoznaczne. W porównaniu ze strategiami klasyfikacji⁸ lub ekstensywnej podklasyfikacji, workflow doprecyzowania zmienności 3D reprezentuje heterogeniczność konformacyjną jako trajektorie ciągłe, a nie klasy dyskretne. To sprawia, że metoda ta jest szczególnie przydatna do analizy eksploracyjnej enzymów, maszyn molekularnych i kompleksów wielodomenowych, które mają pobierać próbki z wielu konformacji.

Syntetaza asparaginowa u ludzi (ASNS) jest użyta jako ilustracyjny przykład demonstrujący wdrożenie protokołu. ASNS to amidotransferaza zależna od glutaminy, składająca się z dwóch domen funkcjonalnych połączonych wewnątrzcząsteczkowym tunelem amoniaku ^9,10. Wcześniejsze badania sugerowały, że zmiany konformacyjne dotyczące reszt takich jak Arg-142 przyczyniają się do modulacji tego tunelu⁶. W tym artykule ASNS służy wyłącznie jako reprezentatywny system do demonstracji, jak 3DVA i udoskonalanie zmienności generują mapy zmienności, udoskonalane zespoły modeli atomowych oraz wizualizacje. Szczegółowa interpretacja mechanistyczna jest przekazywana do sekcji Wyniki i Dyskusja. Chociaż symulacje dynamiki molekularnej (MD) są często stosowane jako uzupełniające podejście do eksploracji krajobrazów konformacyjnych^11,12, MD nie jest wymagany dla tego protokołu. Porównania z symulacjami MD mogą być wykonywane jako opcjonalna analiza dalsza, ale opisany tutaj workflow (Rysunek 1) koncentruje się wyłącznie na wydobyciu i wizualizacji heterogeniczności konformacyjnej z danych kriogenicznych.

Rysunek 1. Przegląd workflow. Konsensusowa mapa kriogeniczna jest rekonstruowana z danych pojedynczych cząstek i poddawana analizie trójwymiarowej zmienności (3DVA), aby uzyskać mapy zmienności wzdłuż głównych komponentów. Udoskonalanie zmienności (Phenix.varref) wykorzystuje konsensusowy model atomowy do generowania odpowiadających im modeli atomowych do wizualizacji i porównania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Protocol

1. Przygotowanie danych

1. Generowanie konsensusowej mapy EM
   1. Do określenia konsensualnej trójwymiarowej struktury makrocząsteczkowego kompleksu makrocząsteczkowego wykorzystaj mikroskopię krio-elektronową (cryo-EM) z pojedyncząstką.
   2. Próbki witryfikuj na krio-siatkach i obrazuj za pomocą mikroskopu elektronowego transmisyjnego wysokiego napięcia wyposażonego w bezpośredni detektor elektronów.
   3. Przetworz zebrane filmy w celu skorygowania ruchu wywołanego wiązką, oszacowania parametrów obrazowania i wyboru obrazów cząstek.
   4. Wykonaj iteracyjną klasyfikację i dopracowywanie cząstek, aby wygenerować konsensusową mapę EM.
   5. Przetwarzaj dane za pomocą CryoSPARC (wersja 4 lub nowsza)¹³, ponieważ zostanie zaimplementowana analiza zmienności 3D (3DVA).
2. Wygeneruj model konsensusu
   1. Zbuduj model atomowy i dopracuj go na mapie konsensusu. Weryfikacja jakości modelu udoskonalonego według standardowych kryteriów
      UWAGA: W przypadku ASNS struktura została wyznaczona przy użyciu strategii wyboru cząstek opartej na szablonie. Szablon pochodzący ze struktury rentgenowskiej ludzkiego ASNS (PDB 6GQ3)⁹został użyty do efektywnego wyboru wysokiej jakości cząstek w CryoSPARC¹³. Cząstki te przeszły iteracyjne rundy klasyfikacji 2D, rekonstrukcję Ab initio oraz heterogeniczne i niejednorodne dopracowywanie z nałożoną symetrią C2, co dało odwzorowanie konsensusu o średnicy 3,5 Å. Model atomowy został wygenerowany poprzez wykorzystanie struktury krystalicznej⁹ do mapy EM, następnie udoskonalenie przestrzeni rzeczywistej w Phenix^14,15 oraz ręczną korektę w Coot¹⁶, co dało ostateczną konsensusową strukturę ASNS opisaną^{przez 6}.

2. Analiza zmienności 3D (3DVA)

1. Użyj stosu cząstek i maski (nie ostatecznej mapy udoskonalonej) do ostatecznego dopracowania
   UWAGA: Często wyniki niejednolitego projektu rafinacji są wykorzystywane dla 3DVA.
2. Stwórz zadanie 3D Variability w CryoSPARC. Stos cząstek wejściowy i maska z niejednorodnego zadania dopracowywania.
3. Ustaw liczbę trybów do rozwiązania: liczbę głównych komponentów (PC) na 5.
   UWAGA: Ponieważ struktury makrocząsteczkowe występują w przestrzeni trójwymiarowej, do opisu ich głównych modów przestrzennego ruchu potrzebne są zazwyczaj co najmniej trzy PC. Aby zapewnić, że dodatkowe, potencjalnie mniejsze, ale funkcjonalnie istotne wariacje konformacyjne nie zostaną pominięte, dodano dwa dodatkowe PC.
4. Ustaw rozdzielczość filtra na 4.0 Å, a rozdzielczość górnoprzepustową na 20. Pozostałe parametry zostaw domyślne. Zacznij pracę.
   UWAGA: "Rozdzielczość filtra" na poziomie 4.0 Å została ustawiona tak, aby odpowiadała ogólnej jakości zbioru danych, unikając przy tym nadmiernego dopasowania do szumu wysokich częstotliwości. Ponieważ ostateczna mapa konsensusu została wyznaczona z rozdzielczością 3,5 Å, zastosowanie nieco niższej rozdzielczości filtra (4,0 Å) zapewniło, że analiza zmienności koncentrowała się na rzeczywistych ruchach strukturalnych, a nie na szumie blisko granicy rozdzielczości.
5. Uzyskaj zbiór objętości zmienności jako wyjście (Rysunek 2A)

3. Wyświetlanie zmienności 3D

1. Stwórz zadanie 3D Variability Display w CryoSPARC, aby zwizualizować ciągłe zmiany konformacyjne zidentyfikowane przez 3DVA.
2. Wprowadź stos cząstek oraz objętości zmienności generowane przez zadanie 3DVA.
3. Wybierz Prosty jako tryb wyjściowy (patrz niżej).
4. Ustaw rozdzielczość filtrów na 4.0 i wysokoprzepustową na 20. Pozostałe parametry zostaw na ich domyślnych wartościach. Zacznij pracę.
5. Uzyskaj 20 map zmienności jako wynik (klatka 0 do 19) odpowiadających 5 głównym składowym (PC) od 0 do 4 (Rysunek 2B)
   UWAGA: "Tryb prosty" w programie 3D Variability Display umożliwia prostą wizualizację zmian konformacyjnych wzdłuż każdego głównego komponentu. Ten tryb generuje liniowe trajektorie pomiędzy skrajnymi stanami zidentyfikowanymi przez 3DVA, umożliwiając jasną, bezpośrednią interpretację ruchów w populacji cząstek.

4. Przygotowanie danych do filmów i udoskonalanie zmiennych 3D Phenix

1. Pobierz mapy zmienności 3DVA: Pobierz pliki zip zawierające mapy zmienności dla komputerów 0-4 (łącznie pięć zipów) z CryoSPARC.
2. Organizacja katalogów: Utwórz folder nadrzędny (np. 3DVA/). W środku stwórz jeden podfolder dla każdego głównego komponentu (comp0, comp1, comp2, comp3, comp4).
3. Przenieś każdy plik zip do odpowiedniego folderu i rozpakuj jego zawartość.
4. Potwierdź, że każdy folder zawiera 20 map zmienności (klatki 0-19) i powtórz dla comp1-comp4.
   UWAGA: Utrzymuj osobne foldery dla każdego głównego komponentu, aby zapobiec mieszaniu klatek między komputerami.

5. Przygotuj szybkie filmy w UCSF Chimera (opcjonalnie) ¹⁷

1. Otwórz narzędzie Volume Series: Uruchom Chimerę, a następnie przejdź do Tools → Volume Data → Volume Series . Otworzy się nowe okno Serii Tomów .
2. Załaduj mapy: Kliknij Otwórz i wybierz 20 map odpowiadających jednemu głównemu komponentowi (np. comp0).
3. Dostosuj parametry wizualizacji: Otwórz Volume Viewer, ustaw odpowiedni próg gęstości i przypisz kolor do mapy.
   UWAGA: W tym przykładzie użyto niebieskiego nieba (Rysunek 3).
4. Podgląd ruchu: W oknie serii głośności ustaw kierunek odtwarzania na oscylację, a następnie kliknij Play, aby wyświetlić ciągłe przejście od klatki 0 → 19 → 0.
5. Powtarzaj dla dodatkowych komponentów: Powtarzaj kroki 5.2-5.4 dla innych głównych komponentów, jeśli to konieczne.
6. Wygeneruj plik filmu za pomocą wprowadzania wiersza poleceń: Wyeksportuj film, otwierając wiersz poleceń Chimera i uruchamiając Supplementary Coding File 1.
   UWAGA: Seria MRC na komponent, 20 klatek (np. compX_frame000-019.mrc) to dane wejściowe do udoskonalania zmiennych 3D w Phenix. Trzymaj foldery komponentów oddzielnie (comp0-comp4), aby uniknąć mieszania klatek między komputerami.

6. Generowanie modeli poprzez udoskonalanie zmienności w fenixie

UWAGA: Phenix.varref może być uruchamiany z dowolnego katalogu, pod warunkiem że określono pełne ścieżki do map wejściowych i modelu. Jednak dla jasności organizacyjnej zaleca się przeprowadzenie doprecyzji w osobnym podkatalogu dla każdego komputera.

1. Skopiuj ostateczny, udoskonalony plik modelu konsensusu do podkatalogu odpowiadającego każdemu PC.
2. Z każdego podkatalogu uruchom Phenix.varref z linii poleceń, używając następującej składni:
   phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.mrc resolution=4 nproc=20 models_per_map=50
3. Ustaw rozdzielczość na 4,0 Å, aby odpowiadała efektywnej rozdzielczości map 3DVA
4. Ustaw nproc na liczbę dostępnych procesorów (w tym przykładzie 20, ale może się to różnić w zależności od dostępnych zasobów obliczeniowych)
5. Ustaw models_per_map na 50 modeli (domyślnie).
   UWAGA: Dla każdej mapy generowanych jest 50 modeli z ograniczeniami dostosowanymi do rozdzielczości danych 3DVA. Najlepiej dopasowany model dla każdej mapy jest automatycznie zachowywany. Powstały plik wyjściowy zawiera 20 modeli udoskonalonych odpowiadających 20 mapom zmienności. Wyjście składa się z pakietu PDB zawierającego 20 modeli udoskonalonych oraz poszczególne pliki map.
6. Nie stosuj dodatkowego wyostrzania map podczas dopracowywania zmienności. Użyj map zmienności generowanych przez CryoSPARC (filtrowanych na 4.0 Å) bezpośrednio jako danych wejściowych do phenix.varref.

7. Wizualizacja

1. Otwórz pakiet PDB w ChimeraX¹⁸ , aby jednocześnie załadować wszystkie 20 ulepszonych modeli.
2. Użyj panelu Modele, aby selektywnie wyświetlać poszczególne klatki lub konkretne modele interesujące do porównania i analizy (Rysunek 4). Alternatywnie, każdy udoskonalony model można otworzyć indywidualnie w ChimeraX lub Chimera.

8. Przygotowanie danych do analizy

UWAGA: Uruchomienie powyższej składni generuje pakiet PDB zawierający 20 modeli zmiennych i każdą indywidualną mapę. Do większości analiz potrzebne są tylko dwa modele – odpowiadające ramce 0 i ramce 19 – ponieważ reprezentują one dwa skrajne stany konformacyjne wzdłuż wybranego głównego składnika (PC).

1. Otwórz pakiet PDB w ChimeraX, wybierz model 1.1 (klatka 0) i model 1.20 (klatka 19) i zapisz każdy model jako osobny plik PDB (Rysunek 4).
2. Edytuj powstałe pliki PDB, aby wyizolować interesujące reszty. Można to zrobić ręcznie lub za pomocą Phenix.pdb.tools.
3. Porównaj dwa zmodyfikowane pliki PDB, aby zidentyfikować zmiany konformacyjne w kręgosłupie lub łańcuchach bocznych.
4. Aby porównać oba modele PDB, nałóż zmodyfikowane struktury za pomocą funkcji MatchMaker w Chimera.
   UWAGA: Dla niezawodnego ustawienia MatchMaker zazwyczaj wymaga co najmniej 10-15 nakładających się resztek. W naszym przypadku przeanalizowano tylko 6 reszt; jednak skuteczną superpozycję osiągnięto dzięki wykorzystaniu homodimerycznego charakteru ASNS – choć w łańcuchu A pozostało tylko 6 reszt, łańcuch B pozostał nienaruszony i służył jako punkt odniesienia do wyrównania.

Results

Ta sekcja prezentuje reprezentatywne wyniki generowane przez proces 3D analizy zmienności (3DVA) i udoskonalania zmienności oraz dostarcza wskazówek dotyczących ich interpretacji. Syntezaza asparaginy ludzkiej (ASNS) jest wykorzystywana jako ilustracyjny zbiór danych do wykazania skutecznych wyników, powszechnych artefaktów oraz analiz porównawczych możliwych przez protokół. Pełny zestaw map zmienności pochodzących z 3DVA oraz odpowiadające im modele udoskonalone wygenerowane na podstawie zbiorów danych ASNS zostały zdep...

Discussion

Kluczowe kroki protokołu i punkty decyzyjne
Skuteczne wykorzystanie tego protokołu zależy od kilku kluczowych etapów w procesie. Jakość stosu cząstek i maski używanej do ostatecznego dopracowywania krio-EM jest kluczowa, ponieważ analiza zmienności 3D (3DVA) pracuje bezpośrednio na tych wejściach, a nie na mapie postprocesowej. Wybór liczby głównych komponentów (PC) powinien odzwierciedlać rozmiar zbioru danych i oczekiwaną złożoność; zbyt mała liczba składowych może niedoreprezentować zmienność, po...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC v4.4+	Structura Biotechnology	https://cryosparc.com	Oprogramowanie do przetwarzania kriogen-EM
Phenix v1.24+	Konsorcjum Phenix	https://phenix-online.org	Oprogramowanie do doprecyzowania zmienności
UCSF Chimera	Zasób do biokomputerów, wizualizacji i informatyki, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	Oprogramowanie do wizualizacji molekularnej
UCSF ChimeraX	Zasób do biokomputerów, wizualizacji i informatyki, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Oprogramowanie do wizualizacji molekularnej
CPPTRAJ	Pakiet oprogramowania AMBER do dynamiki molekularnej	https://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/	Narzędzia Pythona do obliczeń RMSF
Linux Workstation (wewnętrznie składany system oparty na GPU)
Obudowa stacji roboczej	Supermicro	https://www.supermicro.com	Obudowa stacji roboczej: Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U Server Super Chassis
CPU	Intel	https://www.intel.com	Procesor: XEON E5-2690V3 x2
Tablica macierzysta	Supermicro	https://www.supermicro.com	Płyta matczyniowa: Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 Płyta główna X10DAI-O
Pamięć	Kluczowe	https://www.crucial.com	Pamięć: Crucial 64GB Kit (16GBx4) DDR4 2133 (PC4-2133) DR x4 ECC zarejestrowany. 288-pinowa pamięć serwerowa CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
Dysk twardy	Western Digital	https://www.westerndigital.com	HDD: WD RE 4TB Enterprise Hard Disk
KONTROLER RAID	LSI Logic	https://www.broadcom.com	KONTROLER RAID: LSI LOGIC MegaRAID SAS 9271-8i Kit
GPU	NVIDIA	https://www.nvidia.com	Karta graficzna Quadro M6000 z pamięcią GDDR5 o pojemności 24 GB