Method Article

Workflow do wizualizacji dynamiki konformacji białek z map krio-EM z wykorzystaniem ludzkiej syntetazy asparaginy

DOI:

10.3791/70312

⸱

March 20th, 2026

1Department of Biochemistry, Molecular Biology and Pharmacology, Indiana University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten określa, jak przeprowadzić analizę zmienności 3D (3DVA) w CryoSPARC oraz udoskonalanie zmienności w Phenix, aby analizować heterogeniczność konformacji danych krio-EM. Na przykładzie ludzkiej syntetazy asparaginy opisuje on, jak generować mapy zmienności, wizualizować główne składniki oraz udoskonalać odpowiadające mu modele atomowe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł przedstawia kompleksowy sposób analizy heterogeniczności konformacyjnej w danych z mikroskopii krioelektronowej pojedyncząstkowej (cryo-EM) z wykorzystaniem analizy zmienności 3D (3DVA) w CryoSPARC oraz udoskonalania zmienności w Phenix. Protokół opisuje, jak obliczać mapy zmienności wzdłuż głównych składników pochodzących z obrazów cząstek, wizualizować główne tryby zmienności strukturalnej oraz doprecyzować odpowiadające zespoły modeli atomowych względem poszczególnych układów zmienności. Efektem wyjścia są seria map zmienności 3D, udoskonalone struktury atomowe wielomodelowe reprezentujące dyskretne stany konformacyjne oraz pliki wizualizacyjne odpowiednie do porównawczej analizy strukturalnej i generowania filmów. Ten sposób pracy jest szeroko stosowany w rekonstrukcjach kriogenicznych w zakresie rozdzielczości (zazwyczaj ~2,0-6,0 Å), gdzie heterogeniczność konformacyjną może być istotnie interpretowana na poziomie kręgosłupa i łańcucha bocznego. Jest szczególnie odpowiednia do rejestrowania ciągłych ruchów domenowych, ruchów zawiasów oraz skoordynowanych lokalnych przearanżowań, które nie są łatwe do rozstrzygnięcia przez samą klasyfikację dyskretną. Połączone wykorzystanie map zmienności i udoskonalonych zespołów modeli umożliwia bezpośrednie porównanie strukturalne skrajności konformacji, wspiera analizy ilościowe, takie jak obliczania fluktuacji korzeni-średni-kwadrat (RMSF), oraz dostarcza ram do łączenia dynamicznych cech strukturalnych z hipotezami biochemicznymi lub funkcjonalnymi. Ludzka syntetaza asparaginowa (ASNS) jest wykorzystywana jako przykład do demonstracji praktycznego wdrożenia tego przepływu pracy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakteryzacja heterogeniczności konformacyjnej w strukturach makrocząsteczkowych jest coraz ważniejszym aspektem analizy krio-elektronowej mikroskopii pojedynczej cząstki (cryo-EM). Celem tego protokołu jest zapewnienie praktycznego workflow do wydobywania się, wizualizacji i udoskonalania dominujących trybów zmienności strukturalnej bezpośrednio z zestawów danych krio-EM, wykorzystując analizę zmienności trójwymiarowej (3DVA) w CryoSPARC1 połączoną z udoskonalaniem zmienności w Phenix2. Niniejszy artykuł ma na celu pomóc czytelnikom w ocenie, czy takie podejście obliczeniowe jest odpowiednie dla ich danych oraz w zroz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie danych

  1. Generowanie konsensusowej mapy EM
    1. Do określenia konsensualnej trójwymiarowej struktury makrocząsteczkowego kompleksu makrocząsteczkowego wykorzystaj mikroskopię krio-elektronową (cryo-EM) z pojedyncząstką.
    2. Próbki witryfikuj na krio-siatkach i obrazuj za pomocą mikroskopu elektronowego transmisyjnego wysokiego napięcia wyposażonego w bezpośredni detektor elektronów.
    3. Przetworz zebrane filmy w celu skorygowania ruchu wywołanego wiązką, oszacowania parametrów obrazowania i wyboru obrazów cząstek.
    4. Wykonaj iteracyjną klasyfikację i dopracowywanie cząstek, aby wygenerować konsensu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta sekcja prezentuje reprezentatywne wyniki generowane przez proces 3D analizy zmienności (3DVA) i udoskonalania zmienności oraz dostarcza wskazówek dotyczących ich interpretacji. Syntezaza asparaginy ludzkiej (ASNS) jest wykorzystywana jako ilustracyjny zbiór danych do wykazania skutecznych wyników, powszechnych artefaktów oraz analiz porównawczych możliwych przez protokół. Pełny zestaw map zmienności pochodzących z 3DVA oraz odpowiadające im modele udoskonalone wygenerowane na podstawie zbiorów danych ASNS zostały zdep.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe kroki protokołu i punkty decyzyjne
Skuteczne wykorzystanie tego protokołu zależy od kilku kluczowych etapów w procesie. Jakość stosu cząstek i maski używanej do ostatecznego dopracowywania krio-EM jest kluczowa, ponieważ analiza zmienności 3D (3DVA) pracuje bezpośrednio na tych wejściach, a nie na mapie postprocesowej. Wybór liczby głównych komponentów (PC) powinien odzwierciedlać rozmiar zbioru danych i oczekiwaną złożoność; zbyt mała liczba składowych może niedoreprezentować zmienność, po.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma konfliktu interesów do zgłoszenia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękuję członkom laboratoriów Takagi, Zhu, Vos, Chaptal, Alcaro i Richards za ich wkład w publikację, na której opiera się ten artykuł. Autor z wdzięcznością dziękuje Laboratorium Mikroskopii Elektronowej Uniwersytetu Medycznego Indiany oraz NIH/NIGMS (S10 OD028723) za wsparcie tych prac. Dodatkowe finansowanie zapewniły Indiana University School of Medicine (Y.T.), częściowo NIGMS (R01GM111695 do Y.T.) oraz American Cancer Society (DBG-23-1038947-01-IBCD do Y.T.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARC v4.4+Structura Biotechnologyhttps://cryosparc.comOprogramowanie do przetwarzania kriogen-EM
Phenix v1.24+Konsorcjum Phenixhttps://phenix-online.orgOprogramowanie do doprecyzowania zmienności
UCSF ChimeraZasób do biokomputerów, wizualizacji i informatyki, UCSFhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/Oprogramowanie do wizualizacji molekularnej
UCSF ChimeraXZasób do biokomputerów, wizualizacji i informatyki, UCSFhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Oprogramowanie do wizualizacji molekularnej
CPPTRAJPakiet oprogramowania AMBER do dynamiki molekularnejhttps://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/Narzędzia Pythona do obliczeń RMSF
Linux Workstation (wewnętrznie składany system oparty na GPU)
Obudowa stacji roboczejSupermicrohttps://www.supermicro.comObudowa stacji roboczej: Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U Server Super Chassis 
CPUIntel https://www.intel.comProcesor: XEON E5-2690V3 x2
Tablica macierzystaSupermicrohttps://www.supermicro.comPłyta matczyniowa: Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 Płyta główna X10DAI-O
PamięćKluczowehttps://www.crucial.comPamięć: Crucial 64GB Kit (16GBx4) DDR4 2133 (PC4-2133) DR x4 ECC zarejestrowany. 288-pinowa pamięć serwerowa CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
Dysk twardyWestern Digitalhttps://www.westerndigital.comHDD: WD RE 4TB Enterprise Hard Disk
KONTROLER RAIDLSI Logichttps://www.broadcom.comKONTROLER RAID: LSI LOGIC MegaRAID SAS 9271-8i Kit
GPUNVIDIA https://www.nvidia.comKarta graficzna Quadro M6000 z pamięcią GDDR5 o pojemności 24 GB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702(2021).
  2. Afonine, P. V., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Conformational DynamicsCryo EM Maps3D Variability AnalysisCryoSPARC WorkflowVariability RefinementPhenix SoftwareConformational HeterogeneityAtomic Model EnsemblesStructural ComparisonHuman Asparagine Synthetase
Video Coming Soon

Related Articles