Charakteryzacja ataksji wywołanej guzem w modelu myszy z przedsionkowym schwannomą

Podsumowanie

Opracowaliśmy panel testów behawioralnych do badania ataksji wywołanej przez guz oraz oceny terapii zachowujących funkcje neurologiczne w mysiim modelu schwannoma przedsionkowego.

Streszczenie

Zwana z NF2 związana schwannomatoza (NF2-SWN) to autosomalnie dominujący zespół predyspozycji nowotworowej spowodowany mutacjami linii zarodkowej w genie supresorowym nowotworów NF2. Choroba charakteryzuje się rozwojem obustronnych schwannomów przedsionkowych (VS), które stopniowo się powiększają i prowadzą do utraty słuchu, zaburzeń równowagi oraz objawów ataksji, które głęboko wpływają na jakość życia pacjentów. Obecnie nie są dostępne zatwierdzone przez FDA terapie farmakologiczne. Wśród deficytów neurologicznych ataksja pozostaje szczególnie wyniszczającą, lecz niedostatecznie zbadaną formą, głównie z powodu braku solidnych modeli przedklinicznych do jej oceny. W tym badaniu opracowaliśmy zestaw testów behawioralnych do systematycznej oceny ataksji wywołanej przez guz w ortotopowym modelu mysim dotyczącym utraty słuchu i ataksji związanej z VS. Testy te pozwalają ilościowo mierzyć deficyty równowagi i koordynacji ruchowej wynikające z obciążenia guza. Ta platforma eksperymentalna umożliwia mechanistyczne badania dysfunkcji móżdżku wywołanej guzem i stanowi cenne narzędzie do przedklinicznej oceny strategii terapeutycznych. Poprzez integrację ocen behawioralnych z biologią nowotworów i testami słuchu, podejście to ułatwia charakteryzację zarówno efektów leczenia supresyjnego nowotworów, jak i neuroprotekcyjnych. Ostatecznie te testy oferują wszechstronne ramy, które można również zastosować do innych schorzeń neurologicznych charakteryzujących się ataksją, rozszerzając ich zastosowanie poza NF2-SWN.

Wprowadzenie

Zwana NF2-powiązana schwannomatoza (NF2-SWN) to rzadki, dominująco dziedziczony zespół predyspozycji nowotworowej spowodowany mutacjami w genie supresorowym NF2, który koduje białko cytoszkieletowe^{merlin 1}. Utrata funkcji merlina zakłóca szlaki sygnalizacyjne regulujące proliferację, adhezję i przeżywalność komórek, predysponując osoby dotknięte do rozwoju wielu łagodnych guzów układu nerwowego. Charakterystyczną cechą NF2-SWN jest powstawanie obustronnych schwannomów przedsionkowych (VS) – niezłośliwych guzów pochodzących z komórek Schwanna, które powstają wzdłuż nerwów przedsionkowych. Guzy te stopniowo się powiększają, uciskając sąsiednie struktury nerwowe i prowadząc do utraty słuchu czuciowo-nerwowego, szumów usznych oraz dysfunkcji nerwu twarzowego².

Pacjenci z obustronnymi VS często doświadczają postępującego uszkodzenia nerwu przedsionkowego i aparatu przedsionkowego ucha wewnętrznego, co skutkuje wyniszczającą dysfunkcją przedsionkową objawioną przewlekłą nierównowagą, ataksją i niestabilnością chodu, co poważnie osłabia mobilność i jakość życia³. Stopień dysfunkcji przedsionkowej często koreluje z obciążeniem guza i zaangażowaniem nerwów. Objawy te często utrzymują się nawet po próbach kontroli guza lub zachowania słuchu, co sugeruje złożone mechanizmy neurobiologiczne wykraczające poza mechaniczną kompresję ^4,5. Chociaż narzędzia kliniczne, takie jak inwentaryzacja niepełnosprawności zawrotów głowy, analiza chodu, testy odruchu przedsionkowego (VOR) oraz posturografia, są wykorzystywane do ilościowego określenia upośledzenia przedsionkowego, mechanizmy ataksji wywołanej przez guz pozostają słabo poznane.³. Pomimo postępu w rozumieniu molekularnym i wprowadzenia terapii celowanych, takich jak bewakizumab, nadal nie istnieje terapia zatwierdzona przez FDA, która niezawodnie zachowuje zarówno słuch, jak i równowagę u pacjentów z NF2-SWN. Leczenie objawów przedsionkowych pozostaje w dużej mierze wspierające, co podkreśla poważną, niezaspokojoną potrzebę kliniczną.

Główną przeszkodą w poprawie klinicznego leczenia ataksji związanej z VS jest brak modeli przedklinicznych, które wiernie odtwarzałyby deficyty koordynacji przedsionkowej i ruchowej obserwowane u pacjentów. Większość istniejących modeli zwierzęcych VS koncentruje się na rozwoju guzów lub utracie słuchu, nie powtarzając charakterystycznych zaburzeń równowagi i koordynacji. Ponadto standaryzowane testy behawioralne służące obiektywnej ocenie ataksji i dysfunkcji przedsionkowej w warunkach przedklinicznych nie są dobrze udokumentowane. Ta luka utrudnia badania mechanistyczne i ogranicza ocenę terapii kandydatów mających na celu zachowanie funkcji przedsionkowych.

Tutaj przedstawiamy opracowanie modelu VS na myszy, który wykazuje mierzalne fenotypy ataksji, wraz z panelem testów behawioralnych specjalnie zaprojektowanych do ilościowego określenia ataksji wywołanej przez guz. Model ten stanowi bardzo potrzebną platformę do badania mechanizmów leżących u podstaw dysfunkcji przedsionkowej związanej z VS oraz do oceny skuteczności interwencji terapeutycznych mających na celu przywrócenie równowagi, koordynacji i ogólnej funkcji neurologicznej u pacjentów z NF2-SWN.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach prowadzono zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnego Massachusetts General Brigham (MGB).

1. Model zwierzęcy

1. Inokulować komórki Nf2^-/- (mysie komórki Nf2^-/- Schwanna wyrażające gen reportera lucyferazy Gaussia, Gluc) w immunokompetentne myszy C57/FVB. Za pomocą stereotaktycznego urządzenia do zastrzyków (Rysunek 1A) wstrzyknij każdej myszy 1 μL z 2 500 komórek nowotworowych do obszaru CPA prawej półkuli ^4,6.
2. Wykorzystaj zarówno samce, jak i samice myszy (stosunek 1:1) w wieku 8-12 tygodni, aby zapewnić wystarczającą moc statystyczną i zbadać ewentualne różnice związane ze względu na płeć. Myszy domowe w grupach po 4 osoby w klatce w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności, z dostępem jedzenia i wody ad libitum.
   UWAGA: Ponieważ schwannomy rozwijają się w nerwach przedsionkowych pacjentów, zastosowaliśmy model kąta móżdżku (CPA). Model CPA odtwarza mikrośrodowisko wewnątrzczaszkowe VS.
3. Grupa pozorowa: Aby ocenić wpływ operacji chirurgicznych na zwierzętach i implantacji komórek nowotworowych na ataksję, należy do grupy poddawanej operacji fikcyjnej, w której myszy przeszły fikcyjną operację i wstrzyknięcie soli fizjologicznej do obszaru CPA.
4. Uwzględnić grupę myszy nieposiadających guzów jako kontrolę.
5. Aby monitorować postęp guza, używaj komórek Nf2^-/- wyrażających gen reportera lucyferazy Gaussia (Gluc) i mierz GLUL w osocze co 3 dni po implantacji.
6. Krótko pobierz 13 μL krwi do rurek EDTA, aby zapobiec krzepaniu. Przenieś próbkę krwi do płytki z 96 dołkami i zmierzyć aktywność glukozy zgodnie z opisaniem^wcześniej 6,7,8,9.

2. Testy na ataksję

1. Wykonaj cztery testy behawioralne w ustalonej kolejności, aby zminimalizować zmienność między zwierzętami. Przeprowadz testy w następującej kolejności: (1) test chwytania kończyn tylnych, (2) test krawędzi, (3) ocena chodu oraz (4) ocena kifozy. Pozwól na minimalny odpoczynek 2-5 minut między testami, wracając mysz do jej domowej klatki. Obserwuj zwierzę podczas przerw i przechodź do kolejnego testu dopiero wtedy, gdy normalne zachowanie eksploracyjne powróci. Przestań testować, jeśli zauważą się oznaki nadmiernego stresu lub zmęczenia. Wykonaj pełny zestaw czterech testów ataksji dla kohorty 10 myszy w ciągu około 45-60 minut, wliczając przerwy między testami.
2. Test chwytania kończyny tylnej
   UWAGA: Test chwytania kończyny tylnej ocenia koordynację nerwowo-mięśniową, napięcie ruchowe oraz kontrolę postawy u myszy. Myszy z ataksją wykazują cofnięcie się kończyn tylnych lub zaciskanie się w kierunku brzucha, co odzwierciedla zaburzenia koordynacji ruchowej i regulacji napięcia mięśniowego⁵.
   1. Chwyć mysz delikatnie u nasady ogona, zapewniając bezpieczny, ale lekki chwyt, by uniknąć dyskomfortu. Przed podniesieniem podtrzymaj zwierzę krótko na wieku lub ręce klatki, aby zmniejszyć reakcję na przestraszenie.
   2. Podnieś mysz powoli, tak aby zawisła w powietrzu, z całkowicie wyprostowanym ciałem i wolnym od przeszkód. Trzymaj mysz co najmniej 10 cm nad klatką lub powierzchnią testową.
   3. Utrzymuj pozycję zawieszoną przez około 10 sekund i obserwuj pozycję tylnych kończyn i ogona, nie obracając ani nie machając zwierzęciem.
   4. Oceń postawę kończyn tylnych, jak opisano poniżej.
      1. Rozpoznaj prawidłową postawę, gdy obie kończyny tylne wysuwają się na zewnątrz i oddalają od brzucha.
      2. Zidentyfikować nieprawidłową postawę, gdy jedna lub obie kończyny cofają się w kierunku brzucha lub krzyżują się nawzajem, co wskazuje na zaciskanie kończyn tylnych związane z ataksją lub zaburzeniem neurologicznym.
   5. Nagraj zachowanie za pomocą zdefiniowanego systemu punktacji lub nagraj krótki film do analizy post-hoc w oślepieniu.
      UWAGA: Ogranicz każdy test do ≤10 s, aby zminimalizować stres.
3. Test krawędzi
   UWAGA: Test na krawędzi ocenia równowagę, koordynację i kontrolę motoryczną u myszy. Mierzy zdolność zwierzęcia do chodzenia po wąskiej półce i bezpiecznego zejścia do klatki domowej bez utraty równowagi. Myszy z dysfunkcją móżdżku lub ataksją przedsionkową zazwyczaj wykazują poślizgnięcia, upadki lub niestabilną postawę podczas tego zadania⁵.
   1. Umieść klatkę na stabilnej, płaskiej powierzchni na wysokości ławki (~1 m).
   2. Połącz jeden koniec klatki testowej (Rysunek 1C) z obudową (Rysunek 1D), zapewniając, że nie ma pionowej szczeliny ani przeszkód między klatkami, co pozwoli myszy płynnie i naturalnie zejść do klatki domowej (Rysunek 1B) bez skakania czy upadania.
   3. Umieść kamerę wideo na statywie skierowanym w stronę krawędzi pod kątem 30°-45°, aby uchwycić zarówno ruch boczny, jak i opadanie.
   4. Dostosuj oświetlenie, aby zminimalizować odblaski i zapewnić wyraźną widoczność kończyn i ogona myszy.
   5. Delikatnie podnieś mysz za nasadę ogona i podtrzymaj jej ciało drugą ręką. Umieść mysz na środku krawędzi tak, aby wszystkie cztery łapy były na powierzchni. Ogon puszczaj tylko wtedy, gdy mysz wydaje się zrównoważona i czujna.
   6. Pozwól myszy swobodnie chodzić po krawędzi bez zewnętrznych podpowiedzi. Nagrywaj mysz przez co najmniej 10 sekund lub aż zejdzie do klatki.
   7. Obserwuj jego zdolność do utrzymania równowagi na krawędzi bez poślizgnięcia i chodzenia wzdłuż krawędzi w kierunku klatki lub platformy.
   8. Wykonaj trzy niezależne próby na każdą mysz, z przerwą między próbami wynoszącą ~2 minuty. Czyść powierzchnię półki między zwierzętami używając 70% etanolu, aby usunąć sygnały zapachowe.
   9. Wszystkie testy przeprowadzaj w cichym środowisku, z stałym oświetleniem i minimalnym hałasem tła oraz drganiami. Unikaj nadmiernego powtarzania testu tego samego dnia, ponieważ zmęczenie i efekty nauki mogą wpływać na wyniki.
4. Ocena chodu
   UWAGA: Test oceny chodu ocenia koordynację ruchową, wzorzec kroku oraz stabilność postawy u myszy poruszających się swobodnie. Myszy z ataksją często wykazują skrócony krok kroku, niestabilne ruchy i nieregularne ułożenie łap, co wskazuje na zaburzenia koordynacji i kontroli równowagi⁵.
   1. Wyłóż prosty, płaski pas startowy białym papierem do kopiowania (8,5 × 11 cali). Umieść klatkę domową na końcu papieru, aby zachęcić mysz do chodzenia po papierze.
   2. Delikatnie pokryj przednie i tylne łapy dwoma kontrastującymi kolorami (np. niebieski dla przednich, czerwony dla tylnych łap) za pomocą nietoksycznego tuszu (rysunek 1E).
   3. Umieść mysz na początku pasa i pozwól jej swobodnie chodzić po kartce bez zewnętrznego szturchania.
   4. Obserwuj i mierz następujące parametry:
      Długość kroku: odległość między kolejnymi ułożeniami tej samej łapy.
      Szerokość bazy: boczna odległość między lewym a prawym tylnym śladem.
   5. Wykonuj dwa do trzech przejazdów na każdą mysz, pozwalając na przerwę między testami.
      UWAGA: Używaj nietoksycznego, szybko schnącego tuszu i upewnij się, że pokrywa się tylko poduszki łap. Po każdej próbie wymieniaj papier, aby uniknąć rozmazania. Nakładaj tusz oszczędnie, aby uniknąć rozmycia śladów, ponieważ nadmiar atramentu obniża dokładność pomiarów kroku.
5. Ocena kifozy
   UWAGA: Ocena kifozy ocenia ustawienie kręgosłupa oraz nieprawidłowości postawy podczas naturalnego poruszania się. Myszy z zaburzeniami neurologicznymi lub mięśniowymi często wykazują utrzymujące się skrzywienie grzbietu lub garbienie kręgosłupa^.
   1. Połóż mysz na powierzchni i pozwól jej swobodnie chodzić lub eksplorować przez kilka sekund. Unikaj przestraszenia zwierzęcia, ponieważ nagłe ruchy mogą tymczasowo zmienić postawę.
   2. Nagraj krótki film z widoku bocznego, aby udokumentować krzywiznę pnia.
   3. Obserwuj postawę myszy podczas chodzenia, koncentrując się na ustawieniu kręgosłupa i krzywiźnie tułowia, jak opisano poniżej.
      1. Rozpoznaj prawidłową postawę, gdy mysz utrzymuje prosty lub lekko wygięty grzbiet z płynnym ruchem ciała.
      2. Rozpoznaj nieprawidłową postawę, gdy mysz wykazuje kifozę, charakteryzującą się nieprawidłowo zgarbionym lub zakrzywionym kręgosłupem, sztywnym trąbem oraz zmniejszoną elastycznością podczas chodu.

3. Analiza testu ataksji

UWAGA: Wykonuj wszelkie oceny behawioralne przez obserwatora ślepego na przypisanie grupy eksperymentalnej, aby zminimalizować stronniczość obserwatora.

1. Punktacja testów krawędzi
   1. Przypisz wynik 3, jeśli mysz płynnie chodzi po krawędzi, utrzymuje równowagę i schodzi do klatki bez poślizgnięcia.
   2. Przypisz ocenę 2, jeśli mysz wykazuje lekkie upośledzenie, takie jak wahanie lub drobne poślizgnięcie łapy, ale wyzdrowieje i bezpiecznie zejdzie.
   3. Przypisz wynik 1, jeśli mysz wykazuje umiarkowane upośledzenie, w tym częste poślizgnięcia, przysiadającą postawę, nadmierne używanie ogona dla utrzymania równowagi lub opóźniony opad.
   4. Przypisz wynik 0, jeśli mysz wykazuje poważne upośledzenia, nie potrafi utrzymać równowagi, spadnie z krawędzi lub odmówi ruchu.
2. Testowe wynik chwytania kończyn tylnych
   1. Przypisz wynik 3, jeśli mysz konsekwentnie pokazuje rozstawione tylne kończyny bez oznak zaciskania się.
   2. Przypisz wynik 2, jeśli mysz wykazuje łagodne upośledzenie, na przykład przerywane cofanie jednej kończyny tylnej.
   3. Przypisz wynik 1, jeśli mysz wykazuje umiarkowane upośledzenie, charakteryzujące się częściowym cofnięciem obu kończyn tylnych utrzymywanych blisko odwłoka.
   4. Przypisz wynik 0, jeśli mysz wykazuje poważne upośledzenie, a obie kończyny tylne są mocno przyciśnięte do odwłoka przez większość okresu obserwacji.
3. Punktacja chodu
   1. Przypisz wynik 3, jeśli mysz chodzi równym, skoordynowanym chodem i porusza się prosto.
   2. Przypisz wynik 2, jeśli mysz wykazuje łagodne upośledzenia, na przykład chodzi powoli z lekkim niestabilnością lub bocznym odchyleniem, kulejąc na bok lub poruszając się szerokimi, okrążającymi ścieżkami.
   3. Przypisz ocenę 1, jeśli mysz wykazuje umiarkowane upośledzenie, w tym wyraźne zaburzenia chodu, chodzenie używając tylko dwóch lub trzech łap, przeciąganie części ciała lub krążenie w ciasnych kółkach.
   4. Przypisz wynik 0, jeśli mysz wykazuje poważne upośledzenie, nie jest w stanie poruszać się, pozostaje nieruchoma lub wykazuje niekontrolowane przetaczanie się na bok.
4. Punktacja kifozy
   1. Przypisz wynik 3, jeśli mysz pozostaje płasko i prosto do tyłu zarówno podczas odpoczynku, jak i chodzenia.
   2. Przypisz wynik 2, jeśli mysz wykazuje lekkie upośledzenie, z lekkim wygięciem grzbietu w spoczynku, które prostuje się podczas ruchu.
   3. Przypisz wynik 1, jeśli mysz wykazuje umiarkowane upośledzenie, z umiarkowanie zgarbionymi plecami w spoczynku, które pozostają wygięte podczas chodzenia.
   4. Przypisz wynik 0, jeśli mysz wykazuje poważne upośledzenie, z silnym garbieniem pleców przez cały okres obserwacji, co ogranicza normalny ruch.

4. Ocena wiarygodności między oceniającymi

1. Szkol obserwatorów na przykładowych filmach przed formalnym oceną w celu ujednolicenia interpretacji kryteriów punktacji.
2. Aby zminimalizować błędy obserwatora, oceniaj wszystkie testy behawioralne niezależnie przez dwóch wyszkolonych obserwatorów nieświadomych grupy leczenia i punktu czasu eksperymentu.
3. Ilościowo określ wiarygodność między oceniającymi dla każdego testu behawioralnego, używając współczynnika kappa Cohena. Interpretuj wartości kappa następująco: <0,40, słaba zgoda; 0,40-0,60, umiarkowana zgoda; 0,60-0,80, istotna zgoda; oraz >0,80, prawie idealna zgoda.
4. Rozwiązuj wszelkie niezgodności w ocenie poprzez wspólną analizę nagranych nagrań i osiągnij konsensus⁵.

Wyniki

Wzrost guza CPA powoduje ataksję w modelu myszy VS

Aby ocenić ataksję wywołaną przez guz, ustanowiliśmy dwie eksperymentalne kohorty. Po pierwsze, aby ocenić wpływ operacji na zwierzętach i implantacji komórek nowotworowych na ataksję, myszy poddały się fikcyjnej operacji i wstrzyknięciu soli fizjologicznej do obszaru CPA. Objawy ataksji u myszy z grupy fikcyjnej porównano z tymi u nieoperowanych myszy kontrolnych. W drugiej kohorcie do regionu CPA wstrzykiwano guzy Nf2

Dyskusja

Opisane tutaj testy behawioralne stanowią solidne i ilościowe ramy do oceny ataksji i deficytów koordynacji ruchowej w mysich modelach VS i pokrewnych zaburzeń przedsionkowych. Testy te są zaadaptowane z ustalonych protokołów dla modeli chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Huntingtona i ataksje rdzeniowo-móżdżkowe¹⁰, i są dobrze przystosowane do charakteryzowania dysfunkcji przedsionkowej wywołanej przez guz w NF2-SWN. Łącząc wiele odczytów beha...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Serum bydła płodu	ThermoFisher	A5670701
GloMax 96 Microplate Luminometr	Promega	GM3000
Podkładka proceduralna McKesson Blue	McKesson	75402
Suplement wzrostu komórek Schwanna	ScienCell	1752