Artykuł metodologiczny

Pobieranie próbek DNA środowiskowych z jednostek obserwatorskich wielorybów w celu monitorowania waleni

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70334

⸱

10 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje ustandaryzowany sposób zbierania próbek DNA środowiskowego waleni (eDNA) z jednostek obserwatorów wielorybów. Priorytetem jest wykonalność dla badaczy i wykwalifikowanych naukowców-obywateli, natomiast warunki środowiskowe, czas filtracji, mętność oraz logistyka pokładowa wyznaczają praktyczne ograniczenia zastosowania.

Streszczenie

DNA środowiskowe (eDNA) oferuje nieinwazyjne podejście do monitorowania waleni, jednak jego szerokie zastosowanie na platformach operacyjnych wymaga ustandaryzowanych i wykonalnych procesów pobierania próbek. Niniejsze badanie opisuje protokół zbierania eDNA waleni z jednostek obserwatorów wielorybów, zaprojektowany do realizacji przez badaczy i wykwalifikowanych naukowców obywatelskich w określonych warunkach środowiskowych i logistycznych. Podejście to integruje zbieranie wody morskiej ukierunkowane na flukeprint, filtrację pokładową z filtrami samozachowawczymi oraz analizy molekularne w dalszej fazie leczenia, aby wspierać operacyjnie wykonalne generowanie danych w warunkach rzeczywistych. Protokół został wdrożony podczas skoordynowanych kampanii terenowych przeprowadzonych w 2024 roku w trzech regionach północnego Atlantyku i Morza Śródziemnego (Islandia, Portugalia i Włochy), obejmujących wiele taksonów waleni. Wydajność metody oceniono za pomocą nowo opracowanego, specyficznego dla gatunku ilościowego testu PCR skierowanego do mitochondrialnego DNA humbaka (Megaptera novaeangliae), wykazując stałe wskaźniki wykrywania w zmiennych warunkach środowiskowych i logistycznych. Dzięki praktycznym wskazówkom dotyczącym wdrożenia terenowego i kontroli skażenia, protokół ten wspiera powtarzalny monitoring waleni oparty na eDNA oraz ułatwia ponadregionalną porównywalność w badaniach bioróżnorodności morza.

Wprowadzenie

Skuteczne zarządzanie ochroną morskich megafaun, w tym waleni i innych gatunków o dużym zasięgu, jest niezbędne dla ochrony bioróżnorodności. Jako czołowi drapieżnicy i inżynierowie ekosystemów, walenie przyczyniają się do regulacji troficznej, obiegu składników odżywczych oraz ekologicznej odporności w basenach oceanicznych1. Jednak generowanie kompleksowej wiedzy ekologicznej dla tych wysoce mobilnych gatunków pozostaje wyzwaniem i często opiera się na programach monitoringu zajmujących się dużą ilością zasobów2. Tradycyjne podejścia, takie jak pobieranie próbek biopsji, identyfikacja fotograficzna, pasywny monitoring akustyczny (pasywny monitoring akustyczny ) oraz badania lotnicze, dostarczyły kluczowych informacji o ekologii waleni 3,4,5,6,7, jednak metody te często są kosztowne, logistycznie wymagające, ograniczone przestrzennie lub inwazyjne i podlegają ścisłemu nadzorowi etycznemu i regulacyjnemu8. W rezultacie częstotliwość próbkowania, zasięg geograficzny oraz możliwości udziału interesariuszy są często ograniczone, zwłaszcza w badaniu gatunków o dużym zasięgu lub rzadkości.

Pobieranie DNA środowiskowego (eDNA, definiowane jako materiał genetyczny wyrzucany przez organizmy do ich środowiska) stało się potężnym, nieinwazyjnym narzędziem do wykrywania gatunków wodnych na podstawie próbek wody 9,10. Specyficzne dla gatunku ilościowe testy PCR (qPCR) skierowane na fragmenty mitochondrialnego DNA umożliwiają bardzo czułe i specyficzne wykrywanie morskich taksonów, w tym waleni 11,12,14. Poza wykrywaniem obecności/nieobecności, względna siła sygnału eDNA oraz docelowe sekwencje DNA dostarczają cennych informacji dotyczących bliskości, względnej liczebności oraz wzorców genetycznych na poziomie populacji 15,16,17,18,19. Dodatkowo, próbki środowiskowe zbierane w pobliżu wielorybów często zawierają DNA z równowystępujących taksonów, w tym gatunków ofiar, symbiontów i pasożytów, co wspiera szersze powiązania ekologiczne 20,21,22. Łącznie te postępy pokazują potencjał podejść opartych na eDNA do uzupełnienia tradycyjnych metod i rozszerzenia zakresu badań nad waleni w systemach morskich23,24.

Pomimo tych zalet, monitoring megafauny morskiej opartej na eDNA napotyka się na uporczywe wyzwania związane z reprezentatywnym pobieraniem próbek, pokryciem przestrzennym oraz metodologiczną powtarzalnością, szczególnie w systemach otwartych morskich, gdzie DNA jest szybko rozcieńczone25,26, a gatunki docelowe mają szeroki zasięg i występują przy niskich gęstościach. Rozwiązanie tych ograniczeń wymaga skalowalnych, operacyjnie wykonalnych ram próbkowania, które można stosować na szerokich skalach przestrzennych i czasowych. Inicjatywy nauki obywatelskiej okazały się skuteczne w rozszerzaniu zbierania danych ekologicznych oraz promowaniu zaangażowania społeczeństwa w ochronę mórz, co czyni je obiecującą drogą do szeroko zakrojonego monitoringu opartego na eDNA 27,28,29,30. Statki obserwacyjne wielorybów stanowią niedostatecznie wykorzystywaną, lecz bardzo odpowiednią platformę do pobierania próbek eDNA, oferując regularny dostęp do siedlisk waleni w różnych sezonach i regionach31, 32, 33. Globalny przemysł obserwacji wielorybów wspiera rozległe sieci operacyjne34, a wcześniejsze badania wykazały wykonalność zbierania eDNA waleni z innych oportunistycznych platform, takich jak statki handlowe, promy35, oraz poprzez ukierunkowane próbkowanie zintegrowane ze zdjęciową identyfikacją i obserwacjami behawioralnymi36,37. Szybki rozwój badań nad eDNA doprowadził do znacznych innowacji metodologicznych, jednak zmienność biologiczna w systemach morskich oraz tempo postępu technologicznego komplikują wysiłki na rzecz harmonizacji protokołów i zapewnienia porównywalności między badaniami. Standaryzowane, lecz elastyczne metody terenowe są zatem niezbędne, szczególnie dla szeroko zakrojonych międzynarodowych inicjatyw monitoringu38.

Wykrywanie eDNA zależy od objętości filtrowanej wody, strategii filtracji, materiału filtrującego oraz wielkości porów. Filtrowanie większych objętości zazwyczaj zwiększa wydajność eDNA i prawdopodobieństwo wykrycia dla celów kręgowców, w tym waleni 39,40,41,42. W wodach produktywnych lub mętnych wydajność filtracji może być jednak ograniczona przez szybkie zatoranie filtrów43,44, co wymaga kompromisu między osiągalną objętością a wykonalnością operacyjną45,46. Pobieranie próbek z odcisków fłów — zakłóceń powierzchniowych wywołanych ruchem ogona wieloryba — konsekwentnie wykazuje poprawę wykrywalności eDNA waleni, ponieważ niedawno zrzucony materiał biologiczny koncentruje się blisko powierzchni 24,41,42,47,48. Zastosowanie zamkniętych, samozachowawczych systemów filtrów zmniejsza liczbę kroków obsługi i ryzyko zanieczyszczenia, czyniąc je doskonale przystosowanymi do zastosowań nauki obywatelskiej38,42. Dodatkowo, zastosowanie biologicznych replik i rutynowych kontrol terenowych minimalizuje awarie wykrywania i zwiększa niezawodność danych 49,50,51.

Rozwój i walidacja protokołu
Projekt eWHALE52 to transnarodowa inicjatywa integrująca badaczy, operatorów obserwacji wielorybów oraz naukowców obywatelskich z całej Europy, aby monitorować morską megafaunę za pomocą eDNA. Próbki były skierowane do wielu taksonów waleni na północnym Atlantyku i Morzu Śródziemnym, wykorzystując podstawowy protokół z dostosowaniami specyficznymi dla regionu, uwzględniającymi lokalne warunki środowiskowe i logistyczne.

Przedstawiamy tutaj ustandaryzowany, od początku do końca protokół zbierania eDNA waleni z jednostek obserwatorów wielorybów, udoskonalony analizą 308 próbek eDNA z wody morznej, w tym dwóch replik na próbkę i 21 kontrolnych w terenie, zebranych podczas skoordynowanych kampanii terenowych w 2024 roku w Zatoce Skjálfandi (Islandia), Azorach (Portugalia) oraz Morzu Liguryjskim (Włochy). Metoda integruje zbieranie wody morskiej ukierunkowane na odciski fłetów, filtrację na pokładzie za pomocą samozachowawczych filtrów eDNA oraz analizy molekularne w dalszej fazie rzeki.

Protokół ten został zaprojektowany do wdrożenia w rzeczywistych warunkach obserwacji wielorybów przez wykwalifikowanych badaczy i naukowców-obywateli, gdzie filtracja na pokładzie może być przeprowadzona w spokojnych i umiarkowanych warunkach morskich, nie zakłócając obserwacji wielorybów. Wdrożenie wymaga koordynacji z organizacjami uczestniczącymi (np. operatorami obserwacji wielorybów, organizacjami non-profit, instytucjami badawczymi) w celu określenia strategii pobierania próbek i celów badawczych. Chociaż podstawowe parametry muszą pozostać stałe, aby zapewnić powtarzalność i porównywalność w badaniach, w miejscach o wysokim mętności, ruchu statku lub ograniczeniach czasowych, przestrzeniowych lub personelu mogą być konieczne korekty zgodne z protokołem. Takie adaptacje obejmują typ filtra, osiągalną objętość filtrowanej wody oraz sprzęt pomocniczy. Muszą być stosowane konsekwentnie w każdej kampanii pobierania próbek i transparentnie raportowane. Szczegółowe wytyczne operacyjne i kwestie logistyczne są przedstawione w krokach i dyskusji protokołu, aby wspierać jakość danych, przejrzystość i porównywalność regionalną.

Projekt testu qPCR
Aby ocenić skuteczność protokołu, eDNA humbaków (Megaptera novaeangliae), dobrze zbadanego gatunku migrującego regularnie spotykanego w zatoce Skjálfandi (Islandia)53 i sezonowo obecnego na Azorach54, zostało wzmocnione z próbek zebranych w terenie. Procesy analizy DNA, ekstrakcji i qPCR zostały początkowo zoptymalizowane poprzez międzylaboratoryjny test pierścieniowy z udziałem czterech laboratoriów projektu eWHALE, co poprawiło spójność i zastosowanie w instytucjach14.

Aby niezawodnie wykryć obecność eDNA humbaka, opracowano i zweryfikowano specyficzny dla gatunku test MGB (wiążący drobne rowki) qPCR skierowany na region mitochondrialny ND5 zgodnie z ustalonymi wytycznymi55 (Tabela 1). Startery oligonukleotydowe oraz sonda zostały wygenerowane przy użyciu oprogramowania do wyrównania i analizy sekwencji DNA56, mających na celu maksymalizację specyficzności gatunkowej i efektywności amplifikacji (Plik uzupełniający 1 – Ilustracja uzupełniająca S1). Specyficzność testu oceniano in vitro przy użyciu taksonów docelowych i niedocelowych (Balaenoptera acutorostrata, Delphinus delphis, Physeter macrocephalus, Homo sapiens). Stężenia DNA użyte do generowania krzywych standardu qPCR zostały zmierzone na podstawie standardu DNA pochodzenia tkankowego 42,57,58,59,60. Granica wykrywalności (LOD) testu, zdefiniowana jako najniższe stężenie dające dodatnie amplifikacje w 95% replikowanych próbek, została wyznaczona napoziomie 11,61. Wykrywanie eDNA humbaka oceniano dla próbek terenowych poprzez oszacowanie udziału pozytywnych reakcji i siły sygnału (tj. progu cyklu, wartości Ct) dla każdej replikacji próbki w potrójnych pomiarach qPCR, aby uwzględnić zmienność amplifikacji i poprawić niezawodność detekcji 57,60,62. Wykrywanie gatunków zostało następnie zweryfikowane dwukierunkowym sekwencjonowaniem Sangera, a następnie potwierdzono analizą BLAST63.

dane qPCR są prezentowane jako średnia ± odchylenia standardowego (SD). Istotność statystyczna między grupami oceniano za pomocą nieparametrycznego testu Mann-Whitney U oraz dwupróbowego testu t-testu Welcha. Różnice uznano za istotne przy p < 0,05. Wszystkie analizy zostały przeprowadzone przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej64.

Protokół

Etyka i zgodność z regulacjami
Wszystkie działania obserwacyjne waleni oraz późniejsze pobieranie próbek wody muszą być przeprowadzane zgodnie z krajowymi i regionalnymi przepisami dotyczącymi dzikiej przyrody. Pobieranie próbek należy wykonywać wyłącznie z autoryzowanych jednostek działających na podstawie ważnych pozwoleń na obserwację wielorybów lub badania. Utrzymuj minimalne odległości podejścia do gatunków docelowych określonych przez lokalne przepisy i unikaj manewrów przeznaczonych wyłącznie do pobierania próbek. Próbki tkanek wielorybów użyte do walidacji testu zostały zebrane na podstawie odpowiednich regionalnych pozwoleń i udostępnione partnerom projektu eWHALE zgodnie z krajowymi i instytucjonalnymi przepisami.

UWAGA: Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek czynności pobierania próbek przejrzyj następujące dokumenty i zgromadzić niezbędny sprzęt: Tabelę materiałów, zestaw do pobierania próbek eDNA (Plik uzupełniający 1-Rysunek S2), materiały używane do pobierania próbek DNA środowiskowych (Rysunek 1) oraz przegląd etapów próbkowania i przepływu filtracji pokładowej (Rysunek 2).

1. Przygotowanie próbek eDNA

  1. Przygotuj materiały terenowe, w tym arkusze danych terenowych oraz laminowane protokoły terenowe (Plik uzupełniający 2 i Plik uzupełniający 3).
  2. Przygotuj zapasowe rękawice, zapasowe filtry (jeden filtr na próbkę do powtórzenia), wodoodporny marker oraz dedykowany pojemnik na odpady (Rysunek 1A).
    UWAGA: Używaj dołączonych samoochronnych filtrów eDNA (pory 1,2 μm), aby zminimalizować ryzyko kontaktu i zanieczyszczenia65,66.
  3. Przygotuj jedno lub więcej sztywnych wiader, odpowiednich do typu jednostki i konfiguracji pokładowej (Plik uzupełniający 1 – Rysunek uzupełniający S3).
    1. Oznaczaj wiadra przy pojemności 10 L markerem permanentnym. Przygotuj kilka mniejszych wiader, jeśli obsługa 10 L jest niepraktyczna.
    2. Jeśli dostęp do wody jest ograniczony, mocno przymocuj linę do wiadra.
      UWAGA: Używaj wiader z pokrywką, aby zminimalizować rozlanie, gdy ruch naczynia jest nadmierny (Rysunek 1B).
    3. Przygotuj wtórne pojemnik eDNA do łączenia mniejszych objętości oraz dodatkową skrzynkę transportową, aby zapewnić transport wiader wolny od zanieczyszczeń (Rysunek 1C).
  4. Przygotuj przenośną pompę perystaltyczną lub próżniową (rysunek 1D). Przed wejściem na pokład całkowicie naładuj pompę i odłącz zasilanie tuż przed użyciem.
  5. Przydziel zadania pobierania próbek, filtracji i rejestracji danych przed wyjazdem.
    UWAGA: Zakładaj rękawiczki podczas obsługi sprzętu i zmieniaj je między zadaniami.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Materiały terenowe używane do pobierania próbek DNA środowiskowych. (A) Zestaw narzędzi z samozachowawczymi filtrami eDNA, pojemnik na odpady, butelka do wyciskania z rozcieńczonym domowym wybielaczem (1:10), rękawiczki, karta danych terenowych i wodoodporny długopis; (B) przykłady typów wiader do próbkowania eDNA; (C) przykłady dodatkowego pojemnika eDNA do transportu i filtrowania dużych objętości oraz kontenera do transportu wiader na pokładzie; (D) przykłady przenośnych pomp do filtracji wody. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schemat koncepcyjny pobierania próbek DNA środowiskowych na łodziach obserwatorskich wielorybów. Ilustracja opisuje kroki prowadzone, w tym pobieranie próbek wody i filtrację na pokładzie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

2. Czyszczenie sprzętu

  1. Załóż jednorazowe rękawiczki przed czyszczeniem.
  2. Przygotuj roztwór wybielacza, rozcieńczając domowy wybielacz (5-6% podchlorynu sodu) w stosunku 1:10 z wodą oczyszczoną (~50 mL na cykl).
  3. Roztwór aplikuj, rozpryskując równomiernie na wszystkich powierzchniach do wszystkich wiader, pokrywek, pojemników i rur pomp. Utrzymuj minimalny czas kontaktu z wybielaczem na wszystkich powierzchniach.
  4. Dokładnie opłucz wodą z kranu 3 razy (Rysunek 3).
  5. Materiały wysusz na powietrzu w bezpiecznym miejscu i przechowuj je w bezpiecznym i czystym miejscu przed wejściem na pokład.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Kroki do czyszczenia sprzętu. (A) Nałóż rozcieńczony roztwór wybielacza domowego (1:10); (B) równomiernie rozprowadzane rękawicami wolnymi od DNA; (C) dokładnie trzykrotnie przepłukać wodą z kranu; oraz (D) powtórzyć proces dla dodatkowych materiałów, jeśli jest to możliwe (np. pojemniki eDNA). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Pobieranie próbek wody

UWAGA: Przestrzegaj wszystkich przepisów bezpieczeństwa na każdym statku lub platformie, w tym noszenia kamizelek ratunkowych lub kombinezonów wypływających, gdy jest to wymagane.

  1. Zabierz wszystkie materiały na pokład przed przyjazdem pasażerów i przechowaj je w wyznaczonym, czystym miejscu.
  2. Koordynacja, czas pobierania próbek i pozycjonowanie jednostki wraz z załogą jednostki.
  3. Obserwuj wzorce wynurzenia, aby przewidzieć nurkowania wielorybów (Rysunek 4). Załóż nowe rękawiczki przed próbką.
  4. Pobierz 20 L wody morskiej jak najszybciej (nie więcej niż 10 minut poklatkowy) z odcisku fłetwy po zanurzeniu wieloryba, aby uzyskać dwie repliki próbek po 10 L.
  5. Transportuj zebraną wodę do wyznaczonej stacji filtracyjnej na pokładzie, używając pokrywek lub dodatkowego sterylnego pojemnika, aby zapobiec rozlaniu (jeśli jest to konieczne).
  6. Zapisz tożsamość gatunku, współrzędne GPS, czas oraz identyfikację replikacji próbki w kartce danych.
  7. Zmień rękawice natychmiast po zgłoszeniu.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Sekwencja humbaka wynurzająca się. (A) Dmuchanie wieloryba; (B) wygięcie grzbietu i podniesienie ogona przed nurkowaniem; (C) wzór odcisku płetwy na powierzchni po zanurzeniu wieloryba. Przypisanie zdjęcia: Ocean Missions (A, B, C, 2024). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

4. Filtracja eDNA

  1. Otwórz woreczek filtracyjny i dotykaj filtra tylko przy wyjściu (Plik uzupełniający 1 – Rysunek uzupełniający S4).
  2. Włóż wlot do rurki i podłącz rurkę pompy do wylotu (Rysunek 5A,B).
  3. Zanurz rurkę w próbce wody, nie zanurzając obudowy filtra (Rysunek 5C).
  4. Ustaw pompę (patrz Tabela materiałów dla typów pomp) na szybki, stały przepływ.
  5. Filtruj 10 L nieprzerwanie, monitorując stabilność przepływu (sprawdź obecność pęcherzyków powietrza, rozdarć, rozdarć lub awarii uszczelnienia).
    UWAGA: Zakończ filtrację maksymalnie 45 minut.
  6. Odwróć filtr i pracuj pompą przez 30-60 sekund, aby usunąć resztki wody. Upewnij się, że w obudowie filtra nie pozostała widoczna wilgoć.
  7. Wyłącz pompę i odłącz rurki.
  8. Wyrzuć rurkę do pojemnika na odpady, włóż filtr do oryginalnego worka i natychmiast go oznacz.
  9. Przechowuj filtry na pokładzie w zamkniętym, sztywnym pojemniku lub w chłodzeniu (jeśli temperatura otoczenia > 20 °C), z dala od bezpośredniego światła słonecznego i stref pasażerskich.
  10. Zmień rękawice i powtórz filtrację przy drugim powtórzeniu.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Kroki konfiguracji filtracji na pokładzie. (A) podłączyć wlot filtra (białą część) do rurki do rurki; (B) podłącz rurkę pompy do wylotu filtra (żółta część); oraz (C) zanurzenie części rurki w próbce wody. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

5. Kontrola ujemna w terenie i raportowanie danych

  1. Po każdej piątej próbce odcisków flukeprintów przefiltruj jedno pole negatywne.
  2. Używaj docelowej wody wolnej od DNA zaraz po powrocie na brzeg i przed czyszczeniem sprzętu.
  3. Po każdej podróży przenieś wszystkie dane do cyfrowego arkusza pobierania próbek eDNA (Plik Uzupełniający 4).

6. Filtrowanie przechowywania i wysyłki

  1. Przechowuj samozachowawcze filtry eDNA w bezpiecznym, suchym pojemniku w zacienionym pomieszczeniu o temperaturze otoczenia—lub w lodówce, jeśli temperatura otoczenia przekracza 20 °C—nie dłużej niż 3 miesiące przed wysyłką.
  2. Przed wysyłką sprawdź torby filtracyjne pod kątem wilgoci.
  3. Etykietuj i wysyłaj filtry w izolowanych pojemnikach z okładami lodowymi do wyznaczonego laboratorium.

7. Analiza laboratoryjna

UWAGA: Wszystkie procedury laboratoryjne wykonuj w dedykowanych pomieszczeniach sterylnych UV, z odpowiednią wentylacją i oddzielnymi stołami roboczymi dla PCR, używając rękawiczek wolnych od DNA i odzieży ochronnej 55,67,68.

  1. Liza DNA
    1. Oznacz probówkę reakcyjną o pojemności 2 mL na filtr.
    2. Umieść filtr w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 mL i wyrzuć gumową pokrywkę (rysunek 6A).
    3. Za pomocą kleszczy wolnych od DNA zgiąć błonę (Plik uzupełniający 1 – Rysunek uzupełniający S5) w trójkąt i przenieść ją do rurki reakcyjnej o pojemności 2 mL, z końcówką skierowaną w dół (Rysunek 6B-D).
    4. Dodaj 380 μL buforu TES i 20 μL Proteinazy K (patrz Tabela Materiałów) do każdej probówki reakcyjnej, co daje 400 μL buforu lizyzowego (Rysunek 6E).
    5. Krótko zawiruj i wysiabuj w temperaturze 56 °C przez ≥3 godziny z mieszaniem (rysunek 6F).
    6. Rurki wirówkowe o stężeniu 18 626 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Przezroczysty do jasnego lizatu oznacza udany trawienie.
      UWAGA: Protokół może zostać tymczasowo wstrzymany na tym etapie, jeśli lizaty są przechowywane w temperaturze -20 °C.
  2. Ekstrakcja DNA
    1. Inkubować lizaty w temperaturze 56 °C przez 10 minut przed ekstrakcją.
    2. Odczynniki do ekstrakcji pipety w płytkach płuczkich i elucijnych, uwzględniając negatywne kontrole i błędy pipetowania69 (patrz Plik Uzupełniający 1 – Tabela Uzupełniająca S1).
    3. Uwzględnij jeden blank ekstrakcyjny na każdą płytę z użyciem bufora TES.
    4. Przelej 300 μL lizatu do każdej studni na płycie wiązania. Dodaj 300 μL AL buforowego i 300 μL alkoholu izopropylowego do każdego otworu. Użyj wielu płytek wiążących, jeśli całkowita objętość lizatu przekracza 300 μL. Vortex i dodaj 30 μL cząstek magnetycznych do wiązania kwasów nukleinowych na dołek do pierwszej płyty wiązającej (Tabela materiałów).
    5. Przykryj płytę wiązania pokrowiec na wędkę.
    6. Uruchom wstępny program pobierania DNA dla dwóch płytek wiążących (łącznie 400 μL lizatu; patrz Tabela materiałów i Rysunek 7) oraz zautomatyzowanego protokołu ekstrakcji na robocie laboratoryjnym opartym na kulkach magnetycznych.
    7. Usuwaj chemikalia do przeznaczonych pojemników na odpady.
    8. Przenieś eluowane DNA do oznakowanych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 mL i przechowywać w temperaturze −20 °C.
      UWAGA: Protokół może zostać tymczasowo wstrzymany na tym etapie. Na tym etapie można podjąć kolejne kroki usuwania inhibitorów.
  3. qPCR
    1. Przygotować i ilościowo określić standardy DNA gatunku docelowego przy użyciu ekstraktów tkankowych oraz fluorescencyjnego, wysokoczułego testu dsDNA, zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów). Generuj ośmiopunktową krzywą standardową przez rozcieńczenie szeregowe (1:10) zaczynając od 10 ng/μL11,55. Standardy Aliquot przed qPCR, aby zminimalizować cykle zamrożenia i rozmrażania.
      UWAGA: Protokół może zostać tymczasowo wstrzymany na tym etapie.
    2. Przygotuj wszystkie reakcje qPCR w trzech egzemplarzach z użyciem płytek 96-dołkowych.
    3. Należy dołączyć jedną kontrolę bez szablonu (woda molekularna) oraz jeden blank do ekstrakcji na każdą płytkę qPCR.
    4. Przygotuj mieszankę główną zgodnie z Plikiem Uzupełniającym 1-Tabelą Uzupełniającą S2 oraz Rysunkiem 8A.
    5. W osłonie do ładowania DNA dodaj wcześniej przygotowane standardy DNA oraz 3 μL ekstraktu DNA do każdego dołka zawierającego mieszankę główną (Rysunek 8B).
    6. Uszczelnij płytę folią uszczelniającą (rysunek 8C).
    7. Wirówka 3 500 × g przez 10 sekund i załadowanie do ilościowego termocyklera PCR w czasie rzeczywistym (rysunek 8D,E).
    8. Przeprowadź test w optymalnych warunkach cyklicznych, określonych w Tabeli 2, i zapisz dane za pomocą oprogramowania producenta (Tabela materiałów)11.

figure-protocol-6
Rysunek 6: Przepływ pracy w lizie DNA. (A) Usuń gumową nakrętkę z samozachowawczego filtra eDNA i umieść ją w kolbie Erlenmeyera; (B) sterylizować dwie pary kleszczy przez trzykrotne podpalanie; (C) fałdowanie błony filtracyjnej; (D) włożyć go do rurki 2 mL; (E) dodaj bufor lizowy i proteinazę K, a (F) inkubuj próbki w temperaturze 56 °C przez 3 godziny. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-7
Rysunek 7: Materiały i sprzęt używane do ekstrakcji DNA. (A) Płyty wiązania, płukania i elucijnego, materiałów zużywalnych oraz odczynników do przygotowania ekstrakcji; oraz (B) robota laboratoryjnego opartego na kulkach magnetycznych używanego do przetwarzania próbek. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-protocol-8
Rysunek 8: Przepływ pracy dla qPCR. (A) Przygotowanie mieszanki głównej w wcześniej sterylizowanym pomieszczeniu UV (pod osłoną roboczą przeznaczoną do przygotowania mieszanek głównych); (B) załadowanie standardów DNA, ekstrakcjonowania i sterowania do stacji ładowania DNA zgodnie z pokazanym wzorcem; (C) płyta pieczęci; (D) wirówka; (E) ładuj do ilościowego termocyklera PCR w czasie rzeczywistym. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Wyniki

W 2024 roku zebrano łącznie 154 próbki odcisków futli (308 filtrów eDNA) przy użyciu tego zoptymalizowanego protokołu, w tym 96 filtrów w Zatoce Skálfandi (Islandia; 9 kontrolnych w terenie i 76 replik humbaków) uzyskanych od marca do listopada, 151 filtrów na Azorach (Portugalia; 12 kontrolnych i 15 replik humbaków) uzyskanych w lipcu oraz 61 filtrów na Morzu Liguryjskim (Włochy; 4 kontroli terenowe) uzyskanych od maja do października. Wszystkie próbki obejmowały pobranie do 10 L wody morskiej (dwa repliki na próbkę odcisku fłękitu) za pomocą samozachowawczych filtrów eDNA (Tabela 3). Podczas badań terenowych zebrano dwa rodzaje negatywnych kontroli: oczyszczoną wodę filtrowaną po wybielaniu sprzętu oraz wodę morską zebraną przy ponownym wejściu do portu(42). Ten ostatni był celowo filtrowany przed czyszczeniem wybielaczem, aby ocenić potencjalne zanieczyszczenie krzyżowe eDNA waleni podczas pobierania próbek. Próbki były wysyłane z każdego miejsca pobierania próbek w dwóch partiach do Jednostki Badań Stosowanej Ekologii Zwierząt, Wydziału Zoologii Uniwersytetu w Innsbrucku (Austria) w celu przetwarzania laboratoryjnego.

Wydajność testowania i kontroli
Podzbiór 44 filtrów (30 replik, w tym 2 sterowanie polowe z Zatoki Skjálfandi na Islandii oraz 14 filtrów, w tym 1 kontrolny z wód otaczających wyspy Faial i Pico na Azorach, Portugalia) zostało przeanalizowane pod kątem eDNA humbaka (Rysunek 9). Sygnał był mierzony w potrójnych reakcjach qPCR. Próbka (czyli filtr eDNA) była uznawana za dodatnią, jeśli jeden na trzy replikacje qPCR został amplifikowany. Granica wykrywalności (LOD) testu w tym badaniu została obliczona jako 0,0001 ng/μL (średni Ct LOD = 35,8). Spośród 41 analizowanych filtrów 20 (49%) wykazało wzmocnienia, podczas gdy 24 (58%) nie wykazały wzmocnienia. Niewykrywalność (brak wartości CT) najprawdopodobniej odzwierciedla brak lub bardzo niskie stężenia docelowego DNA. Niewykrycia obejmowały 5 z 13 filtrów z Azorów (38%) oraz 19 z 28 filtrów z Islandii (68%). Puste materiały ekstrakcyjne zostały przesiewane pod kątem DNA kręgowców morskich za pomocą testu MarVer370 i nie wykazały wykrywalnego amplifikacji, co wskazuje na brak zanieczyszczenia krzyżowego podczas ekstrakcji DNA. Kontrole terenowe (NC) i qPCR (NT) nie wykazały amplifikacji, co potwierdza brak zanieczyszczeń podczas pracy terenowej i przesiewania qPCR (Tabela 4).

Spośród 20 pozytywnych filtrów dziewięć (22%) wykazało co najmniej jedną wartość Ct poniżej granicy wykrywalności testu (LOD; 0,0001 ng/μL) i dlatego zostały sklasyfikowane jako wiarygodne detekcje. Wśród nich były 4 z 8 filtrów z Azorów (50%) oraz 5 z 12 z Islandii (42%). Dodatkowe 11 filtrów (27%) wyprodukowało jedną lub więcej wartości Ct powyżej LOD, w tym 4 filtry z Azorów (50%) i 7 z Islandii (58%), co wskazuje na prawdopodobne wykrycia (Rysunek 10). Analiza porównawcza wykazała nieco niższą wartość średniego progu cyklu (Ct) dla filtrów azorskich (34,7 ± 3,60; n = 8) w porównaniu do filtrów islandzkich (36,9 ± 3,60; n = 10). Test Mann-Whitney U wykazał, że ta różnica nie jest statystycznie istotna (U = 199,0, p = 0,204). Biorąc pod uwagę odwrotną zależność między wartością Ct a siłą sygnału DNA, wyniki wskazują na nieco wyższe stężenia eDNA docelowego humbaka w filtrach Azorów (Rysunek 11).

Ograniczenia wykonalności
Liczba próbek odcisków futli na trasę różniła się w zależności od długości podróży i warunków pogodowych. Podczas 3-godzinnych wypraw na Azorach zebrano około dwóch do trzech próbek (dających do sześciu filtrów eDNA), we Włoszech od dwóch do czterech próbek w ciągu ~8 godzin (co dało do ośmiu filtrów) oraz jedną do dwóch próbek (do 4 filtrów) podczas 3,2-godzinnych wyjazdów na Islandii. Wydajność filtracji była generalnie wysoka na Azorach i we Włoszech. Na Azorach 10 L wody morskiej było konsekwentnie filtrowane w ciągu 10-15 minut, podczas gdy we Włoszech ta sama objętość była filtrowana w około 10 minut. Na Islandii objętości filtrowane wynosiły od 4,5 do 10 L (średnia = 8,5 L), ze średnim czasem filtracji wynoszącym ~40 minut z powodu częstego zatykania filtrów, prawdopodobnie spowodowanego zatrzymywaniem się cząstek w wodzie na obszarze badanym. Konkretnie, 10 L zostało pomyślnie przefiltrowanych dla 46 z 98 filtrów (47%), objętości między 7 L a 10 L dla 31 filtrów (32%) oraz objętości między 4 L a 7 L dla 21 filtrów (21%) (Plik Uzupełniający 1 - Tabela Uzupełniająca S3).

Protokół zaleca filtrację jednym kontrolnym ujemnym polem po każdej piątej próbce odcisku fłetów. Jednak w warunkach operacyjnych obserwacji wielorybów nie udało się tego w pełni zrealizować w opisanym studium przypadku ze względu na ograniczenia logistyczne, takie jak ograniczona dostępność filtrów, ograniczenia czasowe i opóźnienia w dostawach. To zmniejszyło osiągalne proporcje kontroli do próbki do 1:10,7 na Islandii (9/96), 1:12,6 na Azorach (12/151) oraz 1:15,3 we Włoszech (4/61). Pomimo tych odchyleń, żadne badania negatywne w terenie ani laboratorium nie wykazały wzmocnienia.

figure-results-1
Rysunek 9: Przegląd lokalizacji próbek. Czarne kropki na mapie oznaczają miejsca, gdzie pobrano próbki z odcisku płetwi humbaka w zatoce Skjálfandi (Islandia) oraz na Azorach. Nazwa filtra eDNA jest podana w pobliżu odpowiedniego obszaru próbkowania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 10: Detekcje z podzbioru filtrów eDNA z Azorów i Islandii. qPCR średnie wartości Ct i siła sygnału DNA dla pozytywnych wykryć na Azorach i Islandii (co najmniej jedno pozytywne replikowanie PCR), z SD i LOD. Paski są kolorowane według siły sygnału względem LOD: ciemnoniebieski = sygnał silny (Ct ≤ 35,8) oznacza wiarygodne wykrycia, jasnoniebieski = słaby sygnał (Ct > 35,8) oznacza prawdopodobne wykrycia. Paski błędu SD reprezentują zmienność między replikacjami PCR. Czerwona przerywana linia oznacza LOD (Ct = 35,8). Średnie wartości Ct są pokazane nad każdym paskiem. Skróty: Ct = próg cyklu; SD = odchylenie standardowe; LOD = granica wykrywalności. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 11: Wartości progowe średniego cyklu wykrywania DNA humbaków z Azorów i Islandii. Czarne linie w ramkach pudełkowych wskazują medianę, czerwone kwadraty średnie wartości Ct (SD), natomiast wąsy oznaczają minimalne i maksymalne wartości dla Azorów i Islandii. Test Mann-Whitney U wykazał, że ta różnica nie jest statystycznie istotna (U = 199,0, p = 0,204). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Sekwencje primerów i sond dla testu qPCR ukierunkowanego na ND5. Sekwencje te obejmują zapalniki do przodu i do tyłu, sekwencje sond MGB (5′-3′), optymalną temperaturę wyżarzania oraz limit wykrywania testu (LOD). (*) LOD definiuje się jako najniższe stężenie DNA (ng/μL) w DNA gatunku docelowego, przy którym ≥95% replikacji PCR dało dodatnie amplifikacje. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Zoptymalizowane warunki cykliczne dla testu eDNA qPCR humbaka. Te zoptymalizowane ustawienia qPCR to 95°C przez 10 minut (aktywacja enzymów), następnie 40 cykli przy 95°C przez 15 s (denaturacja) oraz 60°C przez 90 s (wyżarzanie/przedłużanie). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Przegląd konfiguracji próbkowania w terenie. Przegląd regionów pobierania próbek, partnerów terenowych, typów statków, gatunków docelowych, okresów pobierania próbek oraz replik próbek na Azorach, Islandii i we Włoszech. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: podsumowanie wykrywania qPCR dla próbek środowiskowych i kontroli. Pokazane są pozytywne detekcje (podświetlone na żółto), qPCR replikują wartości Ct oraz wyniki wykrywania; próbki zostały sklasyfikowane jako pozytywne, gdy przynajmniej jedna z replik qPCR wykazała amplifikację. "Brak CT" oznacza brak amplifikacji, kontrolne ujemne nie wykazały amplifikacji, a standardowa seria rozcieńczeń M. novaeangliae używana do określenia wydajności testu i LOD jest uwzględniona na dole tabeli. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Zawiera ilustracje uzupełniające i tabele, zawierające dodatkowe informacje o zastosowaniu protokołu, w tym zestaw do pobierania próbek eDNA z projektem primeru, typy zbiorników obserwatorskich do obserwacji wielorybów, charakterystyki filtrów eDNA samozachowawczych, objętości odczynników do ekstrakcji DNA i reakcji qPCR oraz różnice w szybkościach filtracji w różnych regionach pobierania próbek. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Karta katalogowa używana podczas pobierania próbek eDNA waleni. Ustandaryzowany formularz do rejestrowania metadanych rejsowych, obserwacji waleni oraz informacji o próbkach i filtrach. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Stopniowy protokół terenowy dla pobierania próbek eDNA waleni na statkach obserwatorskich wielorybów, obejmujący czyszczenie sprzętu, zbieranie wody morskiej i filtrację na pokładzie, raportowanie próbek oraz przechowywanie. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Szablon arkusza kalkulacyjnego z próbkowania eDNA z waleników. Standaryzowany formularz do rejestrowania informacji o próbkach po pobraniu próbki i filtracji na pokładzie. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Wykonalność operacyjna i wdrożenie terenowe
Przedstawiony tutaj protokół wnosi ustandaryzowany, eDNA workflow, który równoważy wrażliwość na wykrywanie z rzeczywistymi ograniczeniami. Integrując pobieranie próbek na dużą ilość, ukierunkowane na odciski futbolów, filtrację pokładową z użyciem samozachowawczych filtrów zamkniętych oraz ustandaryzowane środki kontroli zanieczyszczeń, protokół zapewnia powtarzalne ramy, które można stosować w różnych regionach i kampaniach pobierania próbek. To podejście jest zgodne z rosnącym uznaniem eDNA jako opłacalnego i skalowalnego uzupełnienia konwencjonalnych technik monitoringu morskiego 9,10,22.

Wcześniejsze badania eDNA waleni opierały się głównie na pobieraniu próbek wody morskiej z dużych statków badawczych opartych na transekcie lub na okazjonalnych próbkach małej objętości w pobliżu obserwacji waleni. Podejścia oparte na transekcie umożliwiają szerokie pokrycie przestrzenne, ale często rejestrują rozcieńczone i czasowo rozdzielone sygnały DNA, ograniczając wykrywanie rzadkich lub przejściowych gatunków71, nawet gdy pobieranie próbek odbywa się blisko powierzchni, i zazwyczaj wymaga specjalistycznych naczyń i infrastruktury 25,37,72. Z kolei pobieranie próbek w małej objętości w pobliżu wielorybów wynurzających poprawia specyficzność spotkań, ale pozostaje podatne na fałszywie negatywne wyniki z powodu ograniczonej objętości wody i niespójnych praktyk filtracji72,73. Poprzez wyraźne celowanie w odciski futli i filtrowanie dużych ilości na pokładzie, przedstawiony tutaj workflow zwiększa prawdopodobieństwo wychwycenia eDNA waleni o niskim stężeniu, jednocześnie pozostając wykonalnym w warunkach czasowych i przestrzennych typowych dla operacji obserwacji wielorybów. Stosowanie zamkniętych, samoochronnych filtrów dodatkowo minimalizuje ryzyko obsługi i zanieczyszczenia, eliminując potrzebę stosowania buforów konserwacyjnych stosowanych w terenie oraz upraszczając logistykę w ograniczonych warunkach pokładowych42,66.

Aby zapewnić porównywalność badań krzyżowych, następujące parametry muszą pozostać ustalone w kampanii pobierania próbek: pobieranie wody morskiej bezpośrednio z widocznych odcisków waleni; dwa biologiczne repliki po 10 litrów na odcisk fłębi; stosowanie samozachowawczych filtrów eDNA immetyzuje filtrację na pokładzie podczas standaryzowanych środków kontroli zanieczyszczeń, w tym regularnych negatywnych kontrol terenowych przy określonej minimalnej częstotliwości; oraz specyficzne dla gatunku badania qPCR przeprowadzane w trzech egzemplarzach z odpowiednimi kontrolami. Inne parametry mogą się zmieniać bez naruszania ram metodologicznych, pod warunkiem ich konsekwentnego i przejrzystego raportowania, w tym sprzęt do zbierania wody i obsługa wody, wielkość porów filtra, typ pompy i konfiguracja rur, czas filtracji oraz osiągalna objętość filtracji w warunkach zatoru, logistyka próbek na pokładzie oraz warunki krótkoterminowego przechowywania przed wysyłką. Ponieważ wiele etapów przetwarzania w badaniach eDNA pozostaje zmiennych, zaleca się rygorystyczne raportowanie wszystkich etapów pobierania próbek i analizy.

Wykonalność tego protokołu jest najwyższa w stanach spokojnych do umiarkowanych (≤ Beauforta 3), przy niskim do umiarkowanego mętności, gdy czas i przestrzeń na pokładzie pozwalają na przetwarzanie dwóch filtrów eDNA na odcisk fłękowego oraz objętość wody przefiltrowanej 10 L na filtr. W praktyce wykwalifikowani naukowcy mogą pobrać próbki do Beauforta 3, ale naukowcy obywatelscy powinni pracować tylko w spokojnych warunkach (Beaufort 1-2), ze względu na ruch statku i turbulencje, mimo że czasem odbywają się wycieczki obserwacyjne wielorybów na Beaufort 3. Filtracja powinna rozpocząć się jak najszybciej po zebraniu wody, aby zminimalizować degradację DNA47,74. Strategie pobierania próbek minimalizujące rozcieńczenie powierzchniowego eDNA wywołane przez śmigło, takie jak pobieranie z zawietrznych i niższych boków jednostki, dodatkowo wspierają celność celowania i wiarygodne wykrywanie47. Unikanie manewrowania wstecznego i zapobieganie kontaktowi lin (przymocowanych do wiader) z próbkami wody morskiej dodatkowo zmniejsza ryzyko skażenia, zgodnie z najlepszymi praktykami wodnego eDNA38. W zależności od konfiguracji i logistyki statku (np. wysokość, ruch i dostępna przestrzeń na pokładzie), obsługiwane są dwie strategie pobierania próbek, jeśli są stosowane konsekwentnie: (i) niezależne zbieranie i filtracja dwóch replik 10 L przy użyciu dwóch oddzielnych wiader lub (ii) pobieranie pojedynczej próbki wody 20 L przekazywanej do szczelnego sterylnego pojemnika do bezpiecznego transportu na pokładzie, a następnie dzielonej na dwa repliki po 10 L do filtracji. Objętość filtracji 10 L na filtr stanowi praktyczny kompromis między prawdopodobieństwem wykrycia a wysiłkiem filtracyjnym w warunkach obserwacji wielorybów.

Większe objętości zwiększają prawdopodobieństwo wychwycenia rzadkiego lub niskostężeniowego eDNA oraz zmniejszają liczbę fałszywie negatywnych wyników powszechnych w badaniach waleni39, 40, 75, jednocześnie pozostając operacyjnie wykonalnymi w połączeniu z filtrami samozachowującymi się i dużymi porami42. Podwyższone obciążenia cząsteczkami, ruch statku, ograniczona przestrzeń na pokładzie lub ograniczenia czasowe mogą obniżać efektywność filtracji i osiągalne objętości, co ogranicza zastosowanie protokołu. W takich przypadkach mogą być wymagane dostosowania zgodne z protokołem, takie jak zmniejszenie objętości wody lub alternatywne rozmiary porów filtrów, które powinny być stosowane konsekwentnie w kampaniach pobierania próbek, aby utrzymać porównywalność danych. Czas trwania rejsu, czas spotkań z wielorybami oraz zdolność filtracji decydują o osiągalnej liczbie próbek. Podczas standardowych, trzygodzinnych wycieczek obserwacyjnych wielorybów, zazwyczaj można ukończyć jedną do dwóch próbek odcisków futli (czasem trzy) bez zakłócania działalności lub doświadczenia obywatelskiej nauki. Podczas dłuższych wypraw pojemność pobierania próbek rośnie wraz z codziennym wysiłkiem obserwacji wielorybów (np. ~8 godzin dziennie w naszym studium przypadku Włoch). W praktyce próbkowanie eDNA mogłoby być wdrażane we wszystkich trzech miejscach podczas szczytu aktywności turystycznej.

Sukces amplifikacji eDNA i kontrola zanieczyszczenia
Próbki środowiskowe, zwłaszcza te pobrane w wodach bogatych w składniki odżywcze, mogą zawierać inhibitory PCR zdolne do tłumienia amplifikacji i generowania fałszywie negatywnych wyników76. Chociaż w poprzednich analizach islandzkich próbek w ramach tego samego projektu42 nie wykryto hamowania, włączenie kroku usuwania inhibitorów zapewniło spójny sukces amplifikacji (patrz Tabela materiałów) i jest zgodne z zaleceniami najlepszych praktyk dotyczących workflow wodnego eDNA14,55.

Stała wydajność wykrywania qPCR w różnych regionach wskazuje, że protokół niezawodnie rejestruje eDNA waleni w różnych warunkach środowiskowych. Drobne różnice w Ct prawdopodobnie odzwierciedlają regionalne różnice w temperaturze, mętności i wydajności, co wpływa na uwalnianie, degradację i dyspersję eDNA75,76. Granica wykrywalności testu (0,0001 ng/μL) mieści się w zakresie czułości podanym dla innych zweryfikowanych testów waleni opracowanych w ramach projektu eWHALE 14,11,42. Wskaźniki wykrywania były zgodne z wcześniej opublikowanymi badaniami opartymi na odciskach fłówek, podkreślając wpływ zachowań gatunków i częstotliwość wynurzania się na skuteczność wykrywania 41,42,47. Do kwantyfikacji qPCR zastosowano standardy DNA pochodzące z tkanek, odzwierciedlając powszechną praktykę w badaniach morskich eDNA 57,72,77,78,79. Chociaż takie podejście może wprowadzać wariancję w bezwzględnej ilościowości 11,61,80,81,82,83, szczególnie dla próbek środowiskowych o niskim stężeniu i heterogenicznym środowisku 84,85, odzwierciedla ono rzeczywistą złożoność próbki55,86. Stosowanie standardów syntetycznych może poprawić ilościową powtarzalność oraz porównywalność między badaniami i jest zalecane dla przyszłych zastosowań11,87.

Potencjalne źródła skażenia obejmują transfer próbek krzyżowych, a także wprowadzenie ludzkiego lub niecelowego DNA środowiskowego podczas procedur manipulacji, co może prowadzić do fałszywie pozytywnych wykryć88. Ścisła kontrola zanieczyszczeń jest niezbędna podczas całego procesu terenowego i laboratoryjnego, szczególnie w ograniczonych warunkach typowych dla praktyk nauki obywatelskiej. Rutynowe zmiany rękawic, stosowanie sprzętu wolnego od DNA, zamknięte systemy filtracji, standaryzowane szkolenia, rutynowe włączanie kontroli terenowej i laboratoryjnej, dokumentacja potencjalnych zdarzeń skażenia oraz walidacja testów według ustalonych schematów są kluczowe dla zapewnienia wiarygodności danych i wykrywania gatunków 11,31,49,51,55,89. Chociaż użycie plastiku jest nieuniknionym ograniczeniem w terenowym pobieraniu próbek molekularnych, zużycie było ograniczone tam, gdzie to możliwe, a częściowo biodegradowalne materiały filtracyjne stosowano66.

Ograniczenia, skalowalność i przyszłe konsekwencje
Zatoranie filtrów pozostaje kluczowym ograniczeniem w mętnych lub produktywnych środowiskach, takich jak Zatoka Skjálfandi (Islandia), gdzie zawieszona materia organiczna i gęstość planktonu prawdopodobnie obniżały efektywność filtracji43,90. Rejestrowanie czasu filtracji, wskaźników zatkania filtra, takich jak zmniejszony przepływ, widoczne pęcherzyki powietrza w filtrze czy naprężenie pompy, oraz ograniczenie czasu filtracji do około 45 minut na replikację wspiera dalszą interpretację i porównanie. Użycie sterylnego urządzenia pływającego do zawieszenia filtra lub worków filtracyjnych zasilanych grawitacją może potencjalnie skrócić czas obsługi podczas filtracji, choć te ostatnie mogą być niekompatybilne z samozachowującymi się filtrami eDNA i dużymi objętościami (≥1 L)91. Filtry o większych porach (≥ 5 μm) mogą dodatkowo poprawić szybkość filtracji, choć podczas próbek pilotażowych dla walenieDNA 45,92 należy ocenić skuteczność detekcji specyficzną dla taksonu.

Kluczowe kwestie przed pełnym pobieraniem próbek obejmują: priorytetowe traktowanie filtracji pokładowej zamiast opóźnionego przetwarzania, utrzymanie stałej ilości wody i konfiguracji filtrów, przeprowadzanie próbek pilotażowych w celu optymalizacji filtracji w warunkach lokalnych oraz dostosowanie wysiłku pobierania próbek do pojemności statku i czasu rejsu. Cyfrowe narzędzia do wprowadzania danych, które umożliwiają strukturyzowane, terenowe rejestrowanie przez naukowców-obywateli, są zalecane do przyszłych zastosowań93.

Skuteczne zastosowanie tego procesu od początku do końca świadczy o odporności w warunkach operacyjnych, jednocześnie podkreślając ograniczenia związane z przestrzenią, czasem, pogodą i ryzykiem zanieczyszczenia inherentnym dla kontekstów nauki obywatelskiej10,94. Pomimo tych ograniczeń, statki obserwacyjne wielorybów stanowią potężną i niedostatecznie wykorzystywaną platformę do monitorowania waleni eDNA, gdy zapewnione są ustandaryzowane szkolenia i nadzór 31,32,42,95. Integracja tego procesu z uznanymi narzędziami monitorującymi walenie, takimi jak identyfikacja foto-fotografia, akustyka pasywna czy pobieranie biopsji, może powiązać wykrywanie genetyczne z danymi behawioralnymi i demograficznymi. Chociaż badanie koncentruje się na wykrywaniu specyficznym dla gatunku na podstawie qPCR, przyszłe zastosowania mogłyby integrować metabarcoding DNA lub analizy genetyczne populacji, co dodatkowo zwiększa wartość ekologiczną i ochronną monitoringu eDNA waleni.

W miarę jak podejścia oparte na eDNA nadal się rozwijają, ten proces pracy zapewnia skalowalną podstawę do integracji monitorowania genetycznego z istniejącymi programami obserwacji i ochrony morza, szczególnie w gorących punktach waleni i wrażliwych ekosystemach.

Oświadczenia

Belén García Ovide jest założycielką i dyrektorką wykonawczą Ocean Missions, organizacji non-profit skupionej na ochronie oceanów, z siedzibą w Húsavík, na północnym wschodzie Islandii. Ocean Missions koordynuje pobieranie próbek z statków obserwatorów wielorybów na Islandii, a także z arktycznych jednostek ekspedycyjnych. Pełni także funkcję przedstawicielki North Sailing, firmy zajmującej się obserwacją wielorybów z Húsavík, w ramach projektu eWHALE. Te powiązania nie miały wpływu na projekt badania, zbieranie danych, analizę ani interpretację wyników.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować wszystkim osobom zaangażowanym w prace terenowe i laboratoryjne, a mianowicie:

i) Aidan Mabey, Matteo Tosato, Anouk Adolph, Jeanne Laporte, Romi Neerot i Isabell Österle, którzy uczestniczyli w próbkach pobranych w zatoce Skjálfandi na Islandii; ii) Dania Tesei, Michael Costa, Rita Norberto, Marlene Schwandt, Rita Leitão, Ricardo Ventura, Martijn Schouten, Giada Viscontini, Katharina Leeb, Anthony Le Floch, Francisco Nunes, Renato Cardoso, Faustine Darius, Monique Schouten, Laura Biet na Azorach (Portugalia); iii) Sandra Schallhart, Jana Robertson w Austrii; oraz iv) Sabina Airoldi, Mario Gabualdi, Marina Costa, Morgana Vighi, Nino Pierantonio, Roberto Raineri do zbierania danych w Sanktuarium Pelagos (Włochy).

Badania te zostały sfinansowane przez Biodiversa+, Europejskie Partnerstwo ds. Różnorodności Biologicznej w ramach wspólnego wezwania BiodivProtect na lata 2021-2022, współfinansowanego przez Komisję Europejską (Zgromadzenie Ogólno 101052342) oraz organizacje finansujące: 1) Islandzkie Centrum Badań (RANNÍS), (Grant nr 229030), 2) Ministerstwo Uniwersytetów i Badań (MUR), z konta specjalnego FIRST oraz IGRUE związane z europejskim partnerstwem Biodiversa+ Call 2021 - projekt eWHALE, 3) Austriackim Funduszem Naukowym (FWF) [doi: 10.55776/I6389] oraz funduszem wydawniczym Uniwersytetu w Innsbrucku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alternatywne filtry eDNA: SterivexTM / WaterraMerck Millipore/Waterra Pumps LimitedSVHVL10RC/NA0,45 & mikro; m wielkości porów. Wymagaj buforów ochrony eDNA 
AW1, AW2, bufory AEQiagen    19081, 19072, 19077Roztwory buforowe stosowane do oczyszczania DNA podczas ekstrakcji
Roztwór wybielacza (1:10)DM - Denk mit, HygienereinigerDostosowaneDekontaminacja powierzchni. Wszystkie etapy procesów laboratoryjnych
WiadraSklepy żeglarskie, sprzęt wędkarski, AmazonSztywny. Guma lub twardy plastik (≥ 10 L). Jeden lub więcej, w zależności od konfiguracji próbkowania i logistyki na pokładzie
Środek oczyszczający, ekspresowy PCR ExoSAP-IT75001.1.EAPrzygotowanie produktów PCR do sekwencjonowania Sangera
ChłodnicaMieszkalnictwoIzolowany sztywny pojemnik lub worek chłodzący
Jednorazowe rękawiczki, duże (L) i średnie (M),
bez pudru		Kimberly-Clark43431, 55090Jednorazowe rękawice nitrylowe lub lateksowe, pudełko na 100 sztuk. Wymagana ilość: 1 pudełko na 10–15 kursów
Standardy DNA (3 μ L) NADostosowaneRozcieńczenie seryjne z DNA z tkanek DNA (8 punktów, 10 ng/&mikro; L) od humbaka. Kalibracja w qPCR
Odzież laboratoryjna bezpieczna dla DNAFalano, PP-Ogólnie081-2900Wszystkie etapy procesów laboratoryjnych.
Pojemnik eDNASklepy mieszkaniowe lub sklepy z narzędziamiNAPokrywka, trwała, przezroczysta (≥ 10 L). 
Płytka elucijna, osłona na pręt, płytki do prania, płytka wiązającaQiagen19581, 997004, 1031656, 302570Tworzywa sztuczne używane do ekstrakcji DNA 
Etanol (8:10)Wytrzymaj, ACS ISO RangRóżneSterylizacja na stole. Wszystkie etapy laboratoryjne
Arkusze danych terenowych
Fluorescencyjny test wysokiej czułościThermo Fisher ScientificQ32851Wysoki czuły test Qubit dsDNA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)
Wirówka o dużych prędkościach (24 000 obr./min)Hettich Zentrifugen Oddziela supernatant zawierający DNA od szczątków. Liza DNA
Okłady lodoweSklepy mieszkanioweChłodzenie próbek wewnątrz kontenera transportowego
Spłony IPC do przodu i do tyłuZintegrowane technologie DNANAProdukt na zamówienie używany do amplifikacji DNA gatunku docelowego
IPC PrimeTime sondy qPCRZintegrowane technologie DNANAProdukt na zamówienie używany do amplifikacji DNA gatunku docelowego
Maska laminarna  Produkty Kendro LaboratoryVFS1206Środowisko sterylne do przygotowania odczynników w przygotowaniu qPCR
Laminowany ilustrowany protokół terenowy  Dostosowane
Bufor lizyQiagen79216Bufor lizy DNeasy AL. Alternatywa dla buforu TES + proteinazy K
Magnetyczne koraliki– Robot oparty na DNAGłowica PCR KingFisher Apex 965400910Oprogramowanie: BindIx PC 
Cząstki magnetyczne do wiązania kwasów nukleinowych (30 i mikro; L)Qiagen67563Cząstki MagAtract. Ułatwia wiązanie DNA z kulkami magnetycznymi podczas ekstrakcji DNA
Master mix (5 μ L)EMM, Technologie Życia4396838TaqMan Environmental Master Mix (2.0)
Mini wirówka płytowa & nbsp;LabnetC1000Rozpraszanie kropelek cieczy i kondensacji z PCR i mikropłyt
Zestaw do usuwania inhibitorów PCR OneStep-96ZYMO ResearchD6035Oczyszczanie i usuwanie zanieczyszczeń w ekstraktach eDNA 
Płytki PCRBio-RadHSP9601Hard-Shell 96-Well
Pipety + sterylne końcówki filtrowanePipety: BIOHIT, końcówki filtracyjne: Biozym Safe  Końcówki uszczelek  ProfesjonalizmRóżneRęczne lub elektroniczne pipety mogą być używane przy różnych maksymalnych głośnościach
Wirówka płytowa i niebsp;NANAUsuwa bąbelki przed qPCR 
Proteinaza KAvantor VWRA4392.0010Trawi białka, aby pomóc uwalniać DNA podczas lizy
Woda oczyszczonaMilliQNAWoda wolna od RNaz, stosowana do kontroli negatywnej i roztworu czyszczącego  
Rurki reakcyjne (2 mL)Eppendorf30120094Liza DNA
Ilościowy termocykler PCR w czasie rzeczywistymAnalytikjenaNAPlatforma QTower 3G. Amplifikuje i ilościowa DNA w czasie rzeczywistym
LinyŻeglowanie, sklepy z narzędziami, porty rybackieNAMateriał wytrzymały (np. polietylen lub lina warkoczowa). Długość co najmniej dwukrotnie większa od wysokości jednostki
Folia uszczelniająca, klej, optycznaBio-RadMSB1001Mikrouszczelnienie 'B'. Uszczelnij płytę PRC przed PCR
Samozachowawcze filtry eDNASmith-Root  11579-251.2 & mikro; m wielkości porów. Ilość na kampanię próbkową: w razie potrzeby
Kontener transportowyLaboratoria, apteki, AmazonRóżneIzolacja styropianowa
Oprogramowanie do wyrównywania i analizy sekwencji biologicznychEdycja biografiiWersja 7Przyjazny dla użytkownika Edytor i Program Analizy Sekwencji Biologicznej dla Windows 95/98/NT
Butelka do wyciskaniaLaboratoria, aptekiRóżneWypełnione domowym wybielaczem (1:10)
Oprogramowanie do analizy statystycznejZespół R Studio. (2023)Wersja 4.2.1
Sterylizowane rękawice wolne od DNASempercare  Edycja79712Wszystkie etapy procesów laboratoryjnych.
Bufor TESProdukt niestandardowy, odpowiednik bufora lizy DNeasy
Pojemnik na toksyczne odpadyBezpieczna utylizacja odpadów niebezpiecznych. Wszystkie etapy
Lampa UV  SterilAIRSterylizacja okapu do przygotowania qPCR
Vortex-Genie 2 wirowy mikser Thermo Fisher Scientific50728002Homogenizuje i miesza odczynniki. Liza DNA, ekstrakcja
Pojemnik na odpadySklepy mieszkanioweMały, sztywny pojemnik
Pompa wodna (perystaltyczna/próżniowa)Eijkelkamp; Solinst/Smith-Root  12.34.SB; 410/12099Przenośne pompy
Wodoodporny markerRóżne

Bibliografia

  1. Hammerschlag, N., et al. Ecosystem function and services of aquatic predators in the Anthropocene. Trends Ecol Evol. 34 (4), 369-383 (2019).
  2. Sequeira, A. M. M., et al. Overhauling ocean spatial planning to improve marine megafauna conservation. Front Mar Sci. 6, 639(2019).
  3. Noren, D. P., Mocklin, J. A. Review of cetacean biopsy techniques: Factors contributing to successful sample collection and physiological and behavioral impacts. Mar Mamm Sci. 28 (1), 154-199 (2012).
  4. Evans, P. G. H., Hammond, P. S. Monitoring cetaceans in European waters. Mammal Rev. 34 (1-2), 131-156 (2004).
  5. Bittencourt, L., et al. Mapping cetacean sounds using a passive acoustic monitoring system towed by an autonomous Wave Glider in the Southwestern Atlantic Ocean. Deep Sea Res Part I. 142, 58-68 (2018).
  6. Balmer, B. C., et al. Advances in cetacean telemetry: A review of single-pin transmitter attachment techniques on small cetaceans and development of a new satellite-linked transmitter design. Mar Mamm Sci. 30 (2), 656-673 (2014).
  7. Angliss, R. P., et al. Comparing manned to unmanned aerial surveys for cetacean monitoring in the Arctic: Methods and operational results. J Unmanned Veh Syst. 6 (3), 109-127 (2018).
  8. Jahoda, M., et al. Mediterranean fin whale (Balaenoptera physalus) response to small vessels and biopsy sampling assessed through passive tracking and timing of respiration. Mar Mamm Sci. 19 (1), 96-110 (2003).
  9. Fu, M., Hemery, L., Sather, N. Cost efficiency of environmental DNA compared to conventional methods for biodiversity monitoring at marine energy sites. PNNL Rep. , PNNL-32310(2021).
  10. Sahu, A., et al. Environmental DNA (eDNA): Powerful technique for biodiversity conservation. J Nat Conserv. 71, 126325(2023).
  11. Klymus, K. E., et al. Development and testing of species-specific quantitative PCR assays for environmental DNA applications. J Vis Exp. (165), e61825(2020).
  12. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: The importance of primer specificity. PLoS ONE. 8 (3), e59520(2013).
  13. Wilcox Talbot, L. A., et al. Validated environmental DNA assay for detection of the rare Rice's whale (Balaenoptera ricei). Environ DNA. 7 (2), e70074(2025).
  14. Rodriguez, L. K., et al. Inter-laboratory ring test for environmental DNA extraction protocols: Implications for marine megafauna detection using novel qPCR assays. Metabarcoding Metagenomics. 9, e128235(2025).
  15. Adams, C. I., et al. Beyond biodiversity: Can environmental DNA cut it as a population genetics tool. Genes. 10 (3), 192(2019).
  16. Parsons, K. M., et al. Water everywhere: Environmental DNA can unlock population structure in elusive marine species. R Soc Open Sci. 5 (8), 180537(2018).
  17. Rourke, M. L., et al. Environmental DNA as a tool for assessing fish biomass: A review. Environ DNA. 4 (1), 9-33 (2022).
  18. Sard, N. M., et al. Comparison of fish detections using environmental DNA metabarcoding and traditional gears. Environ DNA. 1 (4), 368-384 (2019).
  19. Sigsgaard, E. E., et al. Population-level inferences from environmental DNA-Current status and future perspectives. Evol Appl. 13 (2), 245-262 (2020).
  20. Afonso, L., et al. Environmental DNA as a complementary tool for biodiversity monitoring. PLoS ONE. 19 (10), e0300992(2024).
  21. Silliman, K., et al. Evaluating prey availability for the Rice's whale based on environmental DNA. Ecol Evol. 16 (1), e72789(2026).
  22. Boyse, E., et al. Environmental DNA reveals fine-scale spatial and temporal variation of marine mammals and prey species. Environ DNA. 6 (4), e587(2024).
  23. Székely, D., Cammen, K. M., Olsen, M. T. Using environmental DNA to study marine mammals in the North Atlantic. NAMMCO Sci Publ. 12, (2021).
  24. Alter, S. E., et al. Using environmental DNA to detect whales and dolphins in the New York Bight. Front Conserv Sci. 3, 820377(2022).
  25. Parsons, K. M., et al. Environmental DNA for monitoring marine mammals: Challenges and opportunities. Front Mar Sci. 9, 987774(2022).
  26. Couton, M., Viard, F., Altermatt, F. Opportunities and inherent limits of using environmental DNA for population genetics. Environ DNA. 5 (5), 1048-1064 (2023).
  27. Leerhøi, F., et al. Exploring the potential of extreme citizen science with Danish high school students using environmental DNA for marine monitoring. Front Mar Sci. 11, 1347298(2024).
  28. Tøttrup, A. P., et al. Citizens in the lab: Performance and validation of eDNA results. Citiz Sci Theory Pract. 6 (1), (2021).
  29. Kelly, R., et al. Citizen science and marine conservation: A global review. Philos Trans R Soc B. 375 (1814), 20190461(2020).
  30. Church, E. K., et al. From citizen science experiences to stewardship action. Mar Policy. 173, 106537(2025).
  31. Barbaccia, E., et al. Combining citizen science, environmental DNA, and whale watching. Ocean Coast Manag. 269, 107827(2025).
  32. Barbaccia, E., et al. Willingness to engage in marine conservation through eDNA-informed citizen science. Sci Rep. 15 (1), 41983(2025).
  33. Broadhurst, H. A., et al. Citizen scientists' motivation to participate in environmental DNA (eDNA) surveys. Citiz Sci Theory Pract. 10 (1), (2025).
  34. O'Connor, S., et al. Whale Watching Worldwide. , Int Fund Anim Welfare. Yarmouth, MA. (2009).
  35. Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels. Front Mar Sci. 8, 704786(2021).
  36. Foote, A. D., et al. Investigating the potential use of environmental DNA (eDNA) for genetic monitoring of marine mammals. PLoS ONE. 7 (8), e41781(2012).
  37. Baker, C. S., et al. Environmental DNA (eDNA) from the wake of the whales. Front Mar Sci. 5, 342201(2018).
  38. Takahashi, M., et al. Aquatic environmental DNA: A review. Sci Total Environ. 873, 162322(2023).
  39. Govindarajan, A. F., et al. Improved biodiversity detection using a large-volume environmental DNA sampler. Deep Sea Res Part I. 189, 103871(2022).
  40. Bessey, C., et al. Maximizing fish detection with environmental DNA metabarcoding. Environ DNA. 2 (4), 493-504 (2020).
  41. Robinson, C. V., et al. DNA from dives: Species detection of humpback whales from flukeprint environmental DNA. Environ DNA. 6 (2), e524(2024).
  42. Rodriguez, L. K., et al. Enhancing environmental DNA sampling efficiency for cetacean detection. Environ DNA. 7 (3), e70103(2025).
  43. Jackman, J. M., et al. Performance of eDNA filtration methods in a hyper-tidal estuary. Environ DNA. 7 (5), e70206(2025).
  44. Majaneva, M., et al. Environmental DNA filtration techniques affect recovered biodiversity. Sci Rep. 8, 4682(2018).
  45. Liu, Q., et al. Optimization of pore size and filter material for better enrichment of environmental DNA. Front Environ Sci. 12, 1422269(2024).
  46. Li, J., et al. Effect of filtration method on environmental DNA capture efficiency. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
  47. Robinson, C. V., et al. Temporal dynamics of flukeprint environmental DNA detection. Environ DNA. 7 (3), e70132(2025).
  48. Székely, D., et al. Environmental DNA captures the genetic diversity of bowhead whales. Environ DNA. 3 (1), 248-260 (2021).
  49. Bruce, K., et al. A practical guide to DNA-based methods for biodiversity assessment. Adv Books. 1, e68634(2021).
  50. Pogner, C. -E., et al. Airborne DNA: State of the art. Sci Total Environ. 957, 177439(2024).
  51. Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for environmental DNA detection. Methods Ecol Evol. 7 (11), 1299-1307 (2016).
  52. Combining environmental DNA sampling, whale watching and citizen science. , eWHALE Project. accessed (2025).
  53. Klotz, L., et al. Annual and monthly fluctuations in humpback whale presence. J Cetacean Res Manag. 16, 9-16 (2017).
  54. Peres dos Santos, R., et al. First humpback whale re-sighting. Polar Biol. 45 (3), 523-527 (2022).
  55. Thalinger, B., et al. Validation scale for environmental DNA assays. Environ DNA. 3 (4), 823-836 (2021).
  56. Hall, T. A. BioEdit. Nucleic Acids Symp Ser. 41, 95-98 (1999).
  57. Benoit, N. P., et al. Using qPCR of environmental DNA to estimate salmon biomass. Environ DNA. 5 (4), 683-696 (2023).
  58. Skovhus, T. L., et al. Real-time quantitative PCR for marine bacteria. Appl Environ Microbiol. 70 (4), 2373-2382 (2004).
  59. Godhe, A., et al. Quantification of diatom and dinoflagellate biomasses. Appl Environ Microbiol. 74 (23), 7174-7182 (2008).
  60. Baudry, T., et al. Influence of distance and seasonality in eDNA detection. Environ DNA. 5 (4), 733-749 (2023).
  61. Hunter, M. E., et al. Detection limits of PCR assays. Mol Ecol Resour. 17 (2), 221-229 (2017).
  62. Lee, J., et al. Species-specific eDNA assay for Ascidiella aspersa. Ecol Evol. 15 (11), e72453(2025).
  63. National Center for Biotechnology Information. BLAST. , accessed (2025).
  64. R Foundation. R. , (2023).
  65. susannat, eDNA sampling protocol: Smith-Root citizen scientist sampler. , protocols.io. (2024).
  66. Thomas, A., et al. Self-preserving eDNA filter. Methods Ecol Evol. 10, 1137-1145 (2019).
  67. Thalinger, B., et al. eDNA shedding of freshwater fish. Front Ecol Evol. 9, 623718(2021).
  68. Hymus, C. [PhD Thesis]. , Murdoch Univ. (2016).
  69. Rodriguez, L. K., Thalinger, B. DNA extraction - Qiagen BioSprint® 96 Workstation using the Biosprint 96 tissue protocol UIBK eWHALE. , protocols.io. (2024).
  70. Valsecchi, E., et al. Universal primers for marine mammals. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
  71. Rota, A., Valsecchi, E. Floating Lab SOP. J Vis Exp. 222, e67366(2025).
  72. Robinson, C. V., et al. Limited cetacean detection by low-volume eDNA. Environ DNA. 5 (6), 1641-1651 (2023).
  73. Pinfield, R., et al. False-negative detections in killer whale presence. Environ DNA. 1 (4), 316-328 (2019).
  74. Strickler, K. M., et al. eDNA degradation. Biol Conserv. 183, 85-92 (2015).
  75. Rishan, S. T., et al. Applications of eDNA metabarcoding. Environ Adv. 12, 100370(2023).
  76. Schrader, C., et al. PCR inhibitors. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  77. Thomsen, P. F., et al. Detection of marine fish fauna. PLoS ONE. 7 (8), e41732(2012).
  78. Guri, G., et al. Detection sensitivity of qPCR and ddPCR. Ecol Evol. 14 (12), e70678(2024).
  79. Andruszkiewicz, E. A., et al. Persistence of marine fish eDNA. PLoS ONE. 12 (9), e0185043(2017).
  80. Venegas, V., Halberg, M. C. mtDNA copy number. Methods Mol Biol. 837, 327-335 (2012).
  81. Naue, J., et al. mtDNA copy number variation. Mitochondrion. 74, 101823(2024).
  82. Andreu, A. L., et al. mtDNA copy number. Mitochondrion. 9 (4), 242-246 (2009).
  83. Langlois, V. S., et al. Robust qPCR-based eDNA assays. Environ DNA. 3 (3), 519-527 (2021).
  84. Barnes, M. A., Turner, C. R. Ecology of environmental DNA. Conserv Genet. 17, 1-17 (2016).
  85. Mathieu, C., et al. Variability in eDNA data. Front Ecol Evol. 8, 466868(2020).
  86. Wilson, C. C., et al. Synthetic controls for eDNA. Methods Ecol Evol. 7 (1), 23-29 (2016).
  87. Lux, M. W., et al. Reproducibility in synthetic biology. Synth Biol. 8 (1), ysad014(2023).
  88. Sepulveda, A. J., et al. Contamination in eDNA studies. Front Ecol Evol. 8, 609973(2020).
  89. Minamoto, T., et al. An illustrated manual for environmental DNA research. Environ DNA. 3 (1), 8-13 (2021).
  90. Barnes, M. A., et al. Environmental conditions influence eDNA persistence. Environ Sci Technol. 48 (3), 1819-1827 (2014).
  91. Oka, S. I., et al. Gravity filtration of eDNA. MethodsX. 9, 101838(2022).
  92. Berran, M. S., et al. eDNA sampling strategies. Hydrobiologia. 852, 3485-3501 (2025).
  93. Esri. ArcGIS Survey123. , (2025).
  94. Ralson, M. J., et al. Translating eDNA into conservation action. Conserv Sci Pract. 7 (2), e70000(2025).
  95. Dela Cruz-Modino, R., Cosentino, M. Whale-watching industry value. Sustainability. 14 (20), 13471(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

pobieranie pr bek eDNApobieranie materia u Flukeprintfiltracja na pok adzieanalizy molekularneilo ciowa PCRmitochondrialne DNAr norodno biologiczna rodowiska morskiego

Powiązane artykuły