Protokół chirurgiczny dla dużego, zamykalnego okna czaszkowego umożliwiającego podłużne, wielomodalne rejestrowanie elektrofizjologii sieci domyślnej myszy

Podsumowanie

Protokół ten opisuje dwufazową metodę chirurgiczną mającą na celu stworzenie dużego, ponownie zamykalnego, oszczędzającego dura okno czaszkowe u myszy. Technika ta umożliwia przewlekłe, wielomodalne zapisy elektrofizjologiczne z rozproszonych, głębokich sieci mózgowych, takich jak Sieć Trybu Domyślnego, przez kilka tygodni.

Streszczenie

Domyślna sieć trybu (DMN) to centralna, szeroko skalowa sieć mózgowa powiązana z różnymi funkcjami poznawczymi i zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, takimi jak ciężka depresja (MDD). Badanie złożonej dynamiki DMN w modelach zwierzęcych dostarcza bezcennych informacji na temat jego funkcji zarówno w stanie zdrowym, jak i patologicznym. Jednak przeprowadzanie stabilnych, długoterminowych, wielkoskalowych rejestracji elektrofizjologicznych z wielu głębokich i rozproszonych węzłów DMN będących w stanie czujnym, zachowającym się myszom pozostaje poważnym wyzwaniem.

Tutaj przedstawiono nowatorski protokół chirurgii dwufazowej, mający na celu stworzenie dużego (4 mm × 7,6 mm), trwałego i zamykalnego okna czaszkowego u myszy. Zabieg został zaprojektowany tak, aby zachować integralność mięśnia twardego, co jest kluczowe dla długoterminowego zdrowia mózgu i stabilności zapisu.

To okno umożliwia jednoczesne, powtarzalne, podłużne nagrania z ponad 1000 elektrod poprzez połączenie mikroelektrokortykografii powierzchniowej (μECoG) z dwoma wysokogęstymi sondami elektrod wewnątrzczaszkowymi, zapewniając bezprecedensowy dostęp do DMN. Technika ta zapewnia solidną platformę do wielomodalnych, wieloskalowych badań dynamiki elektrofizjologicznej sieci przez kilka tygodni, otwierając nowe możliwości badania neuroplastycznych zmian leżących u podstaw patofizjologii zaburzeń mózgu oraz oceny przewlekłych efektów nowych terapii.

Wprowadzenie

Sieć trybu domyślnego (DMN) została po raz pierwszy zidentyfikowana w badaniach obrazowania mózgu człowieka jako konstelacja obszarów konsekwentnie tłumionych podczas zadań zorientowanych na zewnątrz, wymagających uwagi:¹. Obecnie uważa się ją za fundamentalną, dużą sieć wspierającą wewnętrznie zorientowane procesy poznawcze, takie jak myślenie autoreferencyjne, pamięć autobiograficzna oraz planowanie przyszłych wydarzeń ^2,3. U ludzi kanoniczny DMN składa się z zestawu anatomicznie połączonych regionów rdzenia, w tym przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC), tylnej kory obręczowej (PCC), dolnego płata ciemieniowego (IPL) oraz formacji hipokampa⁴. Dysfunkcja w tej sieci jest kluczową cechą kilku zaburzeń neuropsychiatrycznych. W dużej depresji (MDD) DMN często wykazuje nadpobudliwość i zmienione wzorce łączności funkcjonalnej, które uważa się za podstawę podstawowych objawów MDD, takich jak ruminacja i negatywny obraz siebie ^5,6.

Aby badać mechanizmy komórkowe i obwodowe powodujące dysfunkcję DMN, niezbędne są solidne modele zwierzęce. Homologiczne DMN zostało wiarygodnie zidentyfikowane u gryzoni, obejmujące porównywalne obszary mózgu, takie jak mPFC, kora obręczowa i kora retrosplenialna (RSP), co potwierdza mysz jako model translacyjnie istotny dla badań mechanistycznych ^7,8. Ponadto wykazano, że przewlekły stres, kluczowy czynnik depresji, wpływa na łączność DMN u gryzoni w sposób podobny do obserwowanego u pacjentów z MDD⁹.

Zrozumienie zmian neuroplastycznych zachodzących w stanach chorobowych lub w odpowiedzi na przewlekłe interwencje terapeutyczne wymaga podłużnej obserwacji aktywności nerwowej, ponieważ jedna sesja nagraniowa nie jest w stanie uchwycić dynamicznej adaptacji obwodów nerwowych w czasie¹⁰. Elektrofizjologia in vivo zapewnia rozdzielczość czasową w skali milisekundowej niezbędną do badania oscylacji nerwowych i synchronii w lokalnym potencjale pola (LFP). LFP wykazuje zsumowany sygnał zewnątrzkomórkowy odzwierciedlający zsynchronizowaną aktywność synaptyczną lokalnych populacji neuronalnych, które są podstawowymi substratami komunikacji sieciowej^11,12. Jednak przeprowadzanie przewlekłych, wielkoskalowych rejestracji elektrofizjologicznych u czujnych myszy pozostaje technicznie wymagające. Konwencjonalne przewlekłe okna czaszkowe zostały opracowane do obrazowania optycznego u myszy czującej i pozostają standardowym przygotowaniem do tego celu, gdzie ich typowy odcisk na jednej półkuli i przezroczysta szklana pokrywa są optymalne dla zamierzonego odczytu¹³. Nie zostały jednak zaprojektowane do budzowej, wielomiejscowej elektrofizjologii, więc obszar roboczy i interfejs optyczny uniemożliwiają jednoczesne nagrywanie wysokiej gęstości z rozproszonych dwustronnych węzłów sieci takiej jak DMN¹⁴. Przewlekłe implanty elektrod umożliwiają podłużne nagrania, ale powodują stopniowe otoczenie ciałem obcym i bliznowactwo gleja wokół trzonka trzonka, co z czasem obniża jakość sygnału^15,16.

Dwufazowy zabieg chirurgiczny opisany tutaj bezpośrednio odpowiada na te ograniczenia. Tworzy duże, zamykalne okno czaszkowe zamykane między sesjami pasywną membraną polidimetylosiloksanową (PDMS), silikonowym uszczelniaczem oraz 3D drukowaną pokrywką umożliwiającą powtarzane niekońcowe wstawianie siatek μECoG do mezoskalowych rejestracji LFP wraz z wieloma wysokogęstymi elektrodami wewnątrzczaszkowymi dla mikroskalowej, laminarnie rozdzielczej jednojednostkowej i LFP aktywności^17,18. W przeciwieństwie do wcześniejszych metod przewlekłych, które polegały albo na trwale wszczepionych matrycach elektrod kumulujących z czasem otoczkę glejową, albo wymagały końcowych ostrych kraniotomii, które uniemożliwiają projekty podłużne, opisane tutaj okno zachowuje nienaruszoną oponę i unika stałego kontaktu ciał obcych 15,16,18. Ponadto w kohorcie walidacyjnej, w której okno czaszkowe było otwierane trzykrotnie (dni pooperacyjne 0, 21, 22) bez rejestracji elektrofizjologicznej, ilościowa immunoreaktywność białka włóknistego glia (GFAP) i jonizowanej cząsteczki adaptera wapnia 1 (IBA1) nie różniła się istotnie od kontroli niechirurgicznej, co sugeruje niską astrogliozę i mikrogliozę w ramach powtarzającego się rozkładu otwierania użytego tutaj. Metoda ta jest szczególnie odpowiednia do podłużnych, wielomiejscowych rejestracji rozproszonych sieci korowych, w tym DMN, w połączeniu z laminarnym, wysokogęstym intraczaszkowym elektrodowym dostępem do głębokich struktur u myszy z głową zamocowanymi na jawie. Główne ograniczenia operacyjne to wiedza mikrochirurgiczna wymagana do niezawodnego usuwania płatów kości z oszczędzaniem twardości oraz niekompatybilność z wolno poruszającymi się nagraniami, ponieważ sondy elektrod wewnątrzczaszkowe o wysokiej gęstości wymagają fiksacji głowy.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez krajową Radę ds. Eksperymentów na Zwierzętach w Finlandii (numer licencji: ESACI/40845/2022), a eksperymenty przeprowadzono zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE Parlamentu Europejskiego dotyczącą ochrony wykorzystania zwierząt w celach naukowych oraz krajowymi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

UWAGA: Wszystkie zabiegi chirurgiczne wykonywane są wewnątrz laminarnego kaptura chirurgicznego, który został wcześniej sterylizowany przez promieniowanie ultrafioletowe (minimum 15 min) lub przez dokładną dekontaminację powierzchni etanolem. Spaliny izofluranowe są wychwytywane przez system oczyszczania węgla aktywnego zamontowany wewnątrz maski. Operator nosi jednorazową opaskę na włosy, chirurgiczną maseczkę na twarz, długi fartuch laboratoryjny oraz jednowarstwowe niesterylne rękawice do badania nitrylu (spryskane 80% etanolem przed wejściem do kaptura). W kapturze umieszcza się pojemnik na utylizację ostrych przedmiotów, aby natychmiast pozbyć się ostrzy skalpelowych i igieł do strzyki.

1. Przygotowanie przedoperacyjne i znieczulenie

1. Używaj myszy C57BL/6JRj, które mają co najmniej 10 tygodni i ważą ponad 20 g.
2. Przed operacją oczyść wszystkie instrumenty w ciepłej kąpieli ultradźwiękowej. Płucz, susz i mocz w 70% etanolu przez minimum 15 minut.
3. Alternatywnie, sterylizuj instrumenty, przechodząc przez krótką przejściową przez szklaną kulkę lub sterylizator na podczerwień tuż przed użyciem. Sterylne zasłony nie są używane. Między kolejnymi zwierzętami w tej samej sesji należy przywrócić instrumenty do moczenia w etanolu na co najmniej 2 minuty^{i 19}.
4. Waż każdą mysz indywidualnie na skalibrowanej wadze i obliczaj objętości leków przedoperacyjnych.
5. Przygotuj sterylne błony PDMS z wyprzedzeniem (wykonywane raz na partię, poza ostrym dniem operacji).
   1. Odlewaj sterylne membrany PDMS z mieszaniny elastomeru 10:1 z substancją utwardzającą preparat przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta i arkusz o docelowej grubości około 500 μm, wsadzając nieutwardzoną mieszankę między dwie płaskie płytki borokrzemowego szkła, a następnie utwardzaj w 60 °C przez co najmniej 2 godziny.
   2. Uszczelnij utwardzone arkusze w woreczkach autoklawowych i sterylizuj przez autoklaw parowy. W przedsterylizowanym okapu chirurgicznym użyj sterylnego skalpela #11 i małej linijki ze stali nierdzewnej, aby wyciąć każdy arkusz na prostokątne błony dopasowane do wymiarów okna czaszki.
   3. Przechowuj wcześniej przecięte błony w sterylnych naczyniach laboratoryjnych (np. pojedynczych dołkach na 6-dołkowej płytce hodowli komórek) do czasu użycia.
6. Przed każdą sesją nagraniową wykonuj kontrolę jakości sprzętu.
   UWAGA: Na macierzy μECoG nie wykonuje się rutynowej kontroli impedancji: usterki przewodu referencyjnego są łatwo widoczne na surowych ścieżkach, a testowanie impedancji jest wykonywane tylko wtedy, gdy podejrzewa się problem sprzętowy. Sondy elektrod wewnątrzczaszkowe o wysokiej gęstości zawierają wbudowaną diagnostykę impedancji i integralności kabli, dostępną za pomocą graficznego interfejsu użytkownika oprogramowania do nagrywania; uruchamiaj je, gdy jakość sygnału jest wyraźnie pogorszyona.

2. Faza 1: Przygotowanie zwierząt i implantacja płyty głowowej

1. Przygotowanie zwierząt
   1. Znieczulenie myszy izofluranem (indukcja: 4%, utrzymanie: 1,5−2,5%, przepływ tlenu 0,5 L/min). Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez utratę odruchu zaciskania palców.
   2. Ogol futro od czubka głowy, mniej więcej od oczu do szyi.
   3. Umieść zwierzę na termoforze sterowanej sprzężeniem zwrotnym, wyposażonej w wewnętrzny czujnik temperatury skalibrowany do utrzymania temperatury ciała na poziomie 37 °C przez cały zabieg. Stosuj maść karbomerową do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
   4. Zabezpiecz mysz w stereotaktycznej ramie za pomocą niepękniętych nauszników. Ustaw siekacz tak, aby czaszka leżała płasko, a bregma i lambda na równej wysokości grzbietowej (orientacja płaska czaszki). Utrzymuj znieczulenie izofluranem (1,5–2,5%) podanym przez stożek nosowy z przepływem tlenu 0,5 L/min.
   5. Podawaj przedoperacyjne leki przeciwzapalne i leki przeciwzapalne w formie podskórnych (s.c.), karprofen (5 mg/kg), buprenorfina (0,05 mg/kg) oraz deksametazon (2 mg/kg).
   6. Dezynfekuj ogolone miejsce roztworem povidonu jodowego.
   7. Wstrzyknij roztwór lidokainy i epinefryny (s.c.) jako miejscowe znieczulenie pod skórę głowy.
2. Ekspozycja czaszki
   1. Wykonaj małe nacięcie poprzeczne na linii ucha (około 1 cm).
   2. Stopniowo powiększaj nacięcie, rozszerzając ranę bocznie wokół uszu i wzdłuż obu stron głowy w kierunku oczu, ale nie przekraczaj cięcia do oczu. Zakończ naświetlanie, wykonując przekątne cięcie z każdej strony w kierunku linii środkowej, tak aby cała powierzchnia czaszki grzbietowej była odsłonięta.
3. Czyszczenie czaszki
   1. Dokładnie oczyść odsłoniętą czaszkę laboratoryjnym acetonem. Zanurz sterylny waciczek w acetonie, usuń nadmiar rozpuszczalnika (zapobiegając kapaniu na sąsiednią tkankę) i nakładaj na kość, aż cała widoczna okostka zostanie usunięta.
   2. Używaj acetonu ze względu na jego zdolność do rozpuszczania pozostałości tłuszczowych i trwałych błoniastych pozostałości na powierzchni kości, a nie jako środek dezynfekujący.
      UWAGA: Całkowite usunięcie okostnej i pozostałości lipidowych z powierzchni kości jest kluczowe dla silnej przyczepności płyty głowowej i cementu dentystycznego. Ponieważ implant musi wytrzymać mechaniczne naprężenia generowane przez mysz przytomną, wszelkie pozostałości w okostnym lub lipidowym warstwie na styku kleju kostnego stają się dominującym punktem awarii.
   3. Użyj tępego mikrochirurgicznego (okrągłego) ostrza skalpela, aby usunąć wszelkie pozostałości odłamków okołokostnej i tkanki łącznej, których płukanie acetonowe nie rozpuściło w pełni. Trzymaj ją pod kątem około 45° do powierzchni kości i delikatnymi, promieniowymi pociągnięciami skierowanymi na zewnątrz od połączenia bregma z linią środkową w kierunku bocznych krawędzi odsłoniętej kości.
   4. Kontynuuj, aż cała odsłonięta powierzchnia kości zostanie przejrzona przynajmniej raz i będzie wyglądać równomiernie czysta i matowa.
   5. Zakończ ostatnim krótkim czyszczeniem acetonem na aplikatorze z bawełnianym końcówką.
4. Oznaczanie miejsca kraniotomii
   1. Przyłącz biokompatybilny marker skóry chirurgicznej do cyfrowego ramienia stereotaktycznego.
   2. Zaznacz na czaszce prostokątny obszar o wymiarach 4 mm × 7,6 mm względem bregmy.
      1. Przesuń końcówkę markera do bregmy i zresetuj współrzędne X i Y na cyfrowym odczytie do zera.
      2. Przesuń ramię na każdy z czterech rogów planowanego okna, tak aby prostokąt wychodził 2 mm bocznie od bregmy po obu stronach, 3 mm rostralnie i 4,6 mm kaudalnie, i umieść pojedynczą kropkę w każdym rogu.
5. Zaznacz dwa miejsca wszczepienia sondy wewnątrzczaszkowej na prawej półkuli.
   1. Oznacz miejsce sondy rostralnej na 1,66 mm A/P i 1,95 mm M/L od bregmy.
   2. Oznacz miejsce sondy ogonowej na -2,2 mm A/P i 1,9 mm M/L od bregmy.
      UWAGA: Te miejsca są dostosowane do regionów specyficznych dla DMN. Miejsca inserwacji można dostosować do różnych regionów za pomocą tego protokołu.
   3. Odłącz marker od ramienia stereotaktycznego.
   4. Przyłóż sterylizowaną, elastyczną prostą krawędź (np. cienką plastikową kartę) do czaszki i połącz cztery narożne kropki markerem, aby obrysować przyszłe okno czaszki jako ciągły prostokąt.
6. Zwiększenie powierzchni dla lepszej przyczepności
   1. Wykonaj wszystkie następujące kroki aż do sekcji 4 pod mikroskopem obuocznym.
   2. Wyryj wzór krzyżujący się na wszystkich odsłoniętych powierzchniach kości poza wyznaczonym obszarem okna za pomocą ostrza chirurgicznego #11 i uzyskaj płytkie, ale wyraźne rowki o głębokości 0,2–0,4 mm, tworząc jednolitą siatkę o wymiarach około 1 mm × 1 mm kwadratów.
      UWAGA: To zwiększy efektywną powierzchnię, a tym samym mechaniczną przyczepność nakładającego się kleju i cementu dentystycznego.
   3. Stwórz aplikator do cienkiego kleju, przykucając sterylną igłę 30 G do końcówki patyczka wacikowego z długą szyjką i wyginając igłę w kształt litery V.
   4. Rozsyp klej cyjanoakrylanowy do jednorazowej plastikowej wagi i zanurz aplikator w zbiorniku kleju.
   5. Nakładaj klej na każdą odsłoniętą i wygrawerowaną powierzchnię kości, nakładając nie więcej niż jeden osad na miejsce, aby pokrycie było dokładne, ale nigdy nie przesadzone. Pozwól klejowi wyschnąć przez 7 minut.
7. Implantacja gniazda referencyjnego
   1. Wybierz miejsce wiercenia nad lewym móżdżkiem, tak aby uniknąć widocznych naczyń powierzchownych.
   2. Zamontuj wiertarkę dentystyczną na uchwytie wiertła w ramieniu stereotaktycznym.
   3. Wierć otwór pilotowy w seriach 5–10 sekund, używając okrągłego stalowego głufu przy prędkości 20 000–25 000 obr./min, chując wiertło między wybuchami, aby obejrzeć miejsce pod lornetką.
   4. Wiercisz, aż otwór stanie się bardziej przezroczysty, odsłaniając jasnoróżowy odcień, a opona twarda stanie się widoczna przez przerzedzoną kość.
   5. Natychmiast przestań wiercić, aby uniknąć penetracji oponów. Rozmiar wykończonego otworu do średnicy około 0,5 mm, co jest tylko nieznacznie większe niż zewnętrzna średnica gniazda referencyjnego.
   6. Włóż pozłacane gniazdo referencyjne do otworu pilotowego, zabezpiecz je klejem cyjanoakrylanowym i wzmocnij złącze cementem dentystycznym utwardzającym promieniowanie UV. Utwardzaj cement dentystyczny lampką LED o promieniowaniu 405 nm przez 1 minutę.
8. Implantacja płyty głowicy
   1. Na wierzchołek odsłoniętej kości rostralnej (punkt najbliżej nosa) nałóż niewielką ilość cementu dentystycznego utwardzającego UV, aby służyć jako wsparcie wyrównujące.
   2. Połóż płytę głowy na czaszce tak, aby jedna krawędź spoczywała na rusztowaniu cementowym utwardzonym wokół gniazda referencyjnego (krok 2.7.6), a przeciwległa krawędź spoczywała na świeżym dabcie rostralnego cementu.
   3. Wyrównaj płytkę głowy tak, aby jej długa oś była wyśrodkowana na linii środkowej strzałku, a dwie uchwyty fiksacyjne wydłużały się prostopadle (90°) do osi środkowej. Utwardz kompozyt pod światłem UV, aby zablokować główkę na miejscu.
   4. Wzmocnić strukturę, nakładając kolejne warstwy cementu dentystycznego o grubości około 1 mm, osadzone wokół podstawy płytki głowy, otaczające wygrawerowaną kość i gniazdo odniesienia, aż wokół obwodu przyszłego okna czaszki powstanie ciągłe, szczelne obudowanie.
   5. Każdy przyrostek utwardzaj osobno piórem LED o średnicy 405 nm przez 40 sekund w odległości roboczej 1–2 cm, zapewniając pełną polimeryzację przed nałożeniem kolejnej warstwy. Upewnij się, że gotowa ściana betonowa wysuwa się równo z górną powierzchnią płyty główkowej i całkowicie otacza obwód odsłoniętej kości, nie nakładając się na zaznaczoną powierzchnię okna.
9. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu. Wróć mysz do jej klatki domowej na co najmniej 48 godzin.
10. Przed przejściem do sekcji 3 sprawdź, czy zwierzę wróciło do 5% swojej przedoperacyjnej masy ciała i nie wykazuje oznak bólu na skali grymasu^{myszy 20}. Jeśli któreś z tych kryteriów nie zostanie spełnione, przedłuż okres rekonwalescencji aż do ich spełnienia.
    UWAGA: Ten etapowy projekt z interwalecznym okresem rekonwalescencji jest kluczowy. Pozwala zwierzęciu na regenerację po początkowym stresie fizjologicznym i stanie zapalnym przed kraniotomią, co stwierdzono jako poprawiające skuteczność operacji oraz długoterminowe zdrowie implantu; Stosuje się tu minimum 48 godzin, a stopniowy implant czaszki z kilkudniowym okresem rekonwalescencji między fiksacją płyty głowowej a kraniotomią wykazuje zmniejszenie stanu zapalnego okołooperacyjnego i poprawę jakości preparatu długoterminowego¹⁴.

3. Faza 2: Przewlekłe tworzenie okien czaszkowych

1. Przygotowanie przedoperacyjne
   1. Przygotuj obszar operacyjny i narzędzia zgodnie z rozdziorem 1.
   2. Ponowne znieczulenie myszy izofluranem (indukcja 4%, utrzymanie 1,5–2,5%)
   3. Umieść mysz w stereotaktycznej ramce, jak opisano w kroku 2.1.4.
   4. Podawaj leki przedoperacyjne w tych samych dawkach opisanych w kroku 2.1, z wyjątkiem miejscowego znieczulenia lidokainowo-epinefrynowego (skóra głowy została już usunięta w fazie A, więc nie jest już stosowalny).
2. Wiercenie okna
   1. Zacznij przerzedzać kość wiertarką dentystyczną wzdłuż konturu prostokąta zaznaczonego w Fazie 1 (krok 2.4). Zacznij od 25 000 obr./min, trzymając urządzenie wiertnicze prostopadle (≈ 90°) do powierzchni kości, i wykonaj jedno lub dwa nieco głębsze przejścia wzdłuż krawędzi prostokąta, aby utworzyć początkowy rowek tnący.
      UWAGA: Prędkość startu wiertła może być dostosowana do poziomu doświadczenia operatora.
   2. Wiercę rowki (około 0,2–0,3 mm) w kości i cement dentystyczny sąsiadujący z oknem czaszki na dwóch współrzędnych wszczepienia sondy zaznaczonych w kroku 2.5.
      UWAGA: Te rowki pełnią rolę trwałych punktów wizualnych, które pozostają widoczne po usunięciu płata kostnego i służą do powtarzalnego przesuwania sond wewnątrzczaszkowych podczas kolejnych sesji elektrofizjologicznych.
   3. Regularnie stosuj lodowato zimny, sterylny sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF; przygotowany według receptury zawierającej cefazolinę Goldey i ^in.14) podczas wiercenia, aby zapobiec uszkodzeniom termicznym kory leżącej pod spodem i zminimalizować krwawienie¹⁴.
   4. Stopniowo zmniejszaj prędkość wiertarki do 20 000 obr./min wraz z przerzedzeniem kości i pochylaj rękojeść o ≈ 45°, co pozwala operatorowi ustabilizować wiertarkę przy dłoni i przejść do łagodniejszych, bardziej kontrolowanych ruchów.
3. Usunięcie płata kostnego (krok krytyczny)
   1. Wiercę wzdłuż obwodu prostokąta, aż kość w obrycie będzie mniej więcej w 90% przerzedzona. Nie wierć całkowicie przez czaszkę.
   2. Potwierdź pozostałą grubość kości za pomocą dwóch uzupełniających się kontroli:
      1. Pod mikroskopem binokularnym delikatnie stuknij tępym narzędziem w krawędź przecienkłej kości. Wielkość odchylenia wywołanego przez lekki stuknięty daje bezpośrednią wskazówkę o pozostałej grubości kości.
      2. Nałóż lodowato zimny ACSF na wywiercone okno i natychmiast sprawdź przez lornetkę: przez pierwsze 20–30 sekund, zanim ACSF przeniknie kość, warstwa płynu wyraźnie zwiększa kontrast wzrokowy, rozwiązując podskórne kapilary korowe tam, gdzie kość została przerzedzona blisko opony twardej, podczas gdy obszary o pozostałej grubości pozostają stosunkowo nieprzezroczyste pod płynem. Gdy płat będzie wyglądał na jednolity przezroczysty i wyraźnie elastyczny, przejdź do kroku 3.3.3.
   3. Przełącz się na cienko zakrzywiony haczyk dura, który kończy się końcówką zgiętą o 90°. Należy włożyć końcówkę pod krawędź przerzedzonej kości z dużą ostrożnością pod kątem około 15° względem powierzchni kości i przesunąć hak wzdłuż obwodu okna, ostrożnie odłączając płat kostny od otaczającej czaszki i tkanki pod spodem.
   4. Pracuj stopniowo od jednego narożnika do drugiego wzdłuż bocznych boków po obu stronach, a następnie przesuwaj się od narożników w kierunku środka prostokąta, aż cały obwód zostanie oddzielony od podłoża twardego.
   5. Nie wywieraj nacisku w dół na haczyk dura podczas ślizgania się i unikaj dotykania mózgu.
      UWAGA: Naprzemienne ustawianie narożników diagonalnie przeciwległych pod małym kątem haczyka równomiernie rozkłada naprężenia mechaniczne wokół płata kostnego. Ta strategia zapobiega pęknięciom oponowymi i chroni długoterminowe zdrowie tkanki mózgowej.
   6. Nie wymuszaj żadnego ruchu, jeśli hak napotka opór ogniskowy w którymkolwiek rogu. Zamiast tego opuść płat i wrócić do kroku 3,4, aby jeszcze bardziej przerzedzić obszar przylegający.
      1. Jeśli dojdzie do zerwania rdzenia twardowego, przerwij zabieg dla tego zwierzęcia (rozpoznany po nagłym ogniskowym wybrzuszeniu, różowym przecieku płynu lub jasnoczerwonym krwawieniu tętniczym, które nie ustępuje po trzykrotnym zalaniu płytki głowy lodowatym ACSF, pozwalając każdej płukani na 30 sekund).
         UWAGA: Udane odwarstwienie oznacza jednolitostajna ruchomość płata kostnego wzdłuż całego obwodu, bez widocznego wypuklenia oponowego, a jedynie niewielkie krwawienie z naczyń włosowatych.
   7. Delikatnie unieś skutecznie odłączony płat kostny haczykiem na oponę twardą w kierunku od tyłu do przodu, około 35° nad powierzchnią czaszki.
   8. Chwyć uniesioną krawędź kleszczami i delikatnie kołysz w lewo i prawo, aż płytka całkowicie się uwolni. Jeśli płytka opiera się w którymkolwiek rogu, opuść ją z powrotem na miejsce i wrócić do kroku 3.3.4, aby przerzedzić przylegający obszar przed ponownym zdejmowaniem; Taki opór wskazuje na lokalnie niedoprzerzedzony fragment kości.
   9. Delikatnie usuwaj odsłonięty obszar z zakrzepłej krwi powtarzającymi się płukaniami lodowatego ACSF.
   10. Sprawdź, czy opona jest nienaruszona i przezroczysta, zanim zaczniesz kontynuować.
       UWAGA: Powolne, stopniowe podnoszenie od tylnej krawędzi jest niezbędne, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia zatok strzałkowych górnej i poprzecznych żyłnych oraz powierzchni kory.
4. Uszczelnianie okna czaszkowego
   1. Po ustąpieniu krwawienia należy założyć pojedynczą, sterylną, prefabrykowaną błonę PDMS (przygotowaną w sekcji 1) bezpośrednio na powierzchnię oponówki. Przy odpowiednim rozmiarze dokładnie zakrywa okno i pasywnie przylega do twardej oponu, trzymając ją płasko przy mózgu.
   2. Wchłanij resztki ACSF z obwodu okna za pomocą niewłóknistej ściereczki.
      UWAGA: Chusteczka nigdy nie może mieć kontaktu z odsłoniętą oponą twardą, a przez cały czas należy stosować ścisłą technikę aseptyczną (sterylny operator, narzędzia i pole), ponieważ okno jest wielokrotnie otwierane, a wszelkie zanieczyszczenia wprowadzone na tym etapie mogą zagrozić kolejnym zapisom podłużnym.
   3. Przygotuj dwuskładnikowy silikonowy uszczelniacz zgodnie z instrukcjami producenta i nałóż mieszany elastomer w ciągu 30 sekund od dozowania, aby wypełnić każdą szczelinę między obudową z cementu dentalnego a wewnętrzną krawędzią płyty głowicowej, całkowicie otaczając i nakładając na krawędzie membrany PDMS.
   4. Pozwól elastomerowi utwardzić się przez około 2 minuty (lub czas określony przez producenta). Upewnij się, że utwardzone uszczelnienie jest ciągłe, szczelne i szczelne, a jednocześnie mechanicznie odbierane na początku każdej sesji nagraniowej.
   5. Przyklej na główkę specjalnie wydrukowaną 3D ochronną nakrętkę z niewielką ilością kleju cyjanoakrylowego, aby chronić okno między sesjami nagraniowymi.
   6. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu i schowaj ją do własnej klatki na indywidualne miejsce, aby zapobiec uszkodzeniu implantu.

4. Opieka pooperacyjna i habituacja

1. Uważnie monitoruj stan zdrowia myszy przez co najmniej 2 dni po operacji. Dodatkowe leki przeciwbólowe (s.c.) podaj przez 2 dni po operacji, jeśli mysz wykazuje objawy bólu na podstawie skali grymasu²⁰.
2. Pozwól myszy spokojnie się zregenerować przez co najmniej 4 dni po operacji. Następnie rozpocznij 5-dniowy okres przyzwyczajenia o stopniowo wydłużającym się trwaniu: 5 minut w dniu 1, a następnie 15, 30, 45 i 60 minut odpowiednio w dniach 2, 3, 4 i 5, aby przyzwyczaić mysz do obsługi i platformy do nagrywania fiksacji głowy.
   UWAGA: Obrzęk tkanek po czaszce i miejscowy stan zapalny mogą utrzymywać się do dwóch tygodni²¹ roku. Jeśli pozwala na to harmonogram eksperymentalny, zaleca się wydłużony okres rekonwalescencji przed pierwszą sesją nagraniową. Przed pierwszą sesją nagrania sprawdź, czy okno czaszkowe jest czyste i wolne od nieprzezroczystości lub tkanki włóknistej pod mikroskopem obuocznym oraz czy waga i zachowanie zwierzęcia są prawidłowe.

5. Procedura podłużnych rejestracji elektrofizjologicznych

1. Umieszczenie zwierzęcia na platformie nagraniowej
   1. Połóż mysz na platformie nagrywającej i prowadź zaciski mocujące głowicę myszy. Upewnij się, że wysokość została wcześniej dostosowana, aby zachować naturalną postawę podczas fiksacji głowy.
      UWAGA: Jeśli mysz uporczywie opiera się fiksacji głowy, nie wymuszaj tego zabiegu. Wróć zwierzę do jego domowej klatki i przedłuż fazę przyzwyczajenia (sekcja 4) o jedną lub dwie sesje przed ponowną próbą stabilizacji.
   2. Dokręć śruby blokujące zacisku.
   3. Bezpośrednio przed użyciem namoczyć tępy mikrochirurgiczny okrągły ostrz w 80% etanolu.
   4. Włóż ostrze między wydrukowaną 3D nakrętkę a górną powierzchnią główki, utrzymując ostrze niemal równolegle do powierzchni główki. Nigdy nie wysuwaj ostrza poza wewnętrzną krawędź otworu płyty głowicowej, aby uniknąć kontaktu z mózgiem.
      UWAGA: Nasadka jest celowo drukowana z przezroczystej żywicy, aby głębokość ostrza pozostała widoczna na całym ekranie.
   5. Przesuwaj się wokół pokrywki delikatnymi ruchami lewo-prawo, które stopniowo rozcinają warstwę kleju.
   6. Użyj cienkiego kleszczy do podłączenia nakrętki i wyrzuć ją, gdy zostanie całkowicie zwolniona.
   7. Chwyć zewnętrzną krawędź uszczelnienia elastomeru krzemowego i powoli podnieś ją od strony ogonoweje w stronę rostralną. Uszczelnienie elastomerowe i leżąca pod nią błona PDMS odłączają się jako jedna całość, odsłaniając nienaruszoną oponę twardą.
   8. Utrzymuj mózg wilgotny, stosując kilka kropel ACSF.
2. Rozmieszczenie urządzeń rejestrujących
   1. Zamontuj macierz μECoG na ramieniu przegubowym z podstawą magnetyczną; Regulacja pokrętła tarcia ramienia należy dostosować do doświadczenia operatora, przy czym doświadczeni operatorzy preferują ustawienie o niskim tarciu, które zachowuje precyzyjną kontrolę motoryczną podczas pozycjonowania.
   2. Prowadź matrycę tak, aby jej powierzchnia elektrody lądowała prostopadle (90°) do powierzchni kory wzdłuż prawej krawędzi okna czaszki; Gdy zostanie odpowiednio ustawione, dokręć pokrętło tarcia, aby przymocować ramię.
   3. Użyj narzędzia do precyzyjnego silikonowego przechylania, aby delikatnie stuknąć płaskim kablem wstęgowym matrycy w dół na górną powierzchnię główki, tak aby kabel zatrzasnął się w konformację z płytą główkową, a sama matryca osiadła płasko na oponie twardej, gdzie pozostałe ACSF zapewnia pasywną przyczepność. Ponieważ okno czaszkowe jest wymiarowane tak, aby pomieścić dwusiatkową tablicę podsiatek w jednej orientacji, grube wyrównanie jest łatwo wykrywalne.
   4. Wykonaj ostateczne drobne korekty narzędziem silikonowym, przesuwając matrycę na boki, aż linia środkowa strzałkowa będzie wyraźnie wyśrodkowana w półprzezroczystej macierzy.
      UWAGA: Przezroczysta siatka μECoG odsłania zatokę strzałkową jako jednoznaczny wskazówkę anatomiczną, widoczną przez matrycję, umożliwiając reprodukcję tego samego bocznego przesunięcia w sesjach podłużnych. Układ jest ustawiony tak, aby obejmować przednią korę obręczową (ACC) obustronnie w części rostralnej oraz korę retrosplenialną (RSP) obie strony w połowie ogonowej, obejmując węzły DMN objęte tym badaniem. Pakiet analityczny open source (ephy_spatial_fidelity-toolkit, dostępny w https://github.com/RazBalin/ephy_spatial_fidelity-toolkit) ilościowo określa dryf między sesjami w siatce na podstawie zachowawczych nagrań.
   5. Podłącz przewód referencyjny μECoG do pozłacanego gniazda referencyjnego wszczepionego w kroku 2.7.
      UWAGA: Jako opcjonalną kontrolę jakości przed sesją, pobierz krótkie nagranie z sond i anteny zanurzonymi w stożkowej rurze ACSF o pojemności 50 mL, aby potwierdzić, że klatka Faradaya skutecznie tłumi zakłócenia elektromagnetyczne środowiska przed przystąpieniem do nagrania in vivo .
   6. Umieść elektrodę wewnątrzczaszkową o wysokiej gęstości ogonowej na ramieniu mikromanipulatora skierowanym prostopadle (≈ 90°) do powierzchni mózgu, a sonda wysokogęstości elektrody wewnątrzczaszkowej rostralnej na drugim ramieniu nachylonym pod kątem 50°.
   7. Pod mikroskopem binokularnym przesuwaj każdą sondę na około 1 mm powyżej twardej i wyrównuj oś Y każdej sondy z odpowiadającym wygrawerowanym rowkiem prowadzącym frezowanym w kroku 3.2.4.
   8. Zapisz to notatką pisemną lub fotografią przez lornetkę, gdzie siatka elektrod μECoG znajduje się tuż obok planowanego punktu wejścia każdej sondy.
      UWAGA: Gdy operacja jest przeprowadzona prawidłowo i nie występuje obrzęk kory, odstępy między krawędzią kości a układem μECoG są minimalne, co sprawia, że wybór punktów wejścia jest jednoznaczny. Aby uzyskać maksymalną precyzję przestrzenną na wszystkich sesjach podłużnych, wykonaj zdjęcie odsłoniętej kory z układem na miejscu i zidentyfikuj charakterystyczne naczynie pialne w wąskim obszarze między krawędzią kości a układem μECoG. Ten obraz, oznaczony wraz z jednostką referencyjną i jej względną pozycją względem padów μECoG, służy jako mapa referencyjna sesja do sesji do odtwarzania tego samego punktu wejścia w kolejne dni nagrania.
   9. Po zarejestrowaniu zgodności sondy z padem należy cofnąć każdą sondę do góry o około 15 mm, aby chronić delikatny trzpień elektrody podczas nakłucia twardówkowego.
   10. Wykonaj narzędzie do nakłucia duralnego, mocując sterylną igłę 30 G do końcówki aplikatora z bawełnianym końcówką i wyginając czubek pod kątem 90° za pomocą nieząbkowanych kleszczy.
   11. Powoli prowadź narzędzie do przebijania nad głowicą. Patrząc przez lornetkę, policz elektrody μECoG, aby wyrównać narzędzie z zarejestrowaną współrzędną wejściową. Opuść zgięty końcówkę do powierzchni oponowionej tak, aby końcówka tnąca zbliżała się do twardej pod kątem 90°, a trzonek narzędzia był trzymany równolegle do długiej osi grzbietu myszy.
   12. Przesuń czubek około 1 mm poniżej płaszczyzny twardówki i cofnij ją. Spodziewane jest niewielkie przejściowe krwawienie w miejscu przebicia; Osusz go skręconym rogiem chusteczki niewłóknistej.
   13. Opuszczaj każdą sondę elektrody wewnątrzczaszkowej o wysokiej gęstości na powierzchnię opona twardego pod ciągłą obserwacją lornetką bezpośrednio po nakłuciu. Jeśli przekłucie było precyzyjnie umieszczone, sonda płynnie przesuwa się przez perforację, bez uchylenia trzpienia.
   14. Każdą sondę stopniowo spuszczaj do głębokości celu 5 mm poniżej twardej z kontrolowaną prędkością około 0,1 mm/s lub wolniejszą²².
   15. Pozwól sondam mechanicznie się uspokoić przez 10 minut przed rozpoczęciem akwizycji danych.
       UWAGA: Mała perforacja oponówkowa powstała przez igłę 30 G zamyka się sama w ciągu kilku minut; dlatego włożenie sondy musi nastąpić niezwłocznie po nakłuciu.
3. Pozyskiwanie danych
   1. Rozpocznij zbieranie danych.
      UWAGA: Sygnały μECoG są wzmacniane przez cztery cyfrowe headstage'y o długości 128 kanałów połączone kablami interfejsu SPI z płytką akwizycji open-source, natomiast dwie sondy elektrod wewnątrzczaszkowej o wysokiej gęstości są pozyskiwane przez dedykowany moduł akwizycji sondy o wysokiej gęstości umieszczony w modułowej obudowie instrumentacyjnej, obok wielofunkcyjnych modułów wejścia/wyjścia i akwizycji danych do synchronizacji i sygnalizacji cyfrowej. Wspólny zegar TTL jest generowany przez otwartoźródłową płytkę akwizycyjną μECoG i rozprowadzany jako sprzętowa linia synchronizująca do obudowy akwizycji sondy (za pośrednictwem wielofunkcyjnego modułu I/O), tak aby oba strumienie akwizycji dzieliły bazę czasową wyrównaną z próbkami. Wszystkie strumienie danych są rejestrowane synchronicznie przez graficzny interfejs użytkownika systemu akwizycji; pełne modele sprzętowe i numery katalogowe są wymienione w Tabeli Materiałów.
   2. Na koniec sesji nagrania należy podać 0,5 mL ACSF na siatkach μECoG, następnie cofnąć każdą sondę elektrody wewnątrzczaszkowej o wysokiej gęstości z tą samą prędkością co przy wkładaniu (≈6 mm/min) i delikatnie usunąć matrycę μECoG.
   3. Czyść sondy i matrycę, mocząc przez 45 minut w świeżo przygotowanym roztworze enzymatycznym o stężeniu 1% (w/v).
   4. Po namoczeniu enzymatycznym detergentem spłukaj elektrody przez trzy kolejne zanurzenia w wodzie oczyszczonej metodą odwróconej osmozy, używając nowej rurki do każdego płukania.
   5. Wymień membranę PDMS na świeżą, sterylną warstwę zgodnie z krokiem 3.4.1.
   6. Ponownie nałóż uszczelniacz elastomerowy (krok 3.4.3–3.4.4) i przyklej nową ochronną nakrętkę wydrukowaną 3D (krok 3.4.5).
   7. Pozwól ponownie uszczelnionej części wyschnąć na powietrzu przez 5 minut, zanim mysz wróci do klatki domowej. Procedura może być powtarzana przez kilka sesji nagraniowych przez kilka tygodni.

Wyniki

Udana operacja skutkuje przejrzystym, przejrzystym oknem nad korą, z widocznym naczyniem i minimalnymi oznakami stanu zapalnego lub infekcji. Ta przejrzystość może być utrzymwana przez ponad 21 dni (Rysunek 1), co umożliwia długoterminowe badania podłużne. Odporność implantu potwierdza jego zdolność do utrzymania stabilności nawet podczas 21-dniowego przewlekłego podawania kortykosteronu, co jest powszechnym modelem wywoływania stanów podobnych do depresji u gryzoni 1...

Dyskusja

Raport ten opisuje dwufazowy, oszczędzający oponę oporządzoną procedurę chirurgiczną, który zapewnia niezawodną i bardzo skuteczną metodę tworzenia dużego, przewlekłego i ponownie zamykanego okna czaszkowego u myszy. Znaczenie tej techniki wykracza poza rozmiar okna. Główną zaletą jest możliwość jednoczesnego, wieloskalowego badania dużych sieci mózgowych w podłużnych skalach czasowych. Łącząc powierzchniowe siatki μECoG (dostarczające mezoskalowe dane LFP) z głębokimi, wysokogęstymi sondami elektrod wewnątrzczaszkowymi ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
&mikro; Macierz ECoG & mdash; 512-kanałowy niestandardowy (2 & razy; 256 kanałów)	NeuroNexus	E256-200-30-80	Opakowanie: IH256. Dwa 16&; 16 podsiatek (każda 3,3 mm i razy; 3,5 mm); 200 μ ton m; 80 μ średnica m elektrody. Nagrania DMN na poziomie powierzchniowym.
3-osiowe ramię mikromanipulatora lewej ręki	Światowe Precyzyjne Przyrządy (WPI)	504926	10 μ m rozdzielczość; wyświetlacz cyfrowy; stosowany do ustawiania płyty głowowej/sondy podczas operacji
Ochronna nakrętka drukowana w 3D	Wewnątrz (Anycubic Photon Mono 4K)	Nie ma	Projektowanie na zamówienie; drukowana w żywicy UV Anycubic High Clear; Plik STL dostępny pod https://github.com/RazBalin/ProtectiveDMN_Cap
Aceton (jakość laboratoryjna)	Sigma-Aldrich	179973	Odtłuszczanie powierzchni czaszki i usuwanie okostu przed zastosowaniem kleju
Adson Dura Hook 5 mm (Cienki haczyk dura)	gSource	gS 25.2570	Używany do odłączania płytki kostnej od opona twardego wzdłuż obwodu; wykonany z drobnego drutu wolframowego lub podobnego
Anycubic High Clear UV Resin	Anycubic	STMGCL-102B	Żywica fotopolimerowa używana z drukarką Anycubic Photon Mono 4K do ochronnych kondenstur drukowanych 3D
Anycubic Photon Mono 4K drukarka 3D z żywicy	Anycubic	PHOTON-MONO-4K	Używany do druku ochronnych nakładek okiennych z Anycubic High Clear Resin
Mycie i mycie żywicą UV Anycubic Maszyna do leczenia 2.0	Anycubic	285-550	Mycie po druku i utwardzanie UV kondenstur drukowanych 3D
Ramię przegubowe z podstawą magnetyczną (& razy; 2)	Haas Tooling	09-0535	Używał do trzymania i mikro; Podsiatki ECoG umieszczone na powierzchni kory podczas nagrań
Sztuczny CSF (aCSF)	Przygotowanie wewnętrzne	N/A (wewnętrznie)	przepis aCSF: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 1,25 mM KH2PO4, 10 mM D-glukozy; natleniaj 95% O2 / 5% CO2 zaraz po przygotowaniu. Numery katalogowe podane osobno.
Tępe mikrochirurgiczne ostrze (skalpel okrągły)	Iogen	374769	Wykorzystywane do skrobania powierzchni czaszki i zdejmowania nakrętek
Buprenorfina (Temgesic)	Indivior	BE-112515	Opioidowy środek przeciwbólowy; 0,05 mg/kg s.c. przed operacją
Myszy C57BL/6JRj	Janvier Labs		Mężczyzna lub kobieta; Minimum 10 tygodni życia, >20 g masy ciała w chwili operacji
Chlorek wapnia (CaCl2 i middot; 2H2O)	Sigma-Aldrich	C-7902	2 mM; MW 147.02; 0,29 g/L. Przygotowane jako Ca & razy; 100 akcji. Komponent wewnętrznego aCSF.
Karprofen (Rimadyl)	Zoetis Zdrowie Zwierząt	RXRIM-INJ	Przeciwzapalnik przeciwzapalny (NLPZ); 5 mg/kg s.c. przed operacją
Kortykosteron	Sigma-Aldrich	C2505	Rozpuszczone w wodzie pitnej dla 21-dniowego modelu przewlekłego stresu / depresji
Patyk watowy	Fisherbrand	22-363-157	Służy jako uchwyt do nakłucia dury o wadze 30 g oraz do odtłuszczania powierzchni czaszki acetonem
Klej cyjanoakrylanowy — Loctite 401	Kleje Henkela	Loctite 401	Cienkolepkowy cyjanoakrylan; Używany do gruntowania powierzchni czaszki, mocowania płyty głowowej i nakrętki
Wiertarka dentystyczna & mdash; Foredom K.1070	Pochodzenie	K.1070	Wiertarka obrotowa z elastycznym wałkiem; Stosowany do przerzedzania po kraniotomii i wiercenia otworów pilotażowych
Deksametazon	Dopharma	1DEX004	Kortykosteroidy przeciwzapalne; 2 mg/kg s.c. przed operacją
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G-7021	10 mM; MW 180.20; 1,80 g/L. Przygotowane jako glukoza i czasy; 100 akcji. Komponent wewnętrznego aCSF.
Wiertło Stalowy nabój 1/007W	Hager & Meisinger	18089	Wykorzystywane jako miejsce referencyjne i okno czaszkowe
Etanol 80% (v/v) - A12T Dilutus	Berner	13221132	Przedoperacyjne moczenie narzędzi chirurgicznych i laminarnego kaptura chirurgicznego w celu sterylizacji
Aparat do odprowadzania gazu	Nauki o życiu z napędem na tylne koła	R546W	Zbiera gazy znieczulające z obszaru chirurgicznego
Pozłacane gniazdo referencyjne	DigiKey	310-13-102-41-001000	Wszczepiony na lewym móżdżku; służy jako uziemienie/odniesienie ECoG
GRANT Ultradźwiękowy Czyściciel i mdash; Model 17002A	Instrumenty GRANT	17002A	EAN: 4064343191654. Kąpiel ultradźwiękowa w gorącej wodzie; stosowany z TICKOPUR TR 3 do czyszczenia przyrządów
Poduszka grzewcza i mdash; Supertech TMP-5B	Supertech	TMP-5B	Utrzymuje temperaturę ciała na poziomie 37 stopni; C przez cały czas znieczulenia
Izofluran	Piramal Healthcare	66794-017-25	Znieczulenie wziewne; indukcja 4%, konserwacja 1,5– 2.5%
Kimtech Science, chusteczki precyzyjne (tkanka niewłóknista)	KIMBERLY CLARK	7552	Stosowany z ostrym końcówką do suszenia pozostałości ACSF i wspomagania przyczepności membrany PDMS do twardej opony
Kwik-Cast Sterile Elastomer Sealant	Światowe Precyzyjne Przyrządy (WPI)	KWIK-CAST-s	Model: KWIK-CAST-S. Biokompatybilny silikon; służąca do tworzenia zdejmowanej uszczelki wokół membrany PDMS.
Pióro do utwardzania LED UV 405 nm	CureUV	514424-405	Używany do utwardzania cementu dentystycznego aktywowanego promieniowaniem UV (Total C-Ram) podczas implantacji
Roztwór lidokainy i adrenaliny	Orion Pharma	05 10 31	Znieczulenie miejscowe; S.C. Iniekcja pod skórę głowy
Heptahydrat siarczanu magnezu (MgSO4 i middot; 7H2O)	Sigma-Aldrich	M-7774	1 mM; MW 246,48; 0,25 g/L. Przygotowane jako Mg & razy; 100 akcji. Komponent wewnętrznego aCSF.
Metalowa płyta główka i mdash; Model Neurotar 13	Neurotar	Model 13	Tytanowa płyta głowna; otwór okrągły o średnicy 11 mm; przymocowane do czaszki cyjanoakrylanem i cementem dentystycznym
Adapter NeuroNexus do główki )	NeuroNexus	Niestandardowy IH256 64& razy; 4 Moleks	Niestandardowa płytka adaptera; kanapki każdy i mikro; Podsiatka ECoG pomiędzy dwoma stopieńmi głownymi Intan RHD 128-ch
Sonda Neuropixels 1.0 z metalową okrętką (& razy; 2)	IMEC	PRB_1_4_0480_1_C	960 miejsc nagrań; Trzon 10 mm. Jedna sonda celuje w kolumnę hipokampa-wzgórza-wzrokową, druga w kolumnę mPFC
Podwozie NI PXIe-1083	Instrumenty narodowe	PXIe-1083	9-szczelinowe obudowa PXI Express mieści moduł Neuropixels oraz karty DAQ NI
Moduł I/O wielofunkcyjny NI PXIe-3839	Instrumenty narodowe	PXIe-3839	Zamontowany w podwoziu NI PXIe-1083; używany do synchronizacji i pomocniczego wejścia/wyjścia
NI PXIe-6363 wielofunkcyjny DAQ	Instrumenty narodowe	PXIe-6363	Zamontowany w podwoziu NI PXIe-1083; analogowe i cyfrowe I/O do synchronizacji
Nova Microcinerator -  Sterylizator na podczerwień	Argos Tech	S3022	Używany do szybkiej sterylizacji wszelkich narzędzi, które mogą mieć kontakt z odsłoniętymi tkankami mózgowymi
Stereo mikroskop dwulornetkowy Olympus SZ51	Olympus	SZ51	wizualizacja chirurgiczna; Stosowane przez cały proces kraniotomii i implantacji
Otwarta Rada Zakupowa Ephys (Jedno pudełko, pierwsza generacja)	Open Ephys	OEPS-9029	Odbiór i mikro; Strumienie danych ECoG za pośrednictwem SPI; sprzęt open-source. Zobacz open-ephys.org
Open Ephys GUI	Open Ephys	N/A (open-source)	Darmowe, otwartoźródłowe oprogramowanie do pozyskiwania elektrofizjologii. Dostępne pod adresem: open-ephys.org
Chlorek potasu (KCl)	Sigma-Aldrich	P-5405	3 mM; MW 74,55; 0,22 g/L. Komponent wewnętrznego aCSF.
Fosforan diwodoru potasu (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P-5655	1,25 mM; MW 136.09; 0,17 g/L. Składnik wewnętrznego aCSF (Klebs × 10 sztuk w zapasach).
Roztwór povidonu i jodu (BETADINE)	Takeda	45 70 28	Miejscowy środek dezynfekujący do przygotowania do pola chirurgicznego
Moduł akwizycji PXIe	Neuropiksele	PXIE_1000	moduł w formacie PXI do akwizycji danych Neuropixels 1.0; Zainstalowany w podwoziu NI PXIe-1083
Złącze gniazda referencyjnego	DigiKey	342-10-102-00-591000	Odpowiadające złącze łączące gniazdo referencyjne powyżej; potwierdź numer części za pomocą DigiKey
Scena główna z prawą 128 kanałami (i czasy; 4)	Intan Technologies	RHD 128	Dwie główne sceny na mikro; podsiatka ECoG; model potwierdź (np. RHD2132 lub RHD2164)
Kabel interfejsu SPI na prawej stronie, 0,9 m	Intan Technologies / Open Ephys	C3203	Standardowy kabel SPI łączący headstage po prawej stronie z pakietem akwizycyjnym Open Ephys
Pompa powietrzna z napędem na tylne koła	Nauki o życiu z napędem na tylne koła	R510-29	Zapewnia przepływ powietrza przez obwód znieczulający
Waporyzator do znieczulenia zwierzęcego z napędem na tylne koła	Nauki o życiu z napędem na tylne koła	R5835	Precyzyjny parownik izofluranowy do indukcji i utrzymania znieczulenia
Ostrze skalpela #11	Swann Morton	SM0103	Używany do grawerowania wzorów krzyżujących na powierzchni czaszki, aby wzmocnić przyczepność
Podtrzymnik do włosów dla małych zwierząt - GT416	Aesculap Schermaschinen GmbH	D-98528H	Używany do przycinania skóry głowy przed operacją
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S-5761	26 mM; MW 84.01; 2,18 g/L. Komponent wewnętrznego aCSF.
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma-Aldrich	S-5886	124 mM; MW 58,44; 7,25 g/L. Komponent wewnętrznego aCSF.
SOL-M (Sterylna igła hipodermiczna, 30 G)	Europa Sol-Milenium	113005	Kąt 90°F; na końcu i przymocowane do patyczka kosmetycznego, aby stworzyć urządzenie do nakłucia twardej
Standardowe ramię manipulatora, 3-osiowe LEWE (stoelting)	Stoelting Co.	51604	Wykorzystywane do wprowadzania sondy Neuropixels podczas sesji nagraniowych
Standardowe ramię manipulatora, 3-osiowe PRAWO (stoelting)	Stoelting Co.	51606	Wykorzystywane do wprowadzania sondy Neuropixels podczas sesji nagraniowych
Stereotaktyczna ramka & mdash; Napęd na tylne koła F67001	Nauki o życiu z napędem na tylne koła	F67001	Standardowa rama stereotaksyczna; Stosowany do stabilizacji głowy oraz wszczepiania implantów z odniesieniem współrzędnym
Marker chirurgiczny do skóry z linijką (fioletowy atrament)	Fannin	SM0372	Biokompatybilny chirurgiczny marker skóry na bazie goryczki i fioletu używany do wyznaczania planowanej kraniotomii i śladu implantu na kości. Odporna na cyjanoakrylowe podstawowanie (Loctite 401) i pozostaje widoczna dzięki odtłuszczaniu czaszki oraz fiksacji headplae, co pozwala na niezawodny transfer współrzędnych stereotaktycznych na powierzchnię kości.
Zestaw SYLGARD 184 Silikonowy Elastomer (PDMS)	Dow (Niemcy)	1673921	polidimetylosiloksan; Rzucony na cienki (< 1 mm) błony; umieszczone na powierzchni oponowej, aby chronić mózg
Detergent enzymatyczny Tergazyme	Alconox	1304-1	Środek czyszczący na bazie proteazy stosowany w stężeniu 1% (w/v) w letniej wodzie RO do czyszczenia elektrod po sesji (45 minut moczenia, następnie potrójne płukanie w oczyszczonej wodzie).
Total C-RAM Automix UV Dental Cement (biały)	Itena	R301950	Model: TTCRAM-BLC. Żywica dentystyczna utwardzana UV; Wykorzystywane do wzmacniania płyt głowicowych i mocowania nasadek
Roztwór do czyszczenia ultradźwiękowego (TICKOPUR TR 3)	Dr. H. Stamm GmbH	TR-3-913	Koncentrat na bazie kwasu cytrynowego; Stosowany w kąpieli ultradźwiękowej do czyszczenia przyrządów pooperacyjnych
Viscotears Eye Gel 2 mg/g	Alcon	503849	maść nawilżająca na oczach na bazie karbomerów; Aplikowane na rogówki podczas znieczulenia, aby zapobiec wysychaniu
Zeiss Cold Light Source KL1500 LCD	Carl Zeiss	KL1500 LCD	Światłowodowe oświetlenie zimno w polu chirurgicznym; zapobiega uszkodzeniom termicznym