Method Article

Transkryptomika przestrzenna wczesnej morfogenezy zębów w tkance embrionalnej myszy zakorzenionej w parafinie

DOI:

10.3791/70340

⸱

March 13th, 2026

 , 
1Section on Craniofacial Genetic Disorders, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje wykorzystanie przekrojów zafiksowanych formaliną i osadzonych w parafinie z obszarów czaszkowo-twarzowych zarodków myszy E13.5 i E15.5 do analizy różnicowych profili ekspresji genów za pomocą transkryptomiki przestrzennej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwijający się ząb składa się z różnorodnych i wysoko wyspecjalizowanych populacji komórek, które współpracują, aby utrzymać prawidłową formę i funkcję. Wyjaśnienie interakcji między tymi komórkami a otaczającym ich mikrośrodowiskiem jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów regulacyjnych leżących u podstaw prawidłowego rozwoju zębów. Zaburzenia w tych procesach mogą prowadzić do zaburzeń wrodzonych, takich jak ageneza zębów, dentinogenesis imperfecta oraz amelogeneza imperfecta. Pomimo znacznego postępu dzięki sekwencjonowaniu pojedynczych komórek RNA (scRNA-seq) w ujawnianiu heterogeniczności komórkowej, nie zachowuje ono kontekstu przestrzennego komórek w tkankach, ograniczając zdolność do powiązania ekspresji genów z architekturą tkanek. Technologie transkryptomii przestrzennej łagodzą to ograniczenie, integrując profilowanie ekspresji genów o wysokiej rozdzielczości z zachowaniem rodzimej architektury tkanek, umożliwiając lokalizację in situ sygnatur molekularnych. Tutaj opisujemy krok po kroku protokół zbierania, fiksacji i osadzania parafiny w tkance czaszkowo-twarzowej embrionalnej myszy, odpowiednią do dalszych zastosowań transkryptomicznych przestrzennych. Workflow szczegółowo opisuje optymalne sekcjonowanie i obsługę tkanek utrwalonych formaliną i osadzonych w parafinie, aby zachować integralność RNA i morfologię tkanki dla analizy przestrzennej wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kompatybilna z platformami sekwencjonowania i transkryptomiki przestrzennej opartej na obrazach, umożliwiając powtarzalne profilowanie przestrzenne transkryptomiczne wczesnej morfogenezy zębów u zarodków myszy. To podejście dostarcza cennych informacji na temat organizacji przestrzennej i funkcjonalnej dynamiki struktur czaszkowo-twarzowych zarówno w stanach rozwojowych, jak i patologicznych, zapewniając kluczowe ramy do łączenia mechanizmów molekularnych z morfologią tkanek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój zębów opiera się na wysoce skoordynowanej sekwencji procesów morfogenetycznych podczas wczesnego wzrostu embrionalnego 1,2,3,4. Chociaż wiele kluczowych genów i szlaków sygnalizacyjnych zostało zidentyfikowanych dzięki badaniom genetycznym i rozwojowym, nasza wiedza na temat tego, jak te czynniki współdziałają przy kształtowaniu poszczególnych struktur czaszkowo-twarzowych, pozostaje ograniczona. Co istotne, nawet przy znacznym postępie w łączeniu konkretnych wariantów genetycznych zarówno z syndromicznymi, jak i niesyndromicznymi za....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Human Feed Committee (ACUC), zgodnie z Protokołem Badań Zwierząt #21-031.

1. Przygotowanie zwierząt doświadczalnych i pobieranie tkanek

  1. Sparuj zdrowe, płodne samce i samice Mus musculus na czas godów. Identyfikacja ciężarnych samic myszy na podstawie obecności korka pochwowego, oznaczonego jako dzień embrionalny (E) 0.5.
  2. Uśpienie ciężarnych samic myszy poprzez wdychanie CO₂, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Umieść zwierzę na....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta opisuje przetwarzanie świeżo rozciętych główek embrionalnych myszy w celu uzyskania próbek FFPE tkanek czaszkowo-twarzowych, w tym rozwijającego się zęba, które można łatwo przeciąć mikrotomem, zachowując integralność RNA (Rysunek 1). Protokół ten został pomyślnie zastosowany do głów zarodków myszy E13.5 (dzień embrionalny 13.5), E15.5 i E16.5 dla obszarów transkryptomiki czaszkowo-twarzowej opartej na wysokiej rozdzielczości (Rysunek 2) oraz sekwencjo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania bloków FFPE z głow embrionalnych myszy, zoptymalizowanych do pracy z platformami obrazowania przestrzennego RNA o wysokiej rozdzielczości, w tym transkryptomiką przestrzenną opartą na sekwencjonowaniu i obrazowaniu. Kluczowym celem tego protokołu jest zachowanie zarówno morfologii tkanki, jak i integralności kwasów nukleinowych w całych przekrojach głowy, ze szczególnym uwzględnieniem rozwijającego się obszaru czaszkowo-twarzowego. Zapewnienie takiego po.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy dr Sergeyowi L. Leikinowi, dr Elenie Makareeva (Sekcja Biochemii Fizycznej, NICHD/NIH) oraz dr Jeremie Oliverowi Piña (Sekcja Biologii Molekularnej Kości i Zębów, NIDCR/NIH) za porady dotyczące projektowania eksperymentów i wsparcia technicznego. Dziękujemy dr Iben James, dr Vivekowi Mahadevanowi (Molecular Genomics Core, NICHD/NIH) za wsparcie techniczne przy przeprowadzce transkryptomiki przestrzennej opartej na sekwencjonowaniu. Dziękujemy dr. Gustafowi Wigerbladowi (Oddział Autoimmunologii Systemowej, National Institute of Artrethy and Musculoskeletal and Skin Disease, NIAMS/NIH) za wsparcie techniczne w zakresie transkryptomiki przestrzennej....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSThermo Fischer10010023Użycie  do wykonywania washów podczas pracy
50 mL stożkowe rurki (Ambion) wolne od RNAseThermo FischerAM12502Używaj do przechowywania próbek w różnych roztworach
Zaawansowany orbitalny potrząsającyVWR6683-470Użyj do potrząsania tkanek w roztworze utrwalającym podczas inkubacji
Alkohol, 70%, Fisherbrand, HistoPrepFisher ScientificHC-1000-1GLUżyj do czyszczenia i dezynfekcji całego miejsca pracy
Zautomatyzowany procesor tkanek próżniowychLeica BiosystemsASP300SUżywa się do oczyszczania, odwodnienia, nawilżania i infiltracji woskiem do próbek
Grubość szkła pokrywowego 1,5, 25 mm x 25 mm Corning2850-25Zastosowanie do montażu suwaka w workflow Visium HD
Bufor Dako do niebieszczenia, gotowy do użyciaAgilant TechnologiesCS70230-2Zastosowanie dla H& Barwienie E
Eosyn-Y z floksynąFisher Scientific22050198Zastosowanie dla H& Barwienie E
Hematoksylina, Mayer's, gotowy do użycia roztwór wodnyAgilant TechnologiesS330930-2Zastosowanie dla H& Barwienie E
Kąpiel wodna HistoCore Leica BiosystemsHIS2326Używano do pływania sekcji pod kątem 40-43 stopni; C do usuwania zagnieceń z sekcji FFPE 
Przeglądarka Loupe   9.0.010X Genomics, Inc. Do analizy danych Visium HD 
Niskoprofilowe jednorazowe ostrza DB80LXLeica Biosystems14035843496Zastosowanie do sekcji bloków FFPE 
Neutralna formalina buforowana 10%Azer ScientificNBF-4-GUżyj do naprawy tkanek
Roztwór RNazy RNaze RNaseZapThermo FischerAM9782Używanie do czyszczenia i usuwania RNazy
Półautomatyczny mikrotom obrotowyLeica BiosystemsRM2245Używaj sekcjonowania bloków FFPE zgodnie z wytycznymi.
Ogrzewacz zjeżdżalni z osłonąPremiere XH2004Zastosowanie do inkubacji preparatów w różnych temperaturach
Superfrost Plus slajdy Fisher Scientific12-550-15 Używanie do dołączania sekcji dla Vsium HD
Chirurgiczne ostrze nr 11Integra Miltex4-311Zastosowanie do oceniania tkanek FFPE
Paraplast chirurgicznyLeica Biosystems39601006Zastosowanie do infiltracji tkanek i ich osadzania
TISsue DISH CULTURE 100X20MM 500/CSFisher Scientific877222Zastosowanie do zbierania i rozcinania próbek w 1x PBS
UltraPure GlycerolThermo Fischer15514011Zastosowanie do montażu szkła okrywowego Visium HD przed CytAssist
Visium CytAssist10X Genomics, Inc. PN-1000442Zastosowanie do eksperymentów workflow Visium HD
Visium HD sekwencjonowanie przestrzenne RNA10X Genomics, Inc. 1000676Zastosowanie do przeprowadzania eksperymentów transkryptomicznych przestrzennych
Xenium 5K In Situ RNA Lokalizacja 10X Genomics, Inc. PN-1000724Zastosowanie do przeprowadzania eksperymentów transkryptomicznych przestrzennych
Xenium Analyzer10X Genomics, Inc. PN-1000481Wykonaj obrazowanie RNA 5K z Xenium i Xenium 
Xenium Explorer 410X Genomics, Inc. Wykorzystanie do analizy danych Xenium 
Lokalizacja RNA in situ kseniu10X Genomics, Inc. 1000672Zastosowanie do przeprowadzania eksperymentów transkryptomicznych przestrzennych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thesleff, I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 126 (1), 67-71 (2018).
  2. Bei, M. Molecular genetics of tooth development. Curr Opin Genet Dev. 19 (5), 504-510 (2009).
  3. Roth, D. M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial TranscriptomicsTooth MorphogenesisMouse Embryonic TissueFormalin Fixed TissueParaffin EmbeddingCraniofacial DevelopmentRNA IntegrityTissue MorphologyGene Expression ProfilingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles