Transkryptomika przestrzenna wczesnej morfogenezy zębów w tkance embrionalnej myszy zakorzenionej w parafinie

Summary

Obecny protokół opisuje wykorzystanie przekrojów zafiksowanych formaliną i osadzonych w parafinie z obszarów czaszkowo-twarzowych zarodków myszy E13.5 i E15.5 do analizy różnicowych profili ekspresji genów za pomocą transkryptomiki przestrzennej.

Abstract

Rozwijający się ząb składa się z różnorodnych i wysoko wyspecjalizowanych populacji komórek, które współpracują, aby utrzymać prawidłową formę i funkcję. Wyjaśnienie interakcji między tymi komórkami a otaczającym ich mikrośrodowiskiem jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów regulacyjnych leżących u podstaw prawidłowego rozwoju zębów. Zaburzenia w tych procesach mogą prowadzić do zaburzeń wrodzonych, takich jak ageneza zębów, dentinogenesis imperfecta oraz amelogeneza imperfecta. Pomimo znacznego postępu dzięki sekwencjonowaniu pojedynczych komórek RNA (scRNA-seq) w ujawnianiu heterogeniczności komórkowej, nie zachowuje ono kontekstu przestrzennego komórek w tkankach, ograniczając zdolność do powiązania ekspresji genów z architekturą tkanek. Technologie transkryptomii przestrzennej łagodzą to ograniczenie, integrując profilowanie ekspresji genów o wysokiej rozdzielczości z zachowaniem rodzimej architektury tkanek, umożliwiając lokalizację in situ sygnatur molekularnych. Tutaj opisujemy krok po kroku protokół zbierania, fiksacji i osadzania parafiny w tkance czaszkowo-twarzowej embrionalnej myszy, odpowiednią do dalszych zastosowań transkryptomicznych przestrzennych. Workflow szczegółowo opisuje optymalne sekcjonowanie i obsługę tkanek utrwalonych formaliną i osadzonych w parafinie, aby zachować integralność RNA i morfologię tkanki dla analizy przestrzennej wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kompatybilna z platformami sekwencjonowania i transkryptomiki przestrzennej opartej na obrazach, umożliwiając powtarzalne profilowanie przestrzenne transkryptomiczne wczesnej morfogenezy zębów u zarodków myszy. To podejście dostarcza cennych informacji na temat organizacji przestrzennej i funkcjonalnej dynamiki struktur czaszkowo-twarzowych zarówno w stanach rozwojowych, jak i patologicznych, zapewniając kluczowe ramy do łączenia mechanizmów molekularnych z morfologią tkanek.

Introduction

Rozwój zębów opiera się na wysoce skoordynowanej sekwencji procesów morfogenetycznych podczas wczesnego wzrostu embrionalnego 1,2,3,4. Chociaż wiele kluczowych genów i szlaków sygnalizacyjnych zostało zidentyfikowanych dzięki badaniom genetycznym i rozwojowym, nasza wiedza na temat tego, jak te czynniki współdziałają przy kształtowaniu poszczególnych struktur czaszkowo-twarzowych, pozostaje ograniczona. Co istotne, nawet przy znacznym postępie w łączeniu konkretnych wariantów genetycznych zarówno z syndromicznymi, jak i niesyndromicznymi zaburzeniami zęba, szczegółowe mechanizmy molekularne leżące u podstaw morfogenezy specyficznej struktury nie są w pełni zdefiniowane 1,2,3,4. Ta luka w wiedzy nadal ogranicza rozwój ukierunkowanych strategii terapeutycznych w przypadku genezy zębów lub innych aberracji zębów.

Sekwencjonowanie mRNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) umożliwiło odkrycie wcześniej nierozpoznanych typów komórek zarówno w zdrowych, jak i chorych tkankach, a także identyfikację wielu podtypów komórek na podstawie różnych profili ekspresji genów. Jednak ponieważ scRNA-seq wymaga dysocjacji tkanek na pojedyncze komórki, informacje o pierwotnej pozycji przestrzennej każdej komórki w tkance są tracone. W rezultacie te zbiory danych nie oddają sposobu rozmieszczenia komórek względem architektury tkanek ^5,6,7. Ponadto przewidywane interakcje komórka między komórkami opierają się na obecności komplementarnych interakcji transkrypcji, ale nie uwzględniają rzeczywistej informacji przestrzennej, co jest istotne dla określenia, czy takie interakcje zachodzą in vivo ^5,6,7.

Technologia transkryptomiki przestrzennej umożliwia profilowanie ekspresji genów o wysokiej przepustowości, jednocześnie zachowując informacje przestrzenne w przekrojach tkanek ^8,9. Technologie transkryptomiki przestrzennej opierają się na obrazowaniu 10,11,12 lub sekwencjonowaniu ^12,13. Podejścia transkryptomiki przestrzennej oparte na obrazowaniu wykorzystują FISH do wykrywania i mierzenia ukierunkowanej ekspresji genów z precyzją przestrzenną komórkową lub podkomórkową. Natomiast technologie oparte na sekwencjonowaniu rejestrują ekspresję genów obejmującą cały transkryptom z niższą rozdzielczością przestrzenną. Transkryptomika przestrzenna oparta na sekwencjonowaniu wykorzystuje strategię osiągania niemal rozdzielczości pojedynczej komórki przy pokryciu całego transkryptomu (~20 000 genów), wspierając bezstronne analizy eksploracyjne, podczas gdy transkryptomika przestrzenna oparta na obrazach celuje w panele genowe (do ~5 000 genów), umożliwiając precyzyjną analizę specyficznych szlaków i interakcji komórkowych opartą na hipotezach¹⁴.

Postęp technologiczny w transkryptomice przestrzennej umożliwia obecnie analizę ekspresji genów w architekturze zachowanych tkanek. Procesy oparte na formalinie zafiksowanej parafinie (FFPE) oraz kriosekcyjne oferują uzupełniające podejścia do transkryptomiki przestrzennej 15,16,17. FFPE zapewnia doskonałą ochronę architektury tkanek, umożliwiając dokładne mapowanie przestrzenne ekspresji genów w tkankach strukturalnie złożonych, takich jak rozwijające się zęby i półki podniebienne. W naszym i innych badaniach fiksacja i archiwizacja FFPE dostarczyły bardzo dokładnych i powtarzalnych danych transkryptomicznych^{przestrzennych18}. Procesy kriosekcyjne zachowują integralność RNA, ale są bardziej podatne na zniekształcenia tkanek¹⁸. Dlatego do tego badania wybrano FFPE. Chociaż sukces scRNA-seq w dużej mierze zależy od zachowania wysokiej integralności RNA, transkryptomika przestrzenna wymaga również wysokiej jakości morfologii tkanek, aby precyzyjnie lokalizować sygnały ekspresji genów do określonych cech histologicznych.

Protokół ten najlepiej sprawdza się w przypadku embrionalnych tkanek czaszkowo-twarzowych myszy FFPE, obejmujących wczesne etapy rozwojowe, gdzie zachowanie struktury drobnej tkanki jest kluczowe dla analizy transkryptomii przestrzennej. Przepływ pracy prawdopodobnie będzie działał suboptymalnie w próbkach z nadmiernym fiksowaniem, źle zorientowanych blokach parafiny lub tkankach z obniżoną integralnością RNA, co może prowadzić do obniżenia jakości sygnału i utraty rozdzielczości przestrzennej. Skuteczne zastosowanie tej metody potwierdza nienaruszona morfologia tkanek, minimalne zniekształcenia przekroju oraz solidne, przestrzennie rozdzielone sygnały transkryptomiczne zgodne z cechami histologicznymi.

Protocol

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Human Feed Committee (ACUC), zgodnie z Protokołem Badań Zwierząt #21-031.

1. Przygotowanie zwierząt doświadczalnych i pobieranie tkanek

1. Sparuj zdrowe, płodne samce i samice Mus musculus na czas godów. Identyfikacja ciężarnych samic myszy na podstawie obecności korka pochwowego, oznaczonego jako dzień embrionalny (E) 0.5.
2. Uśpienie ciężarnych samic myszy poprzez wdychanie CO₂, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Umieść zwierzę na plecach na sterylnej, chłonnej powierzchni chirurgicznej i zdezynfekuj okolice brzucha 70% etanolem w miejscu docelowego nacięcia.
3. Wykonaj nacięcie środkowe brzucha sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi i ostrożnie otwórz ścianę otrzewnej nożyczkami mikrochirurgicznymi, aby odsłonić rogi macicy. Delikatnie zewnętrznij łańcuch macicy za pomocą tępych kleszczy. Wyizoluj zarodki, uwalniając tkankę macicy wzdłuż miometrium i przecinając w jajowodu oraz przy przyłączeniu rogu macicy pośrodkowej.
4. Natychmiast przenieś całe zarodki do lodowato zimnego, sterylnego 1x PBS w szalce Petriego o średnicy 10 cm.
5. Ostrożnie oddziel każdy zarodek od otaczających błon macicy, owodniowych i kosmówkowych i przenieś go do świeżej misy o średnicy 10 cm zawierającej lodowato zimny, sterylny 1x PBS.
6. Rozcinaj głowy embrionalne na pożądanych etapach rozwoju za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego i płucz je raz w zimnym chłodzie, 1x PBS przed dalszym przetwarzaniem.

2. Utrwalanie i przetwarzanie tkanki

1. Rozcinaj embrionalne głowy myszy na pożądanych etapach rozwoju i utrwal 10% neutralnej buforowanej formaliny przez noc w temperaturze pokojowej na shakerze.
2. Po utrwaleniu usuń formalinę i przepłucz próbki 1x PBS, zanim przelanie ich do 70% etanolu do przechowywania. Wykonaj odwodnienie tkanek, oczyszczanie i infiltrację parafiny przy użyciu zautomatyzowanego procesora tkankowego.
3. Osadzić głowy zarodków w parafinie z orientacją w płaszczyźnie koronnej lub strzałkowej.
4. Po zastygnięciu wosku usuń bloki parafiny z form, umieść je w oznaczonych, szczelnych pojemnikach lub woreczkach strunowych i przechowywaj w temperaturze 4 °C aż do sekcjonowania.
   UWAGA: Bloki FFPE można przechowywać przez kilka lat przed przecięciem bez naruszania integralności tkanek.

3. Przetwarzanie tkanek FFPE do transkryptomiki przestrzennej

1. Dezynfekować powierzchnie robocze i narzędzia 70% etanolem, a następnie leczenie roztworem dekontaminującym RNazą, aby zminimalizować degradację RNA.
2. Przygotuj kąpiel wodną zawierającą wodę zniesionizowaną i utrzymuj ją w temperaturze 40 °C, dostosowując temperaturę od 40 °C do 43 °C w zależności od cech stadium embrionalnego lub tkanek.
3. Ustaw mikrotom, zamontuj nowy ostrz po delikatnym przetarciu go roztworem dekontaminującym RNazą, zabezpiecz łopatkę i ustaw kąt odstępu na 10°.
   UWAGA: Upewnij się, że nowe ostrze jest używane do sekcjonowania w celu uzyskania precyzyjnych krojów tkanek. Zmiana kąta łopatki mikrotomu może znacząco wpłynąć na jakość przekroju, wpływając na integralność tkanek, jednolitość grubości oraz zachowanie cech morfologicznych.
4. Usuń nadmiar parafiny wokół osadzonej tkanki i zamontuj blok FFPE na zimnym etapie mikrotomu.
5. Przygotuj i poddaj czyste pęsety oraz szczotki roztworem dekontaminującym RNazę przed użyciem.
6. Wyrównaj powierzchnię bloku parafinowego z ostrzem mikrotomowym i wykonuj cięcia przycinające o długości około 12 μm, aż zbliżysz się do interesującego obszaru (np. do momentu, gdy część mezjalna trzonowców stanie się widoczna w przekrojach koronowych). Dostosuj pozycję bloku i ostrza w razie potrzeby, aby zapewnić symetryczne, prawidłowo ukierunkowane przekroje koronalne całej głowy.
7. Jeśli ma być przeprowadzona izolacja RNA przekrojów tkanek, należy bezpośrednio pobrać 10 μm przekrojów do rurek mikrowirówek o pojemności 1 mL i przetwarzać je zgodnie z zaleceniami producenta^19,20 dla oceny jakości DV200.
8. Wycinam przekroje seriowe o grubości 5 μm i stale monitoruj bliskość obszaru zainteresowania, badając przekroje testowe na zwykłym szkiełku pod mikroskopem.
9. Po zbliżeniu się do interesującego obszaru ostrożnie nacinaj obszar tkanki skalpelem No. 11, nie przecinając go całkowicie, w dwóch strategicznie rozmieszczonych obszarach, aby zapobiec zgięciu lub przyleganiu przekrojów. Po pokroieniu usuń przymocowaną parafinę za pomocą włosia cienkiego pędzla.
10. Unieś fragmenty tkanki na kąpiel wodną w temperaturze 41 °C, aby umożliwić delikatne rozluźnienie i spłaszczenie przed podniesieniem na zjeżdżalni.

4. Transkryptomika przestrzenna oparta na sekwencjonowaniu

1. Zbieraj przekroje tkanek na zalecane szkiełka szklane, dbając o to, aby wszystkie interesujące obszary mieściły się w obszarze 6,5 × 6,5 mm. Gdy na tym samym szkiełku umieszczono kilka sąsiednich sekcji, na krótko podgrzej je na podgrzewaczu do 40 °C, aby zwiększyć przyczepność i zapobiec odłączaniu wcześniej umieszczonych sekcji. Po umiejscowieniu wszystkich sekcji inkubuj szkiełka w krytej grzewce w temperaturze 60 °C przez 2 godziny, aby poprawić przyczepność tkanek.
   UWAGA: Przekroje wykraczające poza obszar 6,5 × 6,5 mm nie zostały przetworzone.
2. Po inkubacji należy przeprowadzić barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) za pomocą standardowego protokołu barwienia H&E, zastępując wodę z kranu wodą dejonizowaną, aby zachować integralność RNA.
3. Montaż pokrywek przy użyciu 80% glicerolu i uzyskanie obrazów H&E o wysokiej rozdzielczości, zapewniając wyższej jakości obraz referencyjny zastępujący typowy obraz H&E generowany przez system obrazowania i transferu tkanek na szkiełkach.
4. Po zdjęciu usuń pokrywki, zanurzając je pojedynczo w rurkach 50 mL zawierających wodę dejonizowaną, i przygotowuj preparaty do wysłania do zakładu podstawowego w celu dalszego przetwarzania.

5. Transkryptomika przestrzenna oparta na obrazach

UWAGA: Producent dostarczył slajdy²⁰, każdy zawierający wyznaczony obszar obrazowalny (zarysowane linie) o wymiarach 12 mm × 24 mm, z dostępnym obszarem umieszczania próbki około 235 mm² (10,45 mm × 22,45 mm).

1. Umieść przekroje tkanek całkowicie w tym wyznaczonym obszarze, zapewniając, że fragmenty, w tym parafina resztkowa, nie nakładają się na siebie. Podczas układania wielu sąsiednich sekcji na krótko podgrzej zamki na podgrzewaczu do 40 °C, aby zwiększyć przyczepność i zapobiec odłączaniu się wcześniej zamontowanych sekcji.
2. Po umiejscowieniu wszystkich przekrojów tkanek umieść szkiełka w zakrytym podgrzewaczu i inkubuj przez noc w temperaturze 40 °C, aby zapewnić prawidłowe przyleganie.
3. Po inkubacji należy stosować protokół¹⁹ producenta, aby przetworzyć preparaty i załadować je do maszyny do sekwencjonowania RNA, przy czym protokół jest porównywany z najnowszą wersją, ponieważ szczegóły proceduralne podlegają okresowym aktualizacjom.
   UWAGA: Wszystkie materiały niebezpieczne powstałe podczas protokołu, takie jak formalina, etanol i roztwory dekontaminujące RNazą, powinny być utylizowane zgodnie z politykami bezpieczeństwa instytucjonalnymi i lokalnymi przepisami, przy użyciu odpowiednich pojemników na odpady chemiczne, metod utylizacji zagrożeń biologicznych oraz praktyk dotyczących wyparów.

Results

Metoda ta opisuje przetwarzanie świeżo rozciętych główek embrionalnych myszy w celu uzyskania próbek FFPE tkanek czaszkowo-twarzowych, w tym rozwijającego się zęba, które można łatwo przeciąć mikrotomem, zachowując integralność RNA (Rysunek 1). Protokół ten został pomyślnie zastosowany do głów zarodków myszy E13.5 (dzień embrionalny 13.5), E15.5 i E16.5 dla obszarów transkryptomiki czaszkowo-twarzowej opartej na wysokiej rozdzielczości (Rysunek 2) oraz sekwencjo...

Discussion

W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania bloków FFPE z głow embrionalnych myszy, zoptymalizowanych do pracy z platformami obrazowania przestrzennego RNA o wysokiej rozdzielczości, w tym transkryptomiką przestrzenną opartą na sekwencjonowaniu i obrazowaniu. Kluczowym celem tego protokołu jest zachowanie zarówno morfologii tkanki, jak i integralności kwasów nukleinowych w całych przekrojach głowy, ze szczególnym uwzględnieniem rozwijającego się obszaru czaszkowo-twarzowego. Zapewnienie takiego po...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fischer	10010023	Użycie  do wykonywania washów podczas pracy
50 mL stożkowe rurki (Ambion) wolne od RNAse	Thermo Fischer	AM12502	Używaj do przechowywania próbek w różnych roztworach
Zaawansowany orbitalny potrząsający	VWR	6683-470	Użyj do potrząsania tkanek w roztworze utrwalającym podczas inkubacji
Alkohol, 70%, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	Użyj do czyszczenia i dezynfekcji całego miejsca pracy
Zautomatyzowany procesor tkanek próżniowych	Leica Biosystems	ASP300S	Używa się do oczyszczania, odwodnienia, nawilżania i infiltracji woskiem do próbek
Grubość szkła pokrywowego 1,5, 25 mm x 25 mm	Corning	2850-25	Zastosowanie do montażu suwaka w workflow Visium HD
Bufor Dako do niebieszczenia, gotowy do użycia	Agilant Technologies	CS70230-2	Zastosowanie dla H& Barwienie E
Eosyn-Y z floksyną	Fisher Scientific	22050198	Zastosowanie dla H& Barwienie E
Hematoksylina, Mayer's, gotowy do użycia roztwór wodny	Agilant Technologies	S330930-2	Zastosowanie dla H& Barwienie E
Kąpiel wodna HistoCore	Leica Biosystems	HIS2326	Używano do pływania sekcji pod kątem 40-43 stopni; C do usuwania zagnieceń z sekcji FFPE
Przeglądarka Loupe   9.0.0	10X Genomics, Inc.		Do analizy danych Visium HD
Niskoprofilowe jednorazowe ostrza DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	Zastosowanie do sekcji bloków FFPE
Neutralna formalina buforowana 10%	Azer Scientific	NBF-4-G	Użyj do naprawy tkanek
Roztwór RNazy RNaze RNaseZap	Thermo Fischer	AM9782	Używanie do czyszczenia i usuwania RNazy
Półautomatyczny mikrotom obrotowy	Leica Biosystems	RM2245	Używaj sekcjonowania bloków FFPE zgodnie z wytycznymi.
Ogrzewacz zjeżdżalni z osłoną	Premiere	XH2004	Zastosowanie do inkubacji preparatów w różnych temperaturach
Superfrost Plus slajdy	Fisher Scientific	12-550-15	Używanie do dołączania sekcji dla Vsium HD
Chirurgiczne ostrze nr 11	Integra Miltex	4-311	Zastosowanie do oceniania tkanek FFPE
Paraplast chirurgiczny	Leica Biosystems	39601006	Zastosowanie do infiltracji tkanek i ich osadzania
TISsue DISH CULTURE 100X20MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Zastosowanie do zbierania i rozcinania próbek w 1x PBS
UltraPure Glycerol	Thermo Fischer	15514011	Zastosowanie do montażu szkła okrywowego Visium HD przed CytAssist
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.	PN-1000442	Zastosowanie do eksperymentów workflow Visium HD
Visium HD sekwencjonowanie przestrzenne RNA	10X Genomics, Inc.	1000676	Zastosowanie do przeprowadzania eksperymentów transkryptomicznych przestrzennych
Xenium 5K In Situ RNA Lokalizacja	10X Genomics, Inc.	PN-1000724	Zastosowanie do przeprowadzania eksperymentów transkryptomicznych przestrzennych
Xenium Analyzer	10X Genomics, Inc.	PN-1000481	Wykonaj obrazowanie RNA 5K z Xenium i Xenium
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.		Wykorzystanie do analizy danych Xenium
Lokalizacja RNA in situ kseniu	10X Genomics, Inc.	1000672	Zastosowanie do przeprowadzania eksperymentów transkryptomicznych przestrzennych