Standaryzowany test cytometrii przepływowej z wykorzystaniem suszonych paneli przeciwciał rekombinowanych do charakteryzacji komórek CAR T

Podsumowanie

Ten protokół pokazuje, jak wysuszone panele przeciwciał rekombinowanych upraszczają charakteryzację komórek Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) poprzez zmniejszenie zmienności i upraszczanie przepływów pracy. Umożliwia to powtarzalną ocenę krytycznych atrybutów jakości, w tym bezwzględne ilościowe określenie komórek Chimeric Antigen Receptor T, i jest kompatybilny z różnymi platformami cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Cytometria przepływowa jest powszechnie stosowana do oceny krytycznych atrybutów jakości komórek T z chimerycznymi receptorami antygenowymi (CAR T), w tym żywotności, fenotypu i efektywności transdukcji. Konwencjonalne przepływowe przebiegi pracy z reagentami wymagają wielu kroków przygotowania, które mogą wprowadzać zmienność i różnice w obsłudze zależnej od operatora. Preformułowane suszone panele przeciwciał rekombinantnych zapewniają alternatywny format, który łączy technologię przeciwciał rekombinantnych z gotową do użycia konfiguracją. Rekombinantowe przeciwciała oferują określoną specyficzność i zmniejszoną zmienność pomiędzy partiami, podczas gdy suszony format zmniejsza kroki przygotowania i upraszcza obsługę reagentów. Przedstawiamy tutaj szczegółowy przebieg pracy dla analizy komórek CAR T z wykorzystaniem suszonych paneli przeciwciał rekombinantnych. Protokół obejmuje barwienie próbek, pozyskiwanie danych i analizę oraz jest uzupełniony schematycznym przeglądem przebiegu pracy. Pokazane zostały reprezentatywne wyniki barwienia w celu zilustrowania zastosowania panelu, a podkreślono różnice w czasie pracy w porównaniu z konwencjonalnym przebiegiem pracy z reagentami w postaci ciekłej. Przedstawione przykłady demonstrują, jak te panele mogą być wykorzystane do usprawnienia wieloporametrowej charakteryzacji komórek CAR T. Ogólnie rzecz biorąc, ta praca dostarcza praktycznego ramowania dla wdrożenia suszonych paneli przeciwciał rekombinantnych w analizie komórek CAR T opartej na cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

Terapie komórek CAR T stały się głównym postępem w leczeniu raka, szczególnie w przypadku chorób hematologicznych. To podejście wykorzystuje własny układ odpornościowy pacjenta poprzez modyfikację komórek T, aby wyrażały chimeryczne receptory antygenowe (CAR), które rozpoznają i atakują komórki rakowe¹. Jednak bardzo skomplikowana infrastruktura i wymagające pracy procesy produkcyjne wymagane do wytwarzania komórek CAR T sprawiają, że rygorystyczna, standaryzowana charakterystyka jest niezbędna dla zapewnienia zarówno jakości produktu, jak i bezpieczeństwa pacjenta. Znaczna część ogólnych kosztów terapii CAR T pochodzi z rozległych prac laboratoryjnych i procedur kontroli jakości (QC), z których wiele obejmuje ręczne, wieloetapowe przepływy pracy. W tym kontekście, kluczowe parametry charakterystyki—takie jak efektywność transdukcji i testy tożsamości—są kluczowe dla oceny potencjału terapeutycznego zmodyfikowanych komórek². Tradycyjne metody barwienia w cytomierzu przepływowym, powszechnie stosowane w tych ocenach, stwarzają kilka wyzwań. Zmienność w pipetowaniu, problemy ze stabilnością reagentów i stronniczość operatora mogą prowadzić do niekonsekwencji i niedokładności danych, co potencjalnie może kompromitują wiarygodność wyników³.

Cytometria przepływowa jest kamieniem węgielnym technologii służącej do charakteryzacji i kontroli jakości komórek CAR T, umożliwiając szczegółową analizę wielu parametrów komórkowych. Jednak konwencjonalne użycie płynnych reagentów w tym procesie jest obciążone potencjalnymi pułapkami^4,5. Zmienność pipetowania może wprowadzać znaczne błędy, szczególnie podczas pracy z małymi objętościami i wieloma reagentami. Co więcej, płynne reagenty są podatne na degradację w czasie, co może zniekształcić ich stabilność i prowadzić do niekonsekwentnych wyników barwienia⁶. Stronniczość operatora, wynikająca z manualnego przygotowania i obsługi, dodatkowo zaostrza te problemy, co może prowadzić do zmienności wyników między laboratoriami, a nawet w różnych przebiegach w tym samym laboratorium. Krytyczne atrybuty jakości takie jak żywotność komórek, częstotliwość transdukcji, liczba CD3⁺ oraz tożsamość są niezbędne dla bezpiecznego uwolnienia produktów CAR T. Zapewnienie dokładności i spójności tych pomiarów jest kluczowe, ponieważ mają one bezpośredni wpływ na skuteczność terapeutyczną i bezpieczeństwo komórek CAR T¹. Na przykład dokładna ocena częstotliwości transdukcji jest kluczowa dla określenia proporcji komórek T, które zostały pomyślnie zmodyfikowane tak, aby wyrażały CAR, podczas gdy liczba CD3⁺ i procent zapewniają wgląd w ogólną kompozycję i czystość populacji komórek T.

Suszone panele przeciwciał oferują obiecujące rozwiązanie tych wyzwań, zapewniając jednolite dostarczanie reagentów i zmniejszając czas przygotowania oraz ryzyko błędów. Te panele składają się z wielu przeciwciał, które zostały suszone z premiksowanych koktajli. Po wysuszeniu panele te są stabilne i gotowe do użycia, eliminując konieczność złożonych kroków przygotowania i minimalizując potencjalne błędy ludzkie^6,7. Co ważne, nie ma potrzeby rekonstytucji tych suszonych paneli przed użyciem—zawiesiny komórkowe mogą być dodawane bezpośrednio do suszonego mieszania przeciwciał. Wprowadzenie rekombinantowych przeciwciał do tych suszonych formatów oferuje kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi reagentami poliklonalnymi lub pochodzącymi z hybrydomów. Ich molekularnie określona struktura zapewnia wysoką spójność i powtarzalność pomiędzy partiami, zmniejszając zmienność między eksperymentami i laboratoriami. Zaprojektowana sekwencja Fc na bazie ludzkiego IgG1 minimalizuje krzyżowe reakcje i tło barwienia. W konsekwencji, blokowanie Fc nie jest wymagane, co dodatkowo zmniejsza czas potrzebny na wykonanie cytometrii przepływowej. Suszony format chroni reagenty przed degradacją, utrzymując ich skuteczność w czasie i między partiami. Ta spójność jest kluczowa dla osiągania niezawodnych i powtarzalnych wyników w badaniach cytometrii przepływowej⁸.

Zastosowanie suszonych formatów reagentów rozciąga się na różne etapy rozwoju i monitorowania terapii komórek CAR T. W kontroli jakości produkcji, suszone reagenty ułatwiają próbkowanie w zamkniętym systemie, zapewniając sterylność i spójność. Jest to szczególnie ważne w środowisku klinicznym, gdzie utrzymanie integralności próbki jest zasadnicze⁹. Dla charakterystyki produktu, suszone reagenty umożliwiają dokładną ocenę liczby bezwzględnej i podzbiorów odporności, co jest kluczowe dla określenia terapeutycznej jakości komórek CAR T. Ponadto, w ustawieniach badawczych, suszone reagenty są nieocenione dla długotrwałego monitorowania pacjentów, umożliwiając konsekwentne śledzenie trwałości komórek CAR T w czasie, co jest kluczowe dla zrozumienia długoterminowej skuteczności i bezpieczeństwa terapii.

Zalety stosowania suszonych paneli przeciwciał w cytometrii przepływowej są wielorakie, z których jedną z najważniejszych jest ich zdolność

Protokół

Wszystkie próbki ludzkie zostały pobierane od zdrowych, anonimowych wolontariuszy po uzyskaniu pisemnej zgody. Wszystkie procedury zostały zaakceptowane przez Komitet Etyczny Ärztekammer Nordrhein (#2020272) i przeprowadzone zgodnie z wymaganymi przepisami etycznymi i biobezpieczeństwa.

1. Zbieranie i przygotowanie próbek

1. Zbieraj aseptycznie próbki komórek Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) z worków do przetwarzania w celu kontroli jakości produkcji.
2. Przetwarzaj próbki natychmiast, aby zachować żywotność komórek. Przechowuj próbki w temperaturze 2–8 °C, chronione przed światłem, do momentu barwienia.
3. Wyznacz liczbę komórek w każdej próbce przed barwieniem.
4. Dostosuj każdą próbkę do stężenia do 10⁶ komórek z jądrem na 100 µL za pomocą bufora fosforanowego (PBS)/2 mM EDTA/0,5% BSA, pH 7,2.
   1. Jeśli to konieczne, wyśrodkuj próbki przy 300 × g. przez 5 min. Aspiruj całkowicie nadstan.
   2. Zawieś komórki do odpowiednego stężenia.

2. Suszenie panelu barwienia

UWAGA: Do barwienia próbek używa się dwóch wstępnie sformułowanych suszonych paneli przeciwciał: suszonego rekombinowanego przeciwciała Immune Cell Composition (ICC) Cocktail, ludzkiego i suszonego rekombinowanego CAR T Transduction Cocktail, ludzkiego. Barwienie CAR dla panelu CAR T Transduction jest krytyczne. Niezawodne oddzielenie komórek CAR-negatywnych i CAR-pozytywnych jest wymagane do dokładnego określenia częstotliwości transdukcji. Mycie może zmniejszyć odzyskiwanie komórek z powodu utraty komórek podczas wirowania i aspiracji. Dlatego protokoły bez mycia są generalnie preferowane, gdy wymagana jest dokładna koncentracja komórek.

1. ICC Cocktail (protokół bez mycia)
   1. Dodaj 100 µL przygotowanej zawiesiny komórek bezpośrednio do wysuszonej tubki przeciwciała ICC. Mieszaj pipetą w górę i w dół i/lub krótko wiruj, aby w pełni rozpuścić pelet. Inkubacja przez 10 min w ciemności w temperaturze pokojowej (19–25 °C).
   2. Upewnij się, że wysuszony pelet przeciwciała jest w pełni rozpuszczony. Przejdź bezpośrednio do akwizycji bez mycia.
2. Koktajl transdukcji CAR T (protokół mycia)
   1. Dodaj 100 µL przygotowanej zawiesiny komórek do wysuszonej tubki transdukcji CAR T.
   2. Dodaj odpowiednią objętość reagenta wykrywającego CAR (np. 2 µL). Mieszaj pipetą w górę i w dół i/lub krótko wiruj, aby w pełni rozpuścić pelet. Inkubacja przez 10 min w ciemności w temperaturze pokojowej (19–25 °C). Upewnij się, że wysuszony pelet przeciwciała jest w pełni rozpuszczony.
   3. Odwiruj komórki, dodając 1 mL bufora. Wirowanie przy 300 × g. przez 5 min. Całkowicie usuń nadstan.
3. Barwienie wtórne (jeśli to konieczne)
   1. Wykonaj drugie mycie (zobacz krok 2.2.3) dla reagentów wykrywających CAR oznaczonych biotiną, aby usunąć wolny reagent sprzężony z biotiną i zmniejszyć tło barwienia.
   2. Zawieś komórki w 98 µL bufora. Dodaj 2 µL ficoerytryny (PE) oznaczonego przeciwciała wtórnego. Krótko wiruj, aby wymieszać. Inkubacja przez 10 min w ciemności w temperaturze pokojowej (19–25 °C).
   3. Odwiruj komórki, aby usunąć niezwiązany przeciwciało wtórne (zobacz krok 2.2.3).
4. Ostateczna przygotowanie do akwizycji
   1. Dostosuj objętość wszystkich próbek barwionych (koktajl transdukcji CAR T i koktajl ICC) do 300–500 µL buforem. Chroń próbki przed światłem i przechowuj w temperaturze 2–8 °C.
   2. Przeprowadź akwizycję w ciągu 1 h, aby zachować stabilność fluoroforu i zachować żywotność komórek.

3. Akwizycja cytometrii przepływowej i analiza danych

1. Przygotuj i przygotuj cytometr przepływowy, upewniając się, że kalibracja i ustawienia instrumentu są zoptymalizowane.
2. Włącz lasery i spłucz system płynny. Pozostawić co najmniej 30 min na rozgrzanie blatu optycznego.
3. Podczas rozgrzewania uruchom program czyszczenia z 1% roztworem hipochlorytu.
4. Użyj kulek kalibracyjnych do dostosowania ustawień laserów.
5. Przygotuj kontrole jednobarwne do kompensacji za pomocą zestawów przeciwciał dopasowanych do siebie.
   1. Dla kulek: dodaj odpowiednią objętość kul pozytywnych i ujemnych kulek kontrolnych.
   2. Dla komórek: dodaj 100 µL zawiesiny komórek.
   3. Dla reagentów sprzężonych z biotiną: uwzględnij probówkę z 98 µL buforu plus 2 µL oznaczonego przeciwciała PE wtórnego.
   4. Upewnij się, że reagenty kompensacyjne pasują do koktajlu przeciwciał (numery partii).
6. Inkuba

Wyniki

Wysuszone panele przeciwciał rekombinantowych zostały zastosowane do próbek komórek CAR⁺ T w celu zademonstrowania przepływowych procesów barwienia. Jak pokazano na Rysunku 1, zastąpienie konwencjonalnych przepływowych procesów barwienia gotowymi wysuszonymi panelami przeciwciał eliminuje kilka kroków przygotowania—w tym etykietowanie probówek (aby wskazać skład przeciwciał w panelu; każda probówka nadal wymaga odpowiedniego identyfikatora próbki), łączenie reagentów i manualne mieszanie—upraszczając w ten sposób proces barwienia. Probówki zawierają etykietę, którą można zeskanować za pomocą kompatybilnych cytometrów lub odczytać ręcznie, zapewniając elastyczne opcje identyfikacji próbek.

Przedstawione przykłady pokazują, że wysuszony panel składu komórek odpornościowych umożliwia identyfikację kluczowych podzbiorów leukocytów (Rysunek 2), podczas gdy wysuszony panel transdukcji CAR T pozwala na wizualizacje komórek T wyrażających CAR oraz ocenę transdukcji (Rysunek 3). Blokowanie Fc nie jest wymagane dla tych paneli, a tylko jedna kontrola izotypu jest potrzebna dla wszystkich przeciwciał w panelu. Przykłady te podkreślają zastosowanie wysuszonych paneli do wieloparametrycznej analizy komórek CAR T i pokazują, jak proces można przeprowadzić wydajnie z mniejszą liczbą kroków wykonywanych ręcznie. Skład wysuszonych paneli przeciwciał użytych w tym badaniu znajduje się w Tabeli 1.

Rysunek 4 ilustruje skrócenie czasu przygotowania dla reprezentatywnego eksperymentu, gdy używa się wysuszonych paneli zarówno dla mniej doświadczonych, jak i doświadczonych użytkowników. Format wysuszonych paneli upraszcza procedury barwienia, minimalizuje manualne manipulowanie i zapewnia praktyczne wskazówki do wdrożenia procesu i szkoleń. Co ważne, użycie wysuszonych koktajli przeciwciał dało częstość podzbioru komórek odpornościowych porównywalną z tą uzyskaną za pomocą konwencjonalnych koktajli w płynie (Rysunek 5). Ponadto, wysuszone panele przeciwciał są stabilne w temperaturze pokojowej i mogą być przechowywane w zwykłych warunkach przez cały rok ich trwałości, w przeciwieństwie do konwencjonalnych przeciwciał w płynie, które zwykle wymagają chłodnego przechowywania. Ta stabilność wspiera wielokrotne użycie, badania długoterminowe i uproszczoną zarządzaniem zapasami.

Podsumowując, przedstawione przykłady pokazują, jak wysuszone panele przeciwciał rekombinantowych mogą być użyte do uproszczenia wieloparametrycznej charakteryzacji komórek CAR T. Ogólnie, praca ta przedstawia praktyczne podejście do wdrożenia wysuszonych paneli przeciwciał w analizie komórek CAR T opartej na przepływom cytometrycznych, z uproszczonym obsługiwaniem, zmniejszoną liczbą kroków przygotowania i dostosowywalnymi konfiguracjami paneli.

Rysunek 1: Porównanie manualnego procesu barwienia i wysuszonych paneli przeciwciał rekombinantowych. Tradycyjny manualny proces (góra) obejmuje wiele kroków przygotowania, w tym etykietowanie probówek, łączenie i mieszanie reagentów oraz dodawanie próbek, co może zwiększyć wysiłek manualny. W przeciwieństwie do tego, proces z wysuszonymi panelami przeciwciał rekombinantowych (dół) używa gotowych, wysuszonych paneli, które wymagają tylko dodania próbki. Ten uproszczony proces zmniejsza kroki manualne i upraszcza proces barwienia, ilustrując efektywność procesu i praktyczne wdrożenie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza przepływowa cytometryczna próbki leukoferezy barwionej wysuszonym panelem przeciwciał rekombinantowych “Koktajl Składu Komórek Odpowiedzi Immunitarnej”. (A) Bruzda została wykluczona przez bramy na FSC względem SSC, aby uwzględnić wszystkie komórki. (B) Podwójne komórki zostały usunięte za pomocą bramy FSC-A względem FSC-H. (C) Leukocyty zostały zidentyfikowane przez bramy na komórkach CD45⁺, pozwalając na wykluczenie pozostałych erytrocytów. (D) Martwe komórki zostały wykluczone za pomocą barwienia 7-AAD. (E,F) Komórki CD3⁺ zostały zidentyfikowane i dalsze sklasyfikowane na (E) komórki T i (F) NKT na podstawie ekspresji CD56. (G) Komórki T zostały następnie podzielone na podzbiory CD4⁺ i CD8⁺. (H) W populacji CD3^–, komórki monocytarne zostały zdefiniowane przez ekspresję CD14, a komórki B przez ekspresję CD19. (I

Dyskusja

Wysuszone panele przeciwciał rekombinowanych zapewniają efektywny i praktyczny przepływ pracy w charakteryzowaniu komórek CAR T w laboratorium. Preformułowana forma zmniejsza kroki przygotowawcze i upraszcza obsługę, pomagając ograniczyć zależność od operatora i wspierając spójne wykonywanie wieloprzestrzennych procedur cytometrii przepływowej⁸. Reprezentatywne przykłady ilustrują zastosowanie tych paneli do identyfikacji podzbiorów leukocytów, wykrywania ekspresji CAR oraz oceny podzbiorów limfocytów T. Panele mogą być również uzupełnione o dodatkowe przeciwciała sprzężone z cieczami, aby uwzględnić dodatkowe markery lub podzbiory immunologiczne, umożliwiając elastyczną adaptację do określonych potrzeb eksperymentalnych lub analiz o większej liczbie parametrów.

Dokładne wykrywanie CAR jest kluczowe dla niezawodnego określenia częstotliwości transdukcji¹. Wyraźne oddzielenie populacji CAR-ujemnych i CAR-dodatnich zależy od odpowiednio zoptymalizowanych warunków barwienia, szczególnie gdy poziomy ekspresji CAR się różnią. Kontrole, takie jak próbki fluorescence-minus-one (FMO), mogą wspierać dokładne bramkowanie. W niektórych przypadkach kroki mycia mogą poprawić dyskryminację poprzez usunięcie niezwiązanych przeciwciał; jednak, kroki te mogą zmniejszać odzyskiwanie komórek z powodu utraty komórek podczas wirowania i aspiracji. Dlatego preferowane mogą być przepływy bez mycia, gdy wymagana jest dokładna liczba komórek.

Mimo że idealnie podejście korzysta z specyficznego dla CAR reagentu wykrywającego domeny zewnętrzne z inżynierii CAR, alternatywne reagenty, takie jak przeciwciała skierowane na zachowane regiony łącznikowe między domenami wiązania antygenu i sygnalizującymi, mogą być również zastosowane. Te alternatywy umożliwiają wykrywanie komórek ekspresujących CAR i mogą być włączone do przepływów, gdzie reagenty specyficzne dla CAR nie są dostępne, z odpowiednią optymalizacją.

Integracja z zautomatyzowanymi systemami pozyskiwania i analizy, w tym trybem Express, może dodatkowo uprościć zbieranie i analizę danych, zmniejszając czas poświęcony na pracę i umożliwiając spójne wykonywanie przepływów przez różnych operatorów.

Mimo że niniejsza praca ilustruje metodę, formalna walidacja dla regulowanej produkcji lub testów wypuszczania nie została przeprowadzona. Walidacja wieloośrodkowa nie została jeszcze przeprowadzona, więc powtarzalność w laboratoriach pozostaje do potwierdzenia⁵. Podejście opiera się na preformułowanych panelach, co może ograniczać elastyczność dla wysoce specjalistycznych zastosowań. Jednakże, opcje niestandardowych wysuszonych paneli mogą być zaprojektowane, aby uwzględnić określone markery lub kombinacje, umożliwiając dostosowany przepływ pracy i pokonując ograniczenia standardowych paneli. Rozważania kosztowe są w dużej mierze zrównoważone przez zmniejszony czas poświęcony na pracę i uproszczone procedury, co może być szczególnie korzystne w przepływach pracy wysokowydajnościowych.

Przyszła praca mogłaby skupić się na ocenach wydajności ilościowej, formalnej walidacji do użytku regulowanego oraz rozszerzeniu na badania wieloośrodkowe, aby ocenić spójność przepływu pracy w laboratoriach. Niestandardowy projekt panelu reprezentuje praktyczną ścieżkę dla rozszerzenia pokrycia markerami, rozwiązywania unikalnych pytań eksperymentalnych lub adaptacji do longitudinalnych badań immunomonitoringu.

Podsumowując, wysuszone panele przeciwciał rekombinowanych zapewniają elastyczną i praktyczną platformę dla cytometrii przepływowej komórek CAR T. Zmniejszają kroki przygotowawcze, upraszczają przepływy pracy i wspierają elastyczny projekt eksperymentu, w tym niestandardowe konfiguracje paneli.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(Opcjonalnie) Biotin Antibody, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-951	Potrzebne tylko jeśli używane jest Biotin-koniugowane CAR Detection Reagent.
(Opcjonalnie) CAR T Cell Express Mode Package	Miltenyi Biotec	160-002-376	Dodatek oprogramowania dla MACSQuant Analyzers; umożliwia zautomatyzowane gating i analizę danych, choć możliwa jest również analiza ręczna.
CAR Detection Reagent do wyboru wykrywalny w kanale PE, np. CD19 CAR Detection Reagent, ludzki, Biotin	Miltenyi Biotec	130-129- 550	Alternatywne opcje: CD19 CAR FMC63 Idiotype Antibody, PE, REAfinity (130-127-342); CD22 CAR Detection Reagent, ludzki, Biotin (130-126-727); BCMA CAR Detection Reagent, ludzki, PE (130-133-888)
Flow cytometer, np. MACSQuant Analyzer 16	Miltenyi Biotec	130-109-803	Rurki StainExpress są kompatybilne ze wszystkimi standardowymi cytometrami przepływowymi.
StainExpress CAR T Transduction Cocktail, ludzki	Miltenyi Biotec	130-127-638	Niestandardowe konfiguracje paneli przeciwciał suszonych można zamówić poprzez lokalnego przedstawiciela Miltenyi Biotec lub zespół wsparcia technicznego.
StainExpress Immune Cell Composition Cocktail, ludzki	Miltenyi Biotec	130-127-637	Niestandardowe konfiguracje paneli przeciwciał suszonych można zamówić poprzez lokalnego przedstawiciela Miltenyi Biotec lub zespół wsparcia technicznego.