Wielokanałowa cytometria przepływowa oparta na koralikach do profilaktyki funkcjonalnej komórek CAR T

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia wielofunkcyjną metodę opartą na korzystaniu z mikrocząstek do citomtryi przepływowej, służącą do ilościowego wyznaczania do 12 cytokin i cząszek efektorowych z nadstanów komórek chimerycznych receptorów antygenowych (CAR), co umożliwia szybkie, powtarzalne analizy funkcji inżynieryjnych komórek T przy użyciu małych objętości próbek.

Streszczenie

Profilowanie komórek CAR T stanowi wyzwanie ze względu na ich niejednorodność, złożone reakcje immunologiczne i ograniczoną dostępność próbek. Testy wielokrotne umożliwiają ocenę funkcjonalną poprzez jednoczesne wykrywanie szerokiego zakresu cząstek efektorowych, w tym cytokin, chemokin i czynników cytotoksycznych. W niniejszym opracowaniu opisano przeznaczony do cytometrii przepływowej test wielokrotny oparty na kulkach, służący do analizy wydzielania cząstek efektorowych przez ludzkie komórki CAR-T. Nadstany komórek CAR T są inkubowane z mieszaniną kulek uchwytujących, zawierających wiele populacji zakodowanych fluorescencyjnie, sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla anality. Te kulki wiążą rozpuszczalne cele w próbce, tworząc kompleksy kula-analyt, które następnie są wykrywane za pomocą oznaczonych przeciwciał detekcyjnych. Test obejmuje panel czynników immunologicznych takich jak interferon (IFN)-γ, interleukina (IL)-2, czynnik nekrozujący guz (TNF)-α, IL-6, IL-10, granulocytarno-makrofagowy czynnik stymulujący kolonie (GM-CSF) oraz Granzym B. Zastosowanie wcześniej określonych standardów umożliwia ilościowe pomiary wielu anality z pojedynczej próbki. Pozyskiwanie i analizę danych można przeprowadzić za pomocą zautomatyzowanych podejść do bramkowania dostarczonych przez oprogramowanie związane z urządzeniami lub narzędzia internetowe, ułatwiając przetwarzanie danych. Podsumowując, przedstawiony test wielokrotny umożliwia wieloparametryczną analizę funkcjonalności komórek CAR T i może być stosowany w kontekstach takich jak badania, testy kontroli jakości, badania mechanizmu działania oraz charakterystyka funkcjonalna.

Wprowadzenie

Charakterystyka funkcjonalna jest niezbędna w badaniach komórek T z chimerycznym receptorem antygenu (CAR), ponieważ dostarcza informacji na temat skuteczności, bezpieczeństwa i mechanizmów działania tych terapii. Zrozumienie sygnatur cytokin i cytotoksycznych mediatorów pomaga w ocenie skuteczności terapeutycznej i potencjalnych działań niepożądanych, zapewniając opracowanie bezpiecznych i skutecznych terapii. Tradycyjne pojedyncze testy, takie jak enzymatyczne testy immunosorbentowe (ELISA), mają ograniczenia, takie jak wysokie wymagania dotyczące objętości próbek, długi czas przetwarzania i oddzielne uruchomienia dla każdego analitu, oferując jednocześnie ograniczony zakres dynamiczny w pojedynczych próbkach^1,2. W przeciwieństwie do nich, wielokanałowe testy na perłach umożliwiają jednoczesne wykrywanie wielu rozpuszczalnych mediatorów, zmniejszając czas przetwarzania i wymagania dotyczące próbek, jednocześnie zwiększając zakres dynamiczny^1,2. Ta efektywność i głębokość analizy czynią testy wielokanałowe cennym narzędziem do rozwoju badań i rozwoju CAR T komórek^3,4,5.

Przedstawiony w niniejszym badaniu test wielokanałowy wykorzystuje perły do przechwytywania, które wykazują zdefiniowane profile fluorescencji w kanałach fluoresceiny izotiocyjanianu (FITC) i fykoerytryny (PE) i są pokryte specyficznymi przeciwciałami przeciwko rozpuszczalnym analitom. Podczas inkubacji z próbką, te perły selektywnie wiązają swoje docelowe anality z roztworu. Po przechwyceniu analitu dodaje się przeciwciała wykrywające, aby utworzyć złożone kompleksy odpowiednie dla konkretnego analitu. Te przeciwciała są bezpośrednio sprzężone z alofikokjaniną (APC) (bezpośrednie wykrywanie) lub z biotinem (niebezpośrednie wykrywanie). W przypadku niebezpośredniego wykrywania wymagana jest kolejna inkubacja z przeciwciałem przeciwko biotinie sprzężonym z APC (Rysunek 1). Powstałe kompleksy – obejmujące perły do przechwytywania, anality i przeciwciała wykrywające – są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia stężeń analitów. Test wielokanałowy jest technologią opartą na płytkach, obejmującą wstępnie zdefiniowane standardy używane do generowania krzywych standardowych dla poszczególnych analitów^1,2.

Rysunek 1: Zasada technologii cytokin i przebieg testu. Test opiera się na 12 populacjach pereł z kodami fluorescencyjnymi sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla analitów. Po inkubacji z próbką tworzą się kompleksy perła-analit, które mogą być wykrywane za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu specyficznych przeciwciał wykrywających. Przebieg testu obejmuje 1) przygotowanie standardów analitów i próbek interesujących na płytce filtracyjnej, 2) inkubację z perłami do przechwytywania, 3) inkubację z przeciwciałami przeciwko analitowi sprzężonym z biotinem w celu utworzenia złożonych kompleksów, 4) inkubację z przeciwciałami przeciwko biotinie sprzężonym z APC, 5) resuspendowanie w buforze do pomiaru oraz 6) pobieranie próbek. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Opisany w niniejszym badaniu test wielokanałowy jest kompatybilny ze standardowymi cytometrami przepływowymi wyposażonymi w niebieską (np. 488 nm; kanały FITC i PE) i czerwoną wiązkę laserową (np. 635 nm; kanał APC). Ponieważ cytometry przepływowe są powszechnie dostępne w laboratoriach badawczych, środowiskach klinicznych i środowiskach kontroli jakości, ta kompatybilność ułatwia wdrożenie bez konieczności dodatkowego specjalistycznego sprzętu⁵. W kontekście badań funkcjonalności CAR T komórek, to podejście umożliwia wieloparametryczną ocenę reakcji funkcjonalnych w powszechnie dostępnych procesach analitycznych⁶. Test oferuje znaczne zalety dla badań CAR T komórek, umożliwiając jednoczesne ilościowe określenie kluczowych analitów, w tym GM-CSF, Granzym B, interferon (IFN)-α, interleukina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, białko chemotaktyczne dla monocytów-1 (MCP-1), perforyna i czynnik nekrozujący guz (TNF)-α (ludzki panel cytotoksyczności). Mediatory te są krytyczne dla zrozumienia aktywacji CAR T komórek, funkcji efektorowej i uwolnienia cytokin związanego z bezpieczeństwem^4,5,7,8.

Przebieg testu obejmuje opcje automatycznego bramkowania i analizy danych za pomocą oprogramowania skojarzonego z urządzeniem oraz niezależnych od urządzenia, internetowych narzędzi analitycznych⁵. Te funkcje wspierają efektywne przetwarzanie danych profilowania cząstek

Protokół

Wszystkie próbki ludzkie zostały pobrane od anonimowych, zdrowych ochotników po uzyskaniu pisemnej zgody. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny Izby Lekarskiej Nadrenii Północnej (#2020272) i przeprowadzone zgodnie z wymaganymi regulacjami etycznymi i dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.

1. Kospołkultura komórek CAR T

1. Przygotuj kulturę komórek inżynieryjnie zmodyfikowanych ludzkich komórek CAR T bez antygenu kognitywnego i w jego obecności, np. komórek nowotworowych prezentujących antygen w proporcji 2,5:1 (efektor : komórki docelowe).
2. Określ jeden lub wiele punktów czasowych pobrania supernatantu w celu analizy wydzielanych cytokin raz lub analizy kinetyki cytokin w określonym przedziale czasowym, np. po 4, 8, 16, 24 i 48 godzinach.
   UWAGA: Supernatants mogą być używane bezpośrednio lub mogą być zamrożone na późniejsze użycie.

2. Przygotowanie standardu i próbki

1. Odzyskaj standard analityczny dodając 200 μL buforu lub pożywki do kultury komórkowej do pelletu i delikatnie wymieszaj. Przygotuj sześć rurek z reagentami i wykonaj 1:5 serię rozcieńczeń odzyskiwanego standardu, do 3,2 pg/mL lub 0,6 pg/mL (w zależności od anality), i przygotuj próbkę blank.
2. Zbierz supernatanty kospołkultur CAR T, na przykład 16 h lub 24 h po kospołkulturze. Opcjonalnie zebrać komórki CAR T do równoległego fenotypowania za pomocą cytometrii przepływowej.
3. Wiruj próbki przez 10 min w temperaturze 4°C przy 10 000 × g . Użyj supernatantów w stanie surowym lub rozcieńcz je tak, aby pasowały do zakresu krzywej standardowej.

3. Przebieg testu

1. Zmiksuj mieszankę kul z przechwytywaniem, aby dokładnie je resuspendować. Dodaj 50 μL standardu lub próbki, wraz z 20 μL wstępnie rozcieńczonych kulek, do dołków płytki 96-dołkowej z filtrem.
2. Inkubację przez 2 h w temperaturze pokojowej, mieszając z 450 rpm, w ciemności. Dwa razy spłucz dołki z 200 μL buforu za pomocą manifoldu próżniowego lub wirówki.
3. Dodaj 100 μL 1:50 wstępnie rozcieńczonego reagentu wykrywającego 1 (w buforze). Inkubację przez 1 h w temperaturze pokojowej, mieszając z 450 rpm, w ciemności. Dwa razy spłucz.
4. Dodaj 100 μL 1:50 wstępnie rozcieńczonego reagentu wykrywającego 2 (w buforze). Inkubację przez 30 min w temperaturze pokojowej, mieszając z 450 rpm, w ciemności. Raz spłucz.
5. Do akwizycji, resuspenduj próbki w 200 μL buforu. Przegląd przebiegu testu jest przedstawiony na Rysunku 1.

4. Nabywanie i analiza danych

1. Nabywaj dane na cytometrze przepływowym wyposażonym w niebieskie i czerwone lasery (wymagane są kanały PE, FITC i APC). Podczas pracy z cytometrami przepływowymi MACSQuant, używaj szablonów Trybu Ekspresowego dla w pełni zautomatyzowanego bramkowania i analizy danych.
2. Alternatywnie, wgraj pliki danych FSC lub MQD do narzędzia internetowego InspectoR, które wykonuje zautomatyzowane pomiary ilościowe cytokin i zapewnia gotowe do eksportu wyniki niezależne od używanego instrumentu.
3. Upewnij się, że sprawdziłeś prawidłowe rozdzielenie 12 różnych populacji kulek przechwytujących w kanałach FITC i PE.
4. Zastosuj krzywą standardową, aby obliczyć stężenia cytokin, i eksportuj oraz wizualizuj wyniki.
5. W celu nabywania danych na cytometrze przepływowym MACSQuant, użyj 2D kodu kreskowego flakonu z kulkami przechwytującymi, który zawiera wszystkie istotne ustawienia nabywania.
   1. Po zalogowaniu się do oprogramowania, wybierz MACSPlex Filter Plate jako półkę próbek i kliknij przycisk Kod kreskowy na pasku narzędzi, aby aktywować czytnik 2D kodów.
   2. Podaj flakon do czytnika, upewniając się, że kod jest skierowany w stronę migającego światła na optymalnej odległości 0,5–2,5 cm.
   3. Na karcie Autolabel, przypisz Capture Beads (MPx Cyt T-NK,h) i NoLabel. Dla szeregowych rozcieńczeń standardu komórek cytotoksycznych T/NK, zdefiniuj pozycje grup i na karcie Ustawienia, wybierz Tryb Ekspresowy z Rodzajem: Analiza i Tryb: MACSPlex_Standard, stosując delikatne mieszanie, jeśli to konieczne.
   4. Nieznane próbki są przypisywane w podobny sposób, z określonymi pozycjami, opcjonalnym grupowaniem i wybraniem Trybu Ekspresowego, Rodzaju: Analiza i Trybu: MACSPlex_Próbka na karcie Ustawienia, w tym opcjonalnymi identyfikatorami próbek i opisami.
   5. Upewnij się, że definicje półek są poprawne w tabeli Eksperyment, upewnij się prawidłowych poziomów płynu w dołkach płytki z fil

Wyniki

Identyfikacja reprezentatywnych populacji kulek Capture kodujących 12 rozpuszczalnych anality

Populacje kulek Capture zostały zidentyfikowane za pomocą kanałów FITC i PE cytometru przepływowego. Wyraźnie rozdzielone klastry kulek reprezentujące poszczególne anality zostały wyraźnie rozpoznane na wykresie dwuosiowym, w tym IL-10, Granzyma B, MCP-1, IL-17A, Perforyna, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4 i GM-CSF (Rysunek 2). Każda populacja wykazywała unikalny podpis fluorescencyjny, potwierdzając skuteczne wielokrotne wykrycie i jasne rozróżnienie mierzonych cytokin i cząstek efektorowych.

Rysunek 2: Wykrywanie reprezentatywnych populacji kulek Capture wielokrotnego. Kulki Capture zawierają naturalne intensywności fluorescencji, które mogą być używane do rozróżnienia różnych populacji specyficznych dla analizy. Wykres rozproszenia pokazuje separację sygnałów specyficznych dla analizy na podstawie intensywności fluorescencji w kanałach FITC (B1) i PE (B2). Obraz przedstawia reprezentatywny profil 12 populacji kulek Capture kodujących GM-CSF, Granzymę B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, MCP-1 (CCL2), Perforynę i TNF-α. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Reprezentatywny profil stężenia cytokin komórek CAR T po współhodowli z komórkami nowotworowymi

Po współhodowli komórek CAR T z komórkami docelowymi nowotworowymi, stężenia cytokin zostały określone za pomocą ludzkiego panelu cytotoksyczności testu wielokrotnego (Rysunek 3). Komórki CAR T wydzielały wysokie poziomy Granzymy B (49 950,2 pg/mL), IFN-γ (48 367,8 pg/mL), TNF-α (7 055,2 pg/mL) i GM-CSF (6 653,5 pg/mL), co wskazuje na potężną aktywację i funkcję efektorów cytotoksycznych w odpowiedzi na styczność z nowotworem. Poziom IL-2 przekraczał górną granicę wykrywalności (>10 000 pg/mL), co jest zgodne z silnym sygnałem proliferacyjnym. Próbka nie była dalej rozcieńczana ani ponownie mierzona. Natomiast cytokiny związane z regulacyjnymi lub alternatywnymi odpowiedziami limfocytów T pomocniczych, w tym IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 i MCP-1, były obecne na niskich lub prawie niewykrywalnych poziomach. Wyniki te sugerują, że komórki CAR T wywołały przeważająco typ 1 (Th1/cytotoksyczny) odpowiedź immunologiczną charakteryzującą się wysoką aktywnością efektorów i ograniczonym wytwarzaniem cytokin immunosupresyjnych.

Rysunek 3: Reprezentatywny profil cytokin komórek CAR T po współhodowli z komórkami nowotworowymi. Inżynieryjne komórki T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) były współhodlowane przez noc z komórkami nowotworowymi JeKo-1. Po 16 godzinach inkubacji pobrane zostały nadstany kultur komórkowych i wyśrodkowane w celu usunięcia cząstek. Rozcieńczone próbki zostały przeanalizowane za pomocą ludzkiego panelu cytotoksyczności testu wielokrotnego. Przeprowadzono dwie krzywe standardowe i określono stężenia wszystkich 12 anality. Przedstawiono reprezentatywny wynik danych dla analizy i obliczeń stężeń specyficznych dla analizy przy użyciu trybu Express cytometru przepływowego. Wykres słupkowy i towarzysząca mu tabela pokazują obliczone poziomy (pikogram/mililitra) 12 cząstek efektorowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kinetik selekcji cytokin komórek CAR T po stymulacji antygenowo-specyficznej

Po współhodowli komórek CAR T z komórkami docelowymi ekspresującymi (Antygen⁺) lub pozbawionymi (Antygen⁻) odpowiedniego antygenu, sekrecja cytokin była monitorowana w czasie za pomocą ludzkiego panelu cytotoksyczności testu wielokrotnego. Komórki CAR T wykazywały szybkie i mocne uwalnianie cytokin po rozpoznaniu docelowców Antigen⁺, ze znacznym wzrostem poziomów Granzymy B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF i IL-2 w ciągu 8–24 godzin, osiągając szczytowe poziomy po 48 godzinach (Rysunek 4). Ten wzorzec wskazuje na potężną aktywację i funkcję efektorów cytotoksycznych po nawiązaniu kontaktu z antygenem. Obserwowano również umiarkowany wzrost IL-6, IL-17A i IL-21, podczas gdy IL-4, IL-10, MCP-1 i Perforyna pozostawały na niskim lub umiarko

Dyskusja

Test multipleksowy został zastosowany do profilowania rozpuszczalnych odpowiedzi mediatorów odpornościowych w kulturach współhodowanych komórek CAR T. Komórki CAR T współhodowanie z komórkami docelowymi dodatnimi dla antygenu wykazywały zwiększoną sekrecję IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, Granzymy B i IL-2, co jest zgodne z aktywacją efektorów i funkcją cytotoksyczną^4,5,8. W przeciwieństwie do kontroli ujemnych dla antygenu, które wykazywały niską produkcję cytokin, co pokazuje zdolność testu do rozróżniania odpowiedzi specyficznych dla antygenu w badanych warunkach^5,8. Wyniki te potwierdzają przydatność testu do oceny czynności komórek CAR T, w tym do zastosowań w analizie związanej z aktywnością, profilowaniem związanym z bezpieczeństwem i badaniami mechanizumu działania.

Chociaż stały panel 12 analitów zapewnia ogólny przegląd aktywności odpornościowej komórek CAR T, może nie być praktyczne wychwytywanie pełnej gamy analitów we wszystkich zastosowaniach. Dla skupionych przepływów pracy, takich jak walidacja testu czy testowanie kontroli jakości (QC) produktów komórek CAR T, panel można zmniejszyć do ograniczonego podzbioru (np. IL-2, IFN-γ i TNF-α), aby usprawnić analizę, zachowując czułość funkcjonalną^1,2.

Kluczowe kroki w protokole obejmują projekt kultury współhodowania komórek CAR T i odpowiedni wybór warunków pobierania próbek. W szczególności czas współhodowania i liczba komórek efektorowych (stosunek E:T) bezpośrednio wyznaczają wielkość cytokin i powinny być określone podczas konfiguracji testu^5,6. Ponadto należy dostosować rozcieńczenie próbki, aby upewnić się, że stężenia analitów znajdują się w zakresie dynamicznym testu^1,2. Dlatego rozwiązywanie problemów powinno skupiać się na weryfikacji wydajności krzywej standardowej i dostosowywaniu warunków współhodowania lub czynników rozcieńczania, jeśli sygnały wypadają poza zakres ilościowy^1,2.

W porównaniu z tradycyjnymi pojedynczymi testami ELISA, platforma multipleksowa oparta na cytometrii przepływowej generuje dane z wysokim zagęszczeniem, wieloanalitowe z minimalnych objętości próbek. Umożliwiając jednoczesne pomiary wielu analitów w pojedynczej próbce, multipleksowanie może zmniejszyć ogólne zużycie odczynników, zwiększyć wydajność próbek i skrócić czas testu w porównaniu z wykonywaniem wielu pojedynczych testów^1,2. Zautomatyzowane opcje pozyskiwania i standaryzowane opcje analizy mogą potencjalnie zmniejszyć zmienność zależną od użytkownika i wspierać powtarzalność i skalowalność w różnych ustawieniach eksperymentalnych lub produkcyjnych^5,8. Standardowa wrażliwość wykrywania ELISA zazwyczaj waha się od 16 do 2000 pg/mL (może być niższa dla zestawów wysokiej czułości)⁷. W ramach platformy przedstawionej w niniejszym badaniu, najniższe wykrywalne stężenia wahały się od 0,05 pg/mL dla najbardziej wrażliwych analitów do około 93,8 pg/mL dla tych o zasadniczo niższej czułości testu. W ramach wewnętrznych ocen ponad 74% zmierzonych analitów wykazywało granice wykrywalności poniżej 5 pg/mL, a 38% było wykrywalne poniżej 1 pg/mL, co podkreśla ogólną wrażliwość systemu. Ponieważ wrażliwość multipleksowa może różnić się w zależności od cytokin, potencjalna konkurencja epitopów pozostaje ważnym czynnikiem. Aby zminimalizować takie zakłócenia, test wykorzystuje nie nakładające się epitopy do wychwytywania i wykrywania każdego anality, zmniejszając tym samym stronniczość związaną z konkurencją i poprawiając niezawodność pomiaru w warunkach multipleksowych.

Wydajność testu multipleksowego może różnić się w zależności od analitów, w zależności od wrażliwości testu i kontekstu biologicznego, a pod pewnymi warunkami stężenia analitów mogą zbliżać się do górnej granicy wykrywalności i powinny być zatem oceniane podczas konfiguracji testu. Z kolei niektóre anality (np. MCP-1 i IL-4 w niniejszym badaniu) mogą pozostać niewykrywalne w zależności od warunków eksperymentalnych. Ponadto czynniki przedanalizyczne, takie jak obsługa próbek, mogą wpływać na pomiary cytokin, a spójne warunki przetwarzania powinny być utrzymywane, aby zapewnić możliwość porównania.

Ogólnie rzecz biorąc, to podejście multipleksowe umożliwia wydajną i ilościową charakteryzację czynności komórek CAR T. W porównaniu z większością istniejących platform wieloanalitowych wykrywania cytokin, test jest kompatybilny ze standardowymi cytometrami przepływowymi i zawiera narzędzie oprogramowania związane z urządzeniem, które ułatwia pozyskiwanie i analizę danych. Chociaż wieloanalitowe wykrywanie cytokin było stosowane w innych ustawieniach immunologicznych, niniejsza pra

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human	Miltenyi Biotec	130-125-800	Test wieloplexowy oparty na mikrokroplach cytokin do cytometrii przepływowej
MACSPlex InspectoR Tool	Miltenyi Biotec	\	Narzędzie internetowe do zautomatyzowanego bramkarstwa i analizy danych MACSPlex
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-096-343	Urządzenie do cytometrii przepływowej wielopleksowych pomiarów danych
MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-109-803	Urządzenie do cytometrii przepływowej wielopleksowych pomiarów danych
MACSQuant Express Mode	Miltenyi Biotec	\	Oprogramowanie do zautomatyzowanego bramkarstwa i analizy
TexMACS Medium	Miltenyi Biotec	130-097-196	Optymalizowany wolny od surowicy środek do hodowli komórek przeznaczony do hodowli i ekspansji ludzkich i mysiech komórek T