Przetłumacz na język polski, zachowując dokładnie wszystkie tagi HTML i formatowanie. Wypisz tylko tłumaczenie. Test cytometrii przepływowej oparty na koralikach do profilaktyki funkcjonalnej komórek CAR T

Summary

Ten artykuł przedstawia wielofunkcyjną metodę opartą na korzystaniu z mikrosfer w cytometrii przepływowej do ilościowego określania do 12 cytokin i cząstek efektorowych z nadstanów komórek chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T, umożliwiając szybką, powtarzalną analizę funkcjonalności inżynieryjnych komórek T przy użyciu małych objętości próbek.

Abstract

Profiling komórek CAR T stwarza wyzwania z powodu ich heterogeniczności, złożonych reakcji immunologicznych i ograniczonej dostępności próbek. Testy wielokrotne umożliwiają ocenę funkcjonalną poprzez jednoczesne wykrywanie szerokiego zakresu cząstek efektorowych, w tym cytokin, chemokin i cytotoksycznych mediatorów. Przedstawiamy tutaj bead-based multiplex assay kompatybilny z cytometrią przepływową do analizy sekrecji cząstek efektorowych przez ludzkie komórki CAR-T. Nadstany komórek CAR T są inkubowane z mieszaniną kulek zdobywczych obejmujących wiele populacji kodowanych fluorescencyjnie, sprzężonych ze specyficznymi dla analityk przeciwciałami. Kulki te wiążą rozpuszczalne cele w próbce, tworząc kompleksy kula-analyt, które następnie są wykrywane za pomocą oznaczonych przeciwciał wykrywczych. Test obejmuje panel mediatorów immunologicznych, takich jak interferon (IFN)-γ, interleukina (IL)-2, czynnik nekrozujący guz (TNF)-α, IL-6, IL-10, granulocytowo-makrofagowy czynnik stymulujący kolonie (GM-CSF) i Granzym B. Stosowanie wstępnie określonych standardów pozwala na ilościowe pomiary wielu analityków z jednej próbki. Zbieranie i analiza danych może być przeprowadzona za pomocą zautomatyzowanych podejść do bramki, dostarczonych przez oprogramowanie związane z urządzeniem lub narzędzia internetowe, ułatwiając przetwarzanie danych. Podsumowując, przedstawiony test wielokrotny umożliwia wieloparametrową analizę funkcjonalności komórek CAR T i może być stosowany w kontekstach takich jak badania, testy kontroli jakości, badania mechanizmu działania i charakterystyka funkcjonalna.

Introduction

Charakteryzacja funkcjonalna jest niezbędna w badaniach komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR), ponieważ dostarcza informacji na temat siły działania, bezpieczeństwa i mechanizmów działania tych terapii. Zrozumienie sygnatur cytokin i cytotoksycznych mediatorów pomaga w ocenie skuteczności terapeutycznej i potencjalnych działań niepożądanych, zapewniając rozwój bezpiecznych i skutecznych leków. Tradycyjne pojedyncze testy, takie jak testy immunosorbentowe (ELISA), mają ograniczenia, takie jak wysokie objętości próbek, długi czas przetwarzania i oddzielne przebiegi dla każdego analitu, oferując jednocześnie ograniczony zakres dynamiczny w pojedynczych próbkach^1,2. W przeciwieństwie do nich, wielokanałowe testy oparte na perłach umożliwiają jednoczesne wykrywanie wielu rozpuszczalnych mediatorów, skracając czas przetwarzania i wymagania dotyczące próbek, jednocześnie zwiększając zakres dynamiczny^1,2. Ta efektywność i głębokość analizy czynią wielokanałowe testy cennym narzędziem do rozwoju badań nad komórkami T CAR^3,4,5.

Prezentowany w niniejszym badaniu test wielokanałowy wykorzystuje perły do chwytania, które wykazują zdefiniowane profile fluorescencji w kanałach fluoresceiny izotiocyjanianu (FITC) i fikocyjanyny (PE) i są pokryte specyficznymi przeciwciałami przeciwko rozpuszczalnym analitom. Podczas inkubacji z próbką, perły selektywnie wiążą swoje docelowe anality z roztworu. Po uchwyceniu analitów, dodawane są przeciwciała detekcyjne w celu utworzenia kompleksów typu "kanapka" specyficznych dla analitów. Przeciwciała te są bezpośrednio sprzężone z alofikocyjaninę (APC) (bezpośrednie wykrywanie) lub z biotyną (pośrednie wykrywanie). W przypadku pośredniego wykrywania wymagana jest kolejna inkubacja z przeciwciałem anty-biotynowym sprzężonym z APC (Rysunek 1). Powstałe kompleksy – obejmujące perły do chwytania, anality i przeciwciała detekcyjne – są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu ilościowego oznaczenia stężeń analitów. Test wielokanałowy jest technologią opartą na płytkach, obejmującą wstępnie zdefiniowane standardy używane do generowania krzywych standardowych specyficznych dla analitów^1,2.

Rysunek 1: Zasada technologii cytokin i przebieg testu. Test opiera się na 12 populacjach pereł z kodowaniem fluorescencyjnym sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla analitów. Po inkubacji próbki tworzą się kompleksy perła-analit, które mogą być wykryte za pomocą cytometrii przepływowej za pomocą specyficznych przeciwciał detekcyjnych. Przebieg testu obejmuje 1) przygotowanie standardów analitów i próbek interesujących na płytce filtracyjnej, 2) inkubację z perłami do chwytania, 3) inkubację z przeciwciałami anty-analit sprzężonymi z biotyną w celu utworzenia kompleksów typu "kanapka", 4) inkubację z przeciwciałami anty-biotynowym sprzężonymi z APC, 5) resuspendowanie w buforze do pomiaru i 6) nabywanie próbek. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Prezentowany w niniejszym badaniu test wielokanałowy jest kompatybilny ze standardowymi cytometrami przepływowymi wyposażonymi w niebieską (np. 488 nm; kanały FITC i PE) i czerwoną wiązkę laserową (np. 635 nm; kanał APC). Ponieważ cytometry przepływowe są powszechnie dostępne w laboratoriach badawczych, środowiskach klinicznych i środowiskach kontroli jakości, taka kompatybilność ułatwia wdrożenie bez konieczności dodatkowego specjalistycznego sprzętu⁵. W kontekście badania funkcjonalności komórek T CAR, podejście to umożliwia wieloparametryczną ocenę odpowiedzi funkcjonalnych w ramach powszechnie dostępnych przepływów analitycznych⁶. Test oferuje znaczne zalety dla badań nad komórkami T CAR, umożliwiając jednoczesne ilościowe oznaczenie kluczowych analitów, w tym GM-CSF, Granzym B, interferon (IFN)-γ, interleukina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, monocytowy białko chemotaktyczne-1 (MCP-1), Perforina i czynnik nekrozujący guz (TNF)-α (ludzki panel cytotoksyczności). Mediatory te mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia aktywacji komórek T CAR, funkcji efektorowej i bezpieczeństwa związanego z uwalnianiem cytokin^4,5,7,8.

Przebieg testu obejmuje opcje automatycznego bramkowania i analizy danych przy użyciu oprogramowania skojarzonego z urządzeniem, a także niezależnych od urządzenia narzędzi analitycznych opartych na Internecie⁵. Funkcje te wspierają usprawnione przetwarzanie

Protocol

Wszystkie próbki ludzkie zostały pobrane od anonimowych, zdrowych ochotników po uzyskaniu pisemnej zgody. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny Ärztekammer Nordrhein (#2020272) i przeprowadzone zgodnie z wymaganymi przepisami etycznymi i biobezpieczeństwa.

1. Kokultura komórek CAR T

1. Przygotować kulturę komórek inżynieryjnych ludzkich komórek CAR T w obecności i bez obecności antygenu kognitywnego, np. komórek nowotworowych prezentujących antygen w proporcji 2,5:1 (efektor : komórki docelowe).
2. Zdefiniować jeden lub wiele punktów czasowych pobierania nadstanu w celu analizy wydzielanych cytokin raz, lub kinetykę cytokin w określonym przedziale czasowym, np. po 4, 8, 16, 24 i 48 h.
   UWAGA: Nadstan może być używany bezpośrednio lub może być zamrożony na późniejsze użycie.

2. Standard i przygotowanie próbek

1. Rekonstytuować standard analitu, dodając 200 μL buforu lub pożywki do kultury komórkowej do pelletu i delikatnie wymieszać. Przygotować sześć probówek z reagentem i wykonać serię rozcieńczeń 1:5 z rekonstytuowanego standardu, aż do 3,2 pg/mL lub 0,6 pg/mL (w zależności od analitu), i przygotować próbkę blankową.
2. Zebrać nadstan kokultury CAR T, na przykład 16 h lub 24 h po kokulturze. Opcjonalnie, zebrać komórki CAR T do równoległego fenotypowania za pomocą cytometrii przepływowej.
3. Wyśrodkować próbki w temperaturze 4 °C przez 10 min przy 10 000 × g. Użyć nadstanów czystych lub rozcieńczyć je do pasowania do zakresu krzywej standardowej.

3. Przebieg testu

1. Rozwirować mieszankę pereł do chwytania, aby je dokładnie resuspendować. Dodać 50 μL standardu lub próbki, wraz z 20 μL wstępnie rozcieńczonych perełek, do dołków 96-dołkowej płytki z filtrem.
2. Inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej, wstrząsając z prędkością 450 obr/min, w ciemności. Wypłukać dołki dwa razy z 200 μL buforu za pomocą zespołu próżniowego lub wirówki.
3. Dodać 100 μL 1:50 wstępnie rozcieńczonego reagentu wykrywającego 1 (w buforze). Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej, wstrząsając z prędkością 450 obr/min, w ciemności. Wypłukać dwa razy.
4. Dodać 100 μL 1:50 wstępnie rozcieńczonego reagentu wykrywającego 2 (w buforze). Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej, wstrząsając z prędkością 450 obr/min, w ciemności. Wypłukać raz.
5. Do akwizycji, resuspendować próbki w 200 μL buforu. Przegląd przebiegu testu przedstawiono na Rysunku 1.

4. Nabywanie i analiza danych

1. Nabywać dane na cytometrze przepływowym wyposażonym w niebieskie i czerwone lasery (wymagane są kanały PE, FITC i APC). Podczas pracy z cytometrami przepływowymi MACSQuant, używać szablonów Trybu Ekspresu dla w pełni zautomatyzowanego bramkowania i analizy danych.
2. Alternatywnie, przesyłać pliki danych FSC lub MQD do internetowego narzędzia InspectoR, które wykonuje zautomatyzowane pomiary ilościowe cytokin i zapewnia gotowe do eksportu wyniki niezależne od użytego instrumentu.
3. Upewnić się, że zweryfikowano prawidłowe rozdzielenie 12 różnych populacji perełek do chwytania w kanałach FITC i PE.
4. Zastosować krzywą standardową do obliczenia stężeń cytokin, eksportować i wizualizować wyniki.
5. Dla nabywania danych na cytometrze przepływowym MACSQuant, użyć 2D kodu kreskowego w fiolce z perłami do chwytania, który zawiera wszystkie istotne ustawienia nabywania.
   1. Po zalogowaniu się do oprogramowania, wybrać MACSPlex Filter Plate jako regał próbek i kliknąć przycisk Kod kreskowy na pasku narzędzi, aby aktywować czytnik 2D kodu.
   2. Przedstawić fiolkę czytnikowi, upewniając się, że kod jest skierowany w stronę migającego światła na optymalnej odległości 0,5–2,5 cm.
   3. Na karcie Autolabel, przypisać Capture Beads (MPx Cyt T-NK,h) i NoLabel. Dla seryjnych rozcieńczeń standardu komórek cytotoksycznych T/NK, zdefiniować pozycje grup i na karcie Ustawienia wybrać Tryb Ekspresu z Typem: Analiza i Modem: MACSPlex_Standard, stosując delikatne mieszanie w razie potrzeby.
   4. Nieznane próbki są przypisywane podobnie, z zdefiniowanymi pozycjami, opcjonalnym grupowaniem i wyborem Trybu Ekspresu, Typem: Analiza i Modem: MACSPlex_Próbka na karcie Ustawienia, włączając opcjonalne ID próbek i opisy.
   5. Upewnić się, że definicje regałów są poprawne w tabeli Eksperyment, że poziomy płynów w dołkach płytki filtra są właściwe, a następnie rozpocząć pomiar.

Results

Identyfikacja reprezentatywnych populacji pereł Capture kodujących 12 rozpuszczalnych analitów

Populacje pereł Capture zostały zidentyfikowane za pomocą kanałów FITC i PE cytometru przepływowego. Wyraźnie rozdzielono odrębne gromady pereł reprezentujące pojedyncze anality na wykresie dwuwymiarowy, w tym IL-10, Granzym B, MCP-1, IL-17A, Perforyna, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4 i GM-CSF (Rysunek 2). Każda populacja wykazywała unikalny sygnał fluorescencyjny, potwierdzając udane wielokrotne wykrywanie i jasne rozróżnienie mierzonych cytokin i cząstek efektorowych.

Rysunek 2: Wykrycie reprezentatywnych wielokrotnych populacji pereł Capture. Perełki Capture zawierają charakterystyczne intensywności fluorescencji, które mogą być użyte do rozróżnienia różnych populacji specyficznych dla analitów. Wykres punktowców przedstawia separację sygnałów specyficznych dla analitów na podstawie intensywności fluorescencji w kanałach FITC (B1) i PE (B2). Obraz przedstawia reprezentatywny profil 12 populacji pereł Capture kodujących GM-CSF, Granzym B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, MCP-1 (CCL2), Perforynę i TNF-α. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Reprezentatywny profil stężeń cytokin komórek CAR T po kokulturze z komórkami nowotworowymi

Po kokulturze komórek CAR T z komórkami nowotworowymi docelowymi, stężenia cytokin zostały wyznaczone za pomocą ludzkiego panelu cytotoksyczności testu wielokrotnego (Rysunek 3). Komórki CAR T wydzielały wysokie poziomy Granzym B (49 950,2 pg/mL), IFN-γ (48 367,8 pg/mL), TNF-α (7 055,2 pg/mL) i GM-CSF (6 653,5 pg/mL), co wskazuje na potężną aktywację i cytotoksyczność funkcji efektorowych w odpowiedzi na interakcję z nowotworem. Poziom IL-2 przekraczał górną granicę wykrywalności (>10 000 pg/mL), co jest zgodne z silnym sygnałem proliferacyjnym. Próbka nie została dalsze rozcieńczona ani ponownie zmierzona. Natomiast cytokiny związane z regulacyjnymi lub alternatywnymi odpowiedziami pomocniczymi limfocytów T, w tym IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 i MCP-1, były obecne na niskich lub niewykrywalnych poziomach. Wyniki te sugerują, że komórki CAR T wywołały przede wszystkim typ 1 (Th1/cytotoksyczny) odpowiedzi immunologicznej charakteryzującej się wysoką aktywnością efektorową i ograniczonym wytwarzaniem cytokin immunosupresyjnych.

Rysunek 3: Reprezentatywny profil cytokin komórek CAR T po kokulturze z komórkami nowotworowymi. Inżynieryjne komórki Chimeric Antigen Receptor (CAR) były kokulturowane przez noc z komórkami nowotworowymi JeKo-1. Nadstany komórkowe zostały zebrane po 16 godzinach inkubacji i wyśrodkowane, aby usunąć cząstki. Rozcieńczone próbki zostały przeanalizowane za pomocą ludzkiego panelu cytotoksyczności testu wielokrotnego. Przeprowadzono dwie krzywe standardowe i wyznaczono stężenia wszystkich 12 analitów. Przedstawiono reprezentatywny wynik danych do analizy i obliczania stężeń specyficznych dla analitów za pomocą trybu Express cytometru przepływowego. Wykres słupkowca i towarzysząca tabela pokazują wyliczone poziomy (pikogram/mililitra) 12 cząstek efektorowych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kinetyka wydzielania cytokin komórek CAR T po stymulacji antygenowo-specyficznej

Po kokulturze komórek CAR T z komórkami docelowymi wyrażającymi (Antygen⁺) lub pozbawionymi (Antygen⁻) odpowiedniego antygenu, wydzielania cytokin monitorowano w czasie za pomocą ludzkiego panelu cytotoksyczności testu wielokrotnego. Komórki CAR T wykazywały szybki i mocny uwalnianie cytokin po rozpoznaniu celów Antigen⁺, z silną ekspresją Granzym B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF i IL-2 w ciągu 8–24 h, osiągając szczytowe poziomy po 48 h (Rysunek 4). Ten wzorzec wskazuje na potężną aktywację i funkcję cytotoksyczną efektorów po zaangażowaniu antygenu. Obserwowano również umiarkowany wzrost IL-6, IL-17A i IL-21, podczas gdy IL-4, IL-10, MCP-1 i Perforyna pozostawały na niskim lub umiarkowane podwyższonym poziomie. Natomiast kokultury z celami Antigen⁻ wykazywały minimalne indukowanie

Discussion

Test multipleksowy został wykorzystany do oceny profilu rozpuszczalnych odpowiedzi mediatorów immunologicznych w kulturach współhodowlanych komórek CAR T. Komórki CAR T hodowlano współcześnie z komórkami docelowymi dodatnimi na antygeny i wykazywały zwiększone wydzielanie IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, Granzymy B oraz IL-2, co było zgodne z aktywacją efektorów i funkcją cytotoksyczną^4,5,8. Natomiast kontrole ujemne na antygeny wykazywały niskie wytwarzanie cytokin, co potwierdza zdolność testu do rozróżniania odpowiedzi specyficznych dla antygenu w badanych warunkach^5,8. Wyniki te potwierdzają przydatność testu do oceny funkcjonalności komórek CAR T, w tym do zastosowań w analizach związanych z potencjalnością, profilowaniu związanym z bezpieczeństwem oraz badaniach mechanistycznych.

Chociaż stała panel 12-analitowa zapewnia szeroki przegląd aktywności immunologicznej komórek CAR T, może nie być praktyczne, aby uchwycić pełny zakres analitów we wszystkich zastosowaniach. W przypadku skoncentrowanych przepływów pracy, takich jak walidacja testu lub testy kontroli jakości (QC) produktów CAR T, panel można zmniejszyć do zmniejszonego podzbioru (np. IL-2, IFN-γ i TNF-α), aby usprawnić analizę przy zachowaniu czułości funkcjonalnej^1,2.

Kluczowe kroki w protokołach obejmują projektowanie współhodowli komórek CAR T oraz odpowiedni wybór warunków pobierania próbek. W szczególności czas współhodowli i liczba komórek efektorów (stosunek E:T) bezpośrednio wyznaczają wielkość cytokin i powinny być określone podczas konfiguracji testu^5,6. Ponadto, rozcieńczanie próbek powinno być dostosowane, aby upewnić się, że stężenia analitów mieszczą się w zakresie dynamicznym testu^1,2. Rozwiązywanie problemów powinno więc skupiać się na weryfikacji wydajności krzywej standardowej i dostosowywaniu warunków współhodowli lub współczynników rozcieńczenia, jeśli sygnały wypadają poza zakres ilościowy^1,2.

W porównaniu z tradycyjnymi pojedynczymi testami ELISA, platforma wielokanałowa oparta na cytometrii przepływowej generuje wysoko gęste, wieloanalityczne zestawy danych z minimalnych objętości próbek. Umożliwiając jednoczesne pomiary wielu analitów w jednej próbce, wielokrotność może zmniejszyć ogólne zużycie reagentów, zwiększyć przepływ próbek i skrócić czas testu w porównaniu z wykonywaniem wielu pojedynczych testów^1,2. Automatyczne pobierane i standaryzowane opcje analizy mogą potencjalnie zmniejszyć zależność od użytkownika i wspierać powtarzalność i skalowalność w różnych ustawieniach eksperymentalnych lub produkcyjnych^5,8. Standardowa czułość wykrywania ELISA zazwyczaj waha się od 16 do 2000 pg/mL (może być niższa dla zestawów o wysokiej czułości)⁷. W ramach platformy przedstawionej w niniejszym badaniu, najniższe wykrywalne stężenia wahają się od 0,05 pg/mL dla najbardziej wrażliwych analitów do około 93,8 pg/mL dla tych o niższej wrażliwości testu. W badaniach wewnętrznych ponad 74% zmierzonych analitów wykazywało limity wykrywalności poniżej 5 pg/mL, a 38% było wykrywalne poniżej 1 pg/mL, co podkreśla ogólną czułość systemu. Ponieważ czułość multipleksu może się różnić w zależności od cytokin, potencjalna konkurencja epitopowa pozostaje ważnym zagadnieniem. Aby zminimalizować takie zakłócenia, test wykorzystuje nienakładające się epitopy do wychwytywania i wykrywania każdego analitu, zmniejszając w ten sposób zniekształcenia związane z konkurencją i poprawiając niezawodność pomiarów w warunkach multipleksu.

Wydajność testu multipleksu może się różnić w zależności od analitów, w zależności od czułości testu i kontekstu biologicznego, a w pewnych warunkach stężenia analitów mogą zbliżać się do górnej granicy wykrywalności i powinny zatem być oceniane podczas konfiguracji testu. Z drugiej strony, niektóre anality (np. MCP-1 i IL-4 w niniejszym badaniu) mogą pozostawać niewykrywalne w zależności od warunków eksperymentalnych. Ponadto, czynniki przed-analityczne, takie jak obsługa próbek, mogą wpływać na pomiary cytokin, a spójne warunki przetwarzania powinny być utrzymywane, aby zapewnić porównywalność.

Ogólnie rzecz biorąc, to podejście multipleksowe umożliwia wydajne i ilościowe charakteryzowanie funkcjonalności komórek CAR T. W porównaniu z większością istniejących platform wykrywania cytokin wielokanałowego, test jest kompatybilny ze standardowymi cytometrami przepływowymi i obejmuje narzędzie związane z urządzeniem, które ułatwia uzyskanie i analizę danych. Chociaż wielokrotne wykrywanie cytokin było wykorzystywane w innych ustawieniach immunologicznych, niniejsza

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human	Miltenyi Biotec	130-125-800	Test wieloczynnikowy oparty na kulkach cytokin przeznaczony do cytometrii przepływowej
MACSPlex InspectoR Tool	Miltenyi Biotec	\	Narzędzie internetowe do automatycznego bramkowania i analizy danych MACSPlex
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-096-343	Przyrząd do cytometrii przepływowej wieloczynnikowych pomiarów danych
MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-109-803	Przyrząd do cytometrii przepływowej wieloczynnikowych pomiarów danych
MACSQuant Express Mode	Miltenyi Biotec	\	Oprogramowanie do automatycznego bramkowania i analizy
TexMACS Medium	Miltenyi Biotec	130-097-196	Optymalizacja wolna od surowicy środowiska kulturowego komórek przeznaczona do hodowli i ekspansji ludzkich i mysiech komórek T