Mechanizm stosowania proszku Ermiao w leczeniu zapalenia prostaty: badanie oparte na farmakologii sieciowej i weryfikacji eksperymentalnej

Podsumowanie

Stosując podejście farmakologii sieciowej, badanie wykazało, że proszek ermiao działa terapeutycznie przeciwko zapaleniu prostaty poprzez hamowanie czynników zapalnych i powiązanych szlaków sygnalizacyjnych. Kolejne eksperymenty in vitro wykazały również, że ekstrakt wodny znacząco hamował ekspresję kluczowych cytokin zapalnych w modelu komórek nabłonka prostaty indukowanego LPS.

Streszczenie

Protokół ten przedstawia połączone podejście farmakologii sieciowej i eksperymentalnej walidacji w celu zbadania mechanizmu działania proszku Ermiao (EMP) w leczeniu zapalenia prostaty. Workflow przebiega według etapowego projektu: (i) przesiewanie aktywnych związków i celów oparte na bazie danych, (ii) konstrukcja i analiza sieci interakcji oraz (iii) walidacja eksperymentalna in vitro . Najpierw z bazy TCMSP pobrano aktywne składniki EMP i ich odpowiadające im cele, natomiast cele związane z zapaleniem prostaty uzyskano z bazy GeneCards. Do identyfikacji kluczowych celów terapeutycznych wykorzystano przecięcie celów EMP i chorób. Po drugie, skonstruowano sieć "Lek–Składnik–Cel–Choroba" przy użyciu Cytoscape. Analiza interakcji białko-białko (PPI) oraz wzbogacenie szlaków szlaków Kioto encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) zostały przeprowadzone na kluczowych celach, ujawniając, że czynniki zapalne takie jak IL6 i TNF pełniły rolę głównych celów, a szlaki takie jak PI3K/AKT i MAPK zostały istotnie wzbogacone. Na koniec walidacja in vitro została przeprowadzona przy użyciu modelu zapalnego komórek nabłonka prostaty indukowanego przez LPS. Leczenie EMP istotnie zmniejszyło uwalnianie czynników prozapalnych IL-6 i TNF-α w porównaniu z grupą leczoną LPS (p < 0,05), co potwierdza przeciwzapalną skuteczność EMP. To integracyjne podejście zapewnia powtarzalne ramy, które można dostosować do badania innych wielokomponentowych systemów terapeutycznych. Podsumowując, to badanie wstępnie wyjaśnia, że EMP wywiera swoje działanie przeciwprostatowe poprzez mechanizm wieloskładnikowy, wielocelowy i wieloszlakowy, ściśle związany ze tłumieniem odpowiedzi zapalnych, co stanowi naukową podstawę dla jego zastosowania klinicznego.

Wprowadzenie

Zapalenie prostaty, szczególnie przewlekłe niebakteryjne zapalenie prostaty, stanowi powszechne zaburzenie urologiczne charakteryzujące się złożoną etiologią i brakiem wysoce skutecznych terapii, co znacząco obniża jakość życia pacjentów ^1,2,3. Obecne kliniczne leczenie zapalenia prostaty stosuje zintegrowane podejście, obejmujące antybiotyki, blokery α-receptorów oraz niesteroidowe leki przeciwzapalne ^4,5,6. Główne wyzwania obejmują brak terapii specyficznych dla etiologii oraz złożoną interakcję czynników psychologicznych z objawami fizycznymi, które łącznie przyczyniają się do niesatysfakcjonujących wyników leczenia i częstych nawrotów⁷. W ostatnich latach podejścia medycyny integracyjnej, takie jak akupunktura i medycyna ziołołowicowa, zostały szeroko stosowane w leczeniu zapalenia prostaty i wykazały obiecującą skuteczność. Bezpieczeństwo i skuteczność tych metod terapeutycznych zostały potwierdzone serią wysokiej jakości dowodów badawczych 8,9,10,11,12.

W tym kontekście formuły tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM), takie jak proszek Ermiao (EMP), znane ze swoich właściwości przeciwzapalnych i detoksykcyjnych, oferują obiecującą alternatywną metodę terapeutyczną 13,14,15. Jednak precyzyjne mechanizmy farmakologiczne leżące u podstaw skuteczności EMP w zwalczaniu zapalenia prostaty pozostają niedo końca wyjaśnione, głównie ze względu na jego wieloskładnikowy charakter. Pojawienie się farmakologii sieciowej stanowi potężne narzędzie do rozszyfrowania złożonego trybu działania "wieloskładnikowy, wielocelowy, wieloszlakowy" charakterystyczny dla wzorów TCM ^16,17. Nasza strategia polegała na identyfikacji aktywnych składników EMP i potencjalnych celów, a następnie analizie sieci w celu precyzyjnego określenia kluczowych celów i ścieżek. Kolejne eksperymenty przeprowadzono w celu biologicznej weryfikacji działań przeciwzapalnych i kluczowych mechanizmów, mających na celu ustanowienie naukowych podstaw dla zastosowania EMP. Niniejsze badanie wprowadza połączone ramy walidacji farmakologii sieciowej i eksperymentalnej, które wzmacniają mechanistyczną interpretację terapii wieloskładnikowych

Protokół

Nie wymagała się tego badania etycznego zatwierdzenia, ponieważ nie obejmowało on uczestników ludzkich ani próbek klinicznych. Wszystkie procedury dotyczące linii komórkowych były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi biobezpieczeństwa instytucjonalnego. Linia komórkowa nabłonka prostaty użyta w tym badaniu została pozyskana od certyfikowanego dostawcy komercyjnego.

UWAGA: Wszystkie odczynniki, instrumenty i oprogramowanie używane w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów. Schemat blokowy tego badania przedstawiono na Rysunku 1.

1. Przesiewowe badania składników aktywnych

1. Uzyskaj dostęp do bazy danych TCMSP.
2. Wybierz "Nazwa zioła" w polu wyszukiwania, wpisz "Huangbo" i kliknij "Wyszukaj".
3. Kliknij filtr "OB", ustaw "≥30" i zastosuj.
4. Kliknij filtr "DL", ustaw "≥0.18" i zastosuj.
5. Skopiuj przefiltrowane wyniki do arkusza Excela.
6. Stosuj tę samą metodę przesiewu, aby uzyskać składniki aktywne "Cangzhu".
7. Usuń zduplikowane aktywne składniki, importując wszystkie zbiory danych do Microsoft Excel (wersja 2019) i łącząc listy związków w formacie Excel.
8. Usuwanie duplikatów składników aktywnych poprzez standaryzację nazw związków i identyfikację identycznych wpisów. Gdy wiele rekordów odpowiadało temu samemu złożowi, zachowywano tylko jeden reprezentatywny wpis.
9. Ustalcie powiązania między "Huangbo", "Cangzhu" a składnikami aktywnymi.

2. Uzyskanie celów odpowiadających składnikom aktywnym

1. Uzyskaj dostęp do bazy danych TCMSP.
2. Wybierz "Nazwa chemiczna" w polu wyszukiwania, wpisz składniki aktywne i kliknij "Wyszukaj".
3. Skopiuj nazwę docelową odpowiadającą każdemu składnikowi aktywnemu.
4. Usuń zduplikowane nazwy Target i ustal, że połącz aktywne składniki z nazwami Target.
5. Uzyskaj dostęp do bazy danych UniProt (https://www.uniprot.org/)¹⁸, pobierz oficjalne symbole genów dla każdej nazwy docelowej i systematycznie je zastępuj.

3. Pozyskanie celów chorób

1. Uzyskaj dostęp do bazy danych GeneCards (https://www.genecards.org)¹⁹.
2. Wpisz "Prostatitis" w polu wyszukiwania i naciśnij ikonę wyszukiwania, aby uzyskać odpowiednią listę genów.
3. Sortuj geny w kolejności malejącej według wyniku relewancji.
4. Eksportuj odpowiednie geny w formacie Excel.
5. Cele z oceną ≥1 zostały wybrane jako cele związane z zapaleniem prostaty.

4. Przygotowanie do budowy sieci regulacyjnej substancji aktywnej, docelowej i chorobowej

1. Ustalić przecięcie celów związanych z substancjami czynnymi a celami związanymi z zapaleniem prostaty i zdefiniować je jako cele EMP w leczeniu zapalenia prostaty.
2. Ustalić związek między składnikami aktywnymi a celami terapeutycznymi EMP w leczeniu zapalenia prostaty.
3. Utwórz plik Excel o nazwie "Network" z pierwszymi trzema kolumnami o nazwach "Node1", "Node2" i "Net".
4. Wklej powiązania między EMP a lekiem do kolumn "Node1" i "Node2", wpisując "drug" w kolumnie "Net" dla wszystkich wierszy.
5. Wklej powiązania substancji aktywnych leków do kolumn "Node1" i "Node2", wpisując "ingredient" w kolumnie "Net" dla wszystkich wierszy.
6. Wypełnij kolumny "Node1" i "Node2" powiązaniami aktywny-cel dla celów EMP w leczeniu zapalenia prostaty, wpisując "target" w kolumnie "Net".
7. Wklej cele terapeutyczne EMP w przypadku zapalenia prostaty do kolumny "Node1", wpisując "prostatitis" w kolumnie "Node2" i "disease" w kolumnie "Net" dla wszystkich wierszy.
8. Zapisz plik Excel "Network" jako plik w formacie txt.
9. Utwórz plik Excel o nazwie "Type" z dwoma pierwszymi kolumnami o nazwach "Node" i "Type".
10. Wypełnij kolumnę "Węzeł" "EMP", a w kolumnie "Typ" wpisz "Formułę".
11. Wpisz "Huangbo" i "Cangzhu" do kolumny "Węzeł"; wpisz "lek" w kolumnie "Typ" dla wszystkich wierszy.
12. Wprowadź aktywne składniki do kolumny "Węzeł", a w kolumnie "Typ" wpisz "składnik" dla wszystkich odpowiadających wierszy.
13. Wypełnij kolumnę "Węzeł" celami terapeutycznymi EMP w zapaleniu prostaty, wpisując "cel" w kolumnie "Typ".
14. Wpisz cele związane z zapaleniem prostaty w kolumnie "Węzeł", a "choroba" wpisz w kolumnie "Typ" dla wszystkich odpowiadających wierszy.
15. Zapisz plik Excel "Type" jako plik w formacie .txt.

5. Wizualizacja sieci regulacyjnej "Substancja aktywna-Celowa-Choroba" przez Cytoscape

1. Uruchom Cytoscape.
2. Przejdź do "File > Import > Network from File System" i otwórz plik "network.txt".
3. Otwórz panel "Styl". Wybierz "Shape", wybierz "Type" z rozwijanego menu "Column" i ustaw "Mapping Type" na "Dyskretne mapowanie".
4. Przypisz różne kształty węzłów do następujących kategorii: formuła, lek, składnik, cel, choroba.
5. Wybierz "Kolor wypełnienia", wybierz "Typ" z rozwijanego menu "Kolumna" i ustaw "Typ mapowania" na "Dyskretne mapowanie".
6. Przypisz różne kolory węzłów do następujących kategorii: formuła, lek, składnik, cel, choroba.
7. Wybierz "Wysokość" i "Szerokość", wybierz "Typ" z rozwijanego menu "Kolumna" i ustaw "Typ mapowania" na "Mapowanie dyskretne".
8. Przypisz różne rozmiary węzłów do następujących kategorii: formuła, lek, składnik, cel, choroba.
9. Wybierz "Rozmiar czcionki etykiety", wybierz "Typ" z rozwijanego menu "Kolumny" i ustaw "Typ mapowania" na "Mapowanie dyskretne".
10. Przypisz różne rozmiary czcionek etykiet do następujących kategorii: formuła, lek, składnik, cel, choroba.
11. Ręcznie przestawiaj węzły, aby zoptymalizować układ sieci.
12. Przejdź do "File > Export > Network Image to File" i zapisz sieć jako obraz.

6. Analiza i wizualizacja sieci PPI

1. Uzyskaj dostęp do https://cn.string-db.org/ i przejdź do modułu "Multiple Proteins".
2. Wpisz listę docelowych genów w polu wyszukiwania, wybierz "Homo sapiens" jako organizm i kliknij "Wyszukaj".
3. Po załadowaniu wyników kliknij "Kontynuuj".
4. Otwórz panel "Ustawienia", ustaw "minimalny wymagany wynik interakcji" na "wysoka pewność (0,700)" i zaznacz "ukryj rozłączone węzły w sieci".
5. Kliknij "Update", a następnie wyeksportuj dane powiązania PPI w formacie TSV przez menu "Eksport".
6. Uruchom Cytoscape, przejdź do menu Pliki i wybierz "Import Network from File System", aby otworzyć swój plik TSV.
7. Przejdź do menu "Narzędzia", a następnie wybierz "Analizator sieci > Analiza sieci > interpretacja sieci > Traktuj sieć jako nieukierunkowaną".
8. Przejdź do menu "Plik", wybierz system "Eksportuj tabelę do pliku" i wyeksportuj dane sieciowe.
9. Przejdź do panelu "Styl" i skonfiguruj atrybuty "Kształt", "Kolor wypełnienia", "Wysokość" oraz "Szerokość".
10. Dostosuj układ sieci PPI, przesuwając węzły.
11. Przejdź do menu "File", wybierz "Eksportuj obraz sieci do pliku" i wyeksportuj zwizualizowaną sieć jako obraz.
12. Otwórz eksportowane dane sieci PPI za pomocą WPS i sortuj je w kolejności malejącej według kolumny "Degree".
13. Wybierz 20 najczęściej posortowanych celów, wygeneruj wykres słupkowy i zapisz wykres jako obraz.

7. Analiza wzbogacenia szlaku KEGG

1. Otwórz terminal lub wiersz poleceń, wpisz R i naciśnij Enter.
2. W konsoli R wykonuj następujące polecenia jedno po drugim:
   install.packages(c("RSQLite", "colorspace", "stringi", "BiocManager"))
   BiocManager::install(c("org. Hs.eg.db", "DOSE", "clusterProfiler", "pathview"))
3. Przekonwertować symbole genów celów EMP w leczeniu zapalenia prostaty na identyfikatory Entrez za pomocą org. Hs.eg.db.
4. Czytaj identyfikatory Entrez i wykonuj analizę wzbogacenia KEGG za pomocą pakietu clusterProfiler z parametrami: organism = "has", pvalueCutoff = 0,05, qvalueCutoff = 0,05.
5. Po usunięciu szlaków związanych z chorobami i metabolizmem człowieka z uzyskanych wyników analizy wzbogacenia KEGG, posegreguj pozostałe szlaki według liczby wzbogaconych genów.
6. Ustalcie powiązanie między 15 najwyżej notowanymi szlakami sygnalizacyjnymi a celami.
7. Przygotuj plik dwukolumnowy z powiązaniami "pathway" i "target", a następnie zaimportuj go do Cytoscape za pomocą "File > Import > Network from File".
8. Ustaw kształty i kolory węzłów, aby odróżnić ścieżki od celów za pomocą panelu "Styl".
9. Dostosuj układ ręcznie i wyeksportuj sieć jako obraz.

8. Przygotowanie farmaceutyczne

UWAGA: Formuła EMP składa się z 15 g kory chińskiej Phellodendri (Huangbo) oraz 15 g Atractylodis Rhizoma (Cangzhu). Metoda ekstrakcji wodnej i wytrącenia alkoholu została zastosowana do uzyskania ekstraktu do kolejnych eksperymentów komórkowych²⁰.

1. Zanurz lek w 10-krotnie większej ilości wody na godzinę.
2. Dekoktuj przez 1 godzinę, a następnie przefiltruj przez gazę, aby uzyskać dekokt.
3. Dodaj ponownie 10-krotną ilość wody do leku, dekoktuj przez 30 minut i przefiltruj przez gazę, aby uzyskać wywar.
4. Dodaj do leku jeszcze 10-krotną ilość wody, dekoktuj przez 30 minut i przefiltruj przez gazę, aby uzyskać wywar.
5. Połącz trzy przefiltrowane wywary, a następnie przefiltruj mieszankę przez papier filtracyjny.
6. Skoncentruj wywar pod obniżonym ciśnieniem do 10% jego pierwotnej objętości.
7. Schłodź koncentrat, powoli dodaj etanol do 75% z mieszaniem, następnie zabezpiecz i przechowuj w 4 °C przez 12 godzin.
8. Wiruj mieszankę i zbieraj supernatant.
9. Kontynuuj destylację pod obniżonym ciśnieniem.
10. Na koniec liofilizuj produkt za pomocą liofilizacji próżniowej.
    UWAGA: Proszek liofilizowany można przechowywać w temperaturze –20ºC do 3 miesięcy, co stanowi bezpieczny punkt przerwy. Na wznowienie należy odtworzyć proszek w odpowiednim rozpuszczalniku w razie potrzeby.

9. Rozmrażanie i hodowla komórek

UWAGA: Zakupione komórki zostały dostarczone do laboratorium na suchym lodzie. Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotowano wcześniej bezżywne medium z surowikami keratynocytów (K-SFM), uzupełniając go ludzkim rekombinowanym czynnikiem wzrostu naskórka (rEGF) do końcowego stężenia 5 ng/mL, ekstraktem przysadki bydlęcej do końcowego stężenia 50 μg/mL oraz 1% penicylin-streptomycyną.

1. Aktywuj kąpiel wodną i reguluj temperaturę do 37 °C.
2. Wyjmij komórki z suchego lodu i natychmiast porusz je w kąpieli wodnej, aż całkowicie się rozmrozą.
3. Dodaj 5 mL K-SFM do ogniw. Delikatnie wymieszaj, a następnie wiruj mieszankę (4 °C, 500 × g, 5 minut).
4. Usuń supernatant i ponownie zawiesz pellet w pełnym K-SFM.
5. Przenieś komórki do kolby T-25 i umieść je w inkubatorze do hodowli komórek.
   UWAGA: Parametry środowiskowe inkubatora hodowli komórkowej utrzymywano na poziomie 37 °C, 5% CO₂ i ≥ 95% wilgotności względnej.

10. Subkulturowanie komórek

UWAGA: Subkulturowanie wykonywano, gdy komórki osiągały 80–90% zbiegu, z stosunkiem subkultury 1:2 do 1:3.

1. Aspiruj supernatant z pożywki hodowlanej, a następnie wykonuj dwa płukania komórek PBS bez wapnia i magnezu.
2. Wprowadź 2 mL trypsyny-EDTA i pozwól komórkom odczekać 3 minuty w celu dysocjacji enzymatycznej.
   UWAGA: Protokół ten obejmuje stosowanie niebezpiecznych odczynników, w tym lipopolisacharydu (LPS), chloroformu, etanolu oraz odczynnika TRIzol. Wszystkie procedury z udziałem niebezpiecznych substancji chemicznych powinny być wykonywane w certyfikowanym okapie chemicznym, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego (fartuch laboratoryjny, rękawiczki i ochronę oczu). Materiały biologiczne powinny być obchodzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego bezpieczeństwa biologicznego.
3. Dodaj podłoże K-SFM z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydła, aby przerwać trawienie.
4. Przelej mieszankę ogniwa do rurki wirówki o pojemności 15 mL, wirówki (4 °C, 500 × g, 5 min) i usuń supernatant.
5. Pellet komórkowy został ponownie zawieszony w pełnym K-SFM i następnie przeniesiony do nowych kolb hodowlanych.

11. Określenie maksymalnego stężenia leczenia farmakologicznego za pomocą testu MTS

UWAGA: Każde stężenie leku było testowane za pomocą 5 technicznych replik.

1. Trawić komórki RWPE-1 w fazie logarytmicznej wzrostu.
2. Ponownie zawiesij komórki w pełnym medium K-SFM, a następnie określ stężenie komórek przez liczenie.
3. Reguluj zawiesinę ogniwa do gęstości 1× 10⁵ ogniw/mL z pełnym medium K-SFM.
4. Rozdaj zawiesinę ogniwową do płytki z 96 dołkami i 100 μL na dołek.
5. Płytka z 96 dołkami została umieszczona w inkubatorze do hodowli komórek do uprawy.
6. Po 24 godzinach, gdy komórki całkowicie się przywierały, pożywka była aspirowana i odrzucana.
7. Zamień podłoże na kompletne ośrodek K-SFM zawierające różne stężenia roztworu EMP.
8. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora hodowli komórkowych na kolejne 24 godziny inkubacji.
9. Aspiruj medium, a następnie dwukrotnie przepłucz komórki za pomocą PBS.
10. Dodaj 100 μL kompletnego medium K-SFM do każdego dołka, a następnie inkubuj płytkę w inkubatorze hodowli komórkowych przez kolejne 4 godziny.
11. Do każdego dołka należy podać 10 μL roztworu MTS i określić przedawkowanie przy 490 nm po 1 godzinie inkubacji.
12. Na podstawie grupy kontrolnej pustej (komórek hodowanych w kompletnym medium bez stymulacji LPS lub leczenia farmakologicznym) jako punktu wyjścia, obliczono proliferację komórek przy każdym stężeniu leczenia.
    UWAGA: Najwyższe stężenie nie wykazujące istotnego wpływu na proliferację komórek zostało zdefiniowane jako leczenie wysokimi dawkami, następnie jego półstężenie jako leczenie średniej dawki, a ćwierć stężenia jako leczenie niskiej dawki.

12. Interwencja komórkowa

1. Trawić komórki RWPE-1 w fazie logarytmicznej wzrostu.
2. Komórki zostały ponownie zawieszone w pełnym medium K-SFM, a stężenie komórek określano na podstawie liczenia komórek.
3. Zawiesina ogniwa została dostosowana do gęstości 5 × 10⁵ ogniw/mL przy użyciu kompletnego medium K-SFM.
4. Zawiesina ogniwowa była zasiewana do płyty 6-dołowej o stężeniu 2 mL na odwiert.
5. Płytka została umieszczona w inkubatorze hodowlowym i inkubowana przez 12 godzin, aby umożliwić adhezję komórek.
6. Komórki traktowano odpowiednio niskimi (150 μg/mL), średnimi (300 μg/mL) i wysokimi dawkami (600 μg/mL) stężeniami EMP.
7. Po 1 godzinie do podłoża dodawano roztwór LPS o stężeniu 10 μg/mL.
8. Po 24 godzinach leczenia pobrano supernatant do ELISA, a komórki pobrano do analizy RT-PCR.
   UWAGA: LPS został wybrany do wywołania odpowiedzi zapalnej ze względu na dobrze udokumentowaną zdolność aktywowania prozapalnych szlaków sygnalizacyjnych w komórkach nabłonka prostaty; stężenie (10 μg/mL) zostało wybrane na podstawie wcześniejszych badań wykazujących silną indukcję cytokin.

13. Izolacja całkowitego RNA

UWAGA: Aby zapobiec degradacji RNA, przez cały czas trwania procedury eksperymentalnej noszono rękawice i maski, a końcówki pipety wolne od RNazy i rurki do wirówek.

1. Po interwencji przepłucz komórki dwukrotnie PBS.
2. Dodaj 1 mL odczynnika Trizol do komórek i wielokrotnie mieszaj go pipetą, aby zapewnić homogenizację.
   UWAGA: Wszystkie procedury wykonuj w okapie chemicznym przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego.
3. Przelej lizat do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i pozwól mu wykubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
4. Następnie dodaj 0,2 mL chloroformu i intensywnie zabij próbkę.
5. Po pozostawieniu próbki w temperaturze pokojowej przez 5 minut wiruj ją w temperaturze 10 000 × g przez 15 minut w 4 °C.
6. Po wirowaniu ostrożnie przenieś górną bezbarwną fazę wodną do nowej rurki mikrowirówki.
7. Wprowadź równą ilość wcześniej schłodzonego izopropanolu, dokładnie wymieszaj, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
8. Ponownie odwiruj próbkę (4 °C, 10 000 × g, 10 min), następnie wyrzuć fazę ciekłą i zatrzymać osad.
9. Opłucz pellet 1 mL wcześniej schłodzonego 75% etanolu i delikatnie zawiesij przez pipetowanie.
10. Wykonaj ostatnią wirówkę w temperaturze 4 °C i 7 500 × g przez 10 minut, następnie usuń supernatant i pozwól pelletu RNA wyschnąć na powietrzu w szafce zabezpieczeń biologicznych.
11. Rozpuszczać oczyszczone RNA w 50 μL wody poddawanej DEPC.
12. Określ stężenie RNA, stosunek A260/A280 oraz A260/A230 za pomocą spektrofotometru NanoDrop, aby ocenić czystość RNA i zapewnić minimalne zanieczyszczenie białkami i rozpuszczalnikami przed dalszymi analizami.

14. RT-PCR

1. Użyj 1 μg całkowitego RNA do przygotowania systemu reakcji odwrotnej transkrypcji o stężeniu 20 μL.
2. Inkubuj układ reakcyjny w 42 °C przez 15 minut, następnie 95 °C przez 5 minut, a następnie schładz do 4 °C.
3. Rozcieńcz powstałe cDNA dziesięciokrotnie za pomocą wody destylowanej.
4. Przygotuj system reakcji PCR o stężeniu 20 μL z użyciem rozcieńczonego cDNA.
5. Zaprogramuj cykler termiczny i ustaw początkowe utrzymanie na 95 °C przez 60 s, następnie 40 cykli 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 60 s.
6. Wykonaj analizę krzywej topnienia i zapisz wartości CT dla wszystkich genów docelowych oraz genów referencyjnych po zakończeniu.
7. Do określenia znormalizowanych poziomów ekspresji genów docelowych należy użyć metody 2^(-ΔΔCT).

15. Analiza ELISA

UWAGA: Wyjmij zestaw ELISA ze schowku i pozostaw go do wyrównania w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed użyciem.

1. Przygotuj roztwór standardowy zgodnie z instrukcjami producenta i wykonaj odpowiednie rozcieńczenia dla standardów, przeciwciał biotynylowanych, sprzężonych enzymów oraz buforu płukania.
2. Wiruj pobrany supernatant hodowli komórkowej (4 °C, 10 000 × g, 10 min) i pobierz supernatant.
3. Przelej 100 μL standardowych rozcieńczeń i próbek testowych do wstępnie powlekanych studni.
4. Zamknąć dołki taśmą klejącą i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 90 minut.
5. Usuń płyn z odwiertów i myj płytę za pomocą automatycznej myjki do płyt.
   UWAGA: Ustaw parametry automatycznej pralki na: 350 μL bufora mycia na dołek, 15 sekund między dozowaniem a aspiracją, 5 cykli pełnych.
6. Do każdego dołka należy podać 100 μL biotinylowanego roztworu roboczego przeciwciał. Pozostawić inkubację w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
7. Wyrzuć roztwór i przemyć płytkę zgodnie z tekstem 15.5.
8. Pipetuj 100 μL enzymatycznego sprzężonego roztworu roboczego na dołek, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
9. Wyrzuć roztwór i przemyć płytkę zgodnie z tekstem 15.5.
10. Do każdego dołku dodaj 100 μL chromogenicznego substratu. Utrzymuj temperaturę 37 °C przez 15 minut, chroniąc przed światłem.
11. Pipeta 100 μL roztworu stopowego na dołek, a następnie delikatnie wymieszaj.
12. Natychmiast zmierz gęstość optyczną (OD) na 450 nm.
13. Ustal krzywą standardową, wykreślając średnie wartości OD względem standardowych stężeń za pomocą oprogramowania Curve Expert.
14. Określ stężenie każdej próbki przez interpolację ze standardowej krzywej, używając jej wartości OD.

16. Analiza statystyczna

1. Obsługa oprogramowania SPSS (wersja 20.0).
2. Zaimportuj zbiór danych do statystyki SPSS i odpowiednio zdefiniuj zmienne. Użyj Analizuj > Statystyki Opisowej> Eksploruj , aby obliczyć średnią i odchylenie standardowe (SD).
3. Użyj Analyze > Compare Means > One-Way ANOVA do porównań wielu grup.
4. Uzyskaj wartości p bezpośrednio z tabel wyników testowych i odpowiednio je raportuj.
5. Wszystkie wyniki przedstawiamy jako średnią ± SD i różnice są statystycznie istotne, gdy p < 0,05.

Wyniki

Identyfikacja związków aktywnych i prognozowanie celów

Wyniki te pokazują skuteczność naszej zintegrowanej farmakologii sieciowej oraz podejścia in vitro w identyfikacji i walidacji celów terapeutycznych EMP w zapaleniu prostaty. Przeszukiwanie bazy danych TCMSP wykazało 46 bioaktywnych składników z ziół składowych EMP, co odpowiada 178 potencjalnym celom. Z bazy danych Genecards pozyskano 13 960 celów związanych z zapaleniem prostaty. 162 cele wspólne dla obu zestawó...

Dyskusja

Protokół ten integruje farmakologię sieciową z walidacją eksperymentalną, tworząc systematyczne ramy do badania wielokomponentowych mechanizmów terapeutycznych. Kluczowe kroki obejmują dokładne przesiewanie związków aktywnych przy użyciu określonych progów (OB ≥ 30%, DL ≥ 0,18), niezawodną konstrukcję sieci oraz odpowiedni wybór eksperymentalnych modeli walidacyjnych. Staranny dobór parametrów w analizach bioinformatycznych oraz ścisła kontrola warunków eksperymentalnych są niezbędne dla zapewnienia powtarzalności.

<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ludzki IL-6 ELISA KIT	4Abio	CHE0009
Ludzki TNF i alfa; ELISA KIT	4Abio	CHE0019
Suplementy K-SFM	Procell	CM-0200
Lipopolisacharydy	Solarbio	L8880
MTS	Promega	G1111
System transkrypcji odwrotnej	Promega	A3500
RWPE-1	Procell	CL-0200	RRID:CVCL_EQ24
Kompletne medium komórki RWPE-1	Procell	CM-0200
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	Toyobo	QPK-201
Odczynnik Trizol	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	15596026
trypsyna-EDTA	Gibco (Thermo Fisher)	25200072