Artykuł metodologiczny

Jednoetapowa nakładająca się PCR do szybkiego syntezowania pojedynczych szablonów RNA DNA dla systemu CRISPR

193 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70369

⸱

24 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

W tym artykule

Podsumowanie

Jednostkowa metoda nakładającej się PCR z wykorzystaniem czterech primerów umożliwia szybkie, tanie generowanie szablonów DNA dla in vitro transkrypcji sgRNA. Zoptymalizowana proporcja primerów (50:5:1:50) produkuje wysokiej jakości sgRNA w ciągu 5 godzin, z funkcjonalną walidacją wykazaną przez in vitro testy i aktywność edycji w komórkach HEK293T.

Streszczenie

System CRISPR–Cas zrewolucjonizował edycję genomu; jednak konwencjonalne metody generowania pojedynczej ribonukleotydowej kwasu rybonukleinowego (sgRNA) często wymagają czasochłonnych etapów klonowania lub drogich komercyjnych zestawów do syntezy. Przedstawiono zoptymalizowaną strategię jednoetapową łączącą PCR dla szybkiego, opłacalnego składania szablonów DNA dla in vitro transkrypcji sgRNA. Za pomocą czterech częściowo nakładających się primerów obejmujących promotor T7, docelową specyficzną sekwencję przewodnika oraz szkielet sgRNA, pełne szablony są zbudowane w jednej reakcji PCR bez klonowania. Systematyczna optymalizacja eksperymentalna ustaliła optymalny stosunek primerów (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50), minimalizując niespecyficzne produkty uboczne i maksymalizując wydajność pełnych produktów, jak potwierdzono przez elektroforezę na żelu agarozowym. Podejście to zostało pomyślnie rozszerzone na generowanie szablonów dla Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) sgRNA, wykazując zastosowanie krzyżowe poza Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). Chociaż bezpośrednia chemiczna synteza sgRNA oferuje zalety takie jak wysoka czystość, modyfikacje chemiczne w celu zwiększenia stabilności i zmniejszenie efektów poza docelowymi, nadal jest zbyt droga dla zastosowań wysoko przepustowości lub dużych przesiewów, które wymagają licznych sgRNA. Testy rozszczepienia in vitro wykazały, że RNA przewodnikowe wygenerowane za pomocą tej metody osiąga wydajność edycji porównywalną z tą uzyskiwaną via konwencjonalnego klonowania opartego na plazmidzie. Co więcej, kompleksy rybonukleoprotein złożone z tych sgRNA i dostarczone do komórek HEK293T via elektroporację, prowadziły do wykrywalnego tworzenia indel w locus docelowym, potwierdzając funkcjonalność in vivo. Analiza kosztów wskazuje, że ta metoda znacznie obniża koszty przygotowania szablonów w porównaniu do komercyjnych zestawów do syntezy, zmniejszając czas realizacji od dni do godzin, zapewniając tym samym dostępne i skalowalne podejście dla laboratoriów zajmujących się badaniami genetycznymi.

Wprowadzenie

System CRISPR–Cas, pochodzący z adaptacyjnego mechanizmu odporności u bakterii i archeonów, zrewolucjonizował inżynierię genetyczną, umożliwiając precyzyjne edycję genomu w różnorodnych organizmach1,2. Kluczowym elementem jest pojedyncza rybosoma RNA (sgRNA), chimeryczna rybosoma RNA, która kieruje nukleazy Cas do określonych miejsc w genomie; jej modułowa konstrukcja umożliwia przekierowywanie poprzez modyfikację sekwencji protospaceru o długości około 20 nukleotydów3. Poza SpCas9, inne nukleazy Cas o odmiennych właściwościach zostały szeroko zaakceptowane. Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) jest mniejszy, ułatwiając dostarczenie wirusów związanych z adenowirusem (AAV), a tym samym rozszerzając opcje dostarczenia4. Każdy system wymaga specyficznych architektur RNA przewodnika, co sprawia, że metoda wieloskładnikowej syntezy jest bardzo pożądana3.

Tradycyjne metody generowania funkcjonalnych RNA przewodników obejmują klonowanie na bazie plazmidów, komercyjne zestawy do syntezy sgRNA lub bezpośrednią komercyjną syntezę sgRNA5,6. Klonowanie na bazie plazmidów wymaga wielu pracochłonnych kroków—trawienie restrykcyjne, ligacja, transformacja i przesiewanie kolonii—zwykle trwa ponad 48 godzin2,4,6. Komercyjne zestawy do syntezy sgRNA, choć oferujące usprawniony przepływ pracy (<5 h), pozostają zbyt drogie dla zastosowań wysoko przepustowości, zazwyczaj kosztując $35–$45 za reakcję. Bezpośrednia chemiczna synteza sgRNA oferuje zalety takie jak wysoka czystość, modyfikacje chemiczne w celu zwiększenia stabilności i zmniejszone efekty poza docelowe7; jednakże, jest zbyt droga (zwykle $200–$280 za sgRNA) dla zastosowań wysoko przepustowości lub dużych badań wymagających setek sgRNA.

W przeciwieństwie do tego, opisana tutaj metoda jednostopniowego nakładającego się PCR ukończy syntezę szablonu w czasie poniżej 5 h przy użyciu standardowych primerów w cenie około $5–8 za sgRNA, co oznacza znaczne zmniejszenie zarówno czasu, jak i kosztów materiałowych. Co więcej, sgRNAs wyprodukowane tą metodą osiągają efektywności edycji porównywalne z tymi generowanych przez klonowanie na bazie plazmidów, co potwierdzono za pomocą in vitro testów kleizenia. Porównanie tych podejść zostało przedstawione na Rysunku 1.

Nakładający się PCR (OE-PCR) zapewnia szybką, niezależną od ligazy strategię łączenia fragmentów DNA8. Podejście to zostało zaadaptowane do syntezy szablonów sgRNA przy użyciu nakładających się primerów. W jednostopniowej reakcji za pomocą czterech częściowo nakładających się primerów, następuje konkurencyjne wiązanie: zewnętrzne primery (AF1 i Tracr-R) definiują granice amplifikacji, podczas gdy wewnętrzne primery (AF2 i AF3) muszą być rozcieńczane, aby zapewnić uporządkowane rozszerzanie z obu końców w kierunku środka. Pomimo tego teoretycznego ramowania, krytyczny parametr wpływający na efektywność składania—optymalny stosunek primerów—nie został systematycznie zbadany. Co więcej, szersze zastosowanie takich metod OE-PCR w różnych systemach CRISPR pozostaje niedostatecznie zbadane.

Aby zapobiec tym ograniczeniom, zaprojektowano badanie w celu zoptymalizowania i zweryfikowania jednostopniowej metody nakładającego się PCR do syntezy szablonów sgRNA. Optymalny stosunek primerów został ustalony poprzez strukturalny projekt eksperymentalny, z wykorzystaniem elektroforezy na żelu agarozy do identyfikacji warunków dających pojedynczy, poprawnie wielkości produkt. Po optymalizacji, wszechstronność metody została oceniona w dwóch szeroko stosowanych systemach CRISPR (SpCas9 i saCas9), z pomyślnym wzmocnieniem obu szablonów. Funkcjonalna walidacja przy użyciu in vitro testów kleizenia wykazała, że sgRNAs wygenerowane tą metodą osiągają efektywności porównywalne z tymi uzyskanymi via klonowanie na bazie plazmidów.

Aby dodatkowo ocenić funkcjonalność w kontekście komórkowym, sgRNA SpCas9 została zespolona z białkiem Cas9, aby utworzyć kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP) i dostarczona do komórek HEK293T via elektroporacja. Edycja genomu w endogennym loci została oceniona za pomocą testu endonukleazy I T7 (T7EI), a wzorce kleizenia na żelach agarozowych wskazywały na wykrywalne tworzenie indel in vivo. Łącznie, te wyniki pokazują, że ta metoda niezawodnie produkuje wysokiej jakości, funkcjonalne szablony sgRNA. Poniższy protokół opisuje szczegółową procedurę przy użyciu SpCas9 jako przykładu reprezentatywnego, z szablonami primerów dostarczonymi do adaptacji dla innych nukleaz Cas.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zastosowanie komórkowego szczepu HEK293T (ATCC CRL-3216) było zgodne z wytycznymi Komitetu Etycznego Pierwszego Szpitala w Chenzhou City, Uniwersytetu Południowych Chin dotyczącymi stosowania ludzkich linii komórkowych. Reagenty, oprogramowanie i sprzęt użyty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Projektowanie sekwencji docelowych sgRNA

  1. Zidentyfikuj docelowy region genomu za pomocą ustanowionych narzędzi internetowych (np. CRISPRscan, CHOPCHOP, Broad Institute CRISPick)3.
  2. Wejdź na stronę serwera CHOPCHOP pod adresem https://chopchop.cbu.uib.no/3,9.
  3. Wprowadź informacje o docelowym genie i wybierz odpowiedni system CRISPR/Cas (np. EGFR dla CRISPR/Cas9) (Rysunek 2A).
  4. Przejrzyj tabelę wyników, uwzględniającą ranking, sekwencję docelową, lokalizację genomową, łańcuch, zawartość GC (%), samouzupełniającość, przewidywane strony off-target (MM0, MM1, MM2, MM3) oraz wynik efektywności (Rysunek 2B).
  5. Wybierz sekwencję kierunkującej RNA o wysokiej efektywności na docelowym miejscu i niskiej przewidywanej aktywności off-target.
  6. Zapisz końcową sekwencję docelową sgRNA do projektowania sekwencji startera (np. sekwencja docelowa EGFR: „CTTAATTCCTTGATAGCGACGG”) (Rysunek 2B).

2. Synteza i przygotowanie czterech nakładających się primerów

  1. Projekt czterech oligonukleotydowych primerów (AF1, AF2, AF3, Tracr-R) z nakładającymi się obszarami, jak poniżej (Rysunek 3A):
    AF1: 5′–TTCTAATACGACTCACTATAG
    [sekwencja docelowa]GTTTTAGAGCTAGAAATAG–3′
    AF2: 5′–GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
    TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC–3′
    AF3: 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT–3′
    Tracr-R: 5′–AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC–3′
    UWAGA: Zastąp [sekwencję docelową] w primerze AF1 sekwencją uzyskiwaną w kroku 1.6.
  2. Syntetyzuj primery w skali 25 nmol z standardową czystością.
  3. Rozpuść wysuszone primery w wodzie wolnej od nukleaz do stężenia początkowego 100 µM. Odwiruj przez 1 min przy 5000 × g w temperaturze pokojowej.

3. Optymalizacja stężenia primerów i jednokrokowe nakładanie się PCR do syntezy szablonu sgRNA

  1. Przygotuj mieszanki primerów o zmiennym stężeniu AF2 i AF3 zgodnie z Tabelą 1. Zachowaj AF1 i Tracr-R na poziomie 10 µM.
  2. Przygotuj reakcje PCR w 0,2 mL wolnych od nukleaz probówkach zgodnie z Tabelą 2. Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności.
  3. Delikatnie wymieszaj pipetą pięć razy. Nie wiruj. Odwiruj przez 1 min przy 5000 × g.
  4. Wykonaj PCR z warunkami cyklicznymi opisanymi w Tabeli 3.

4. Elektroforeza i odzyskiwanie szablonów DNA

  1. Przygotuj 2% żel agarozowy, rozpuszczając 2 g agarozy w 100 mL buforu TAE 1×. Ostudź do 50–60 °C, dodaj 5 µL barwnika nukleotydowego i wlej żel.
  2. Pozwól żelowi zestalić się przez 30 min w temperaturze pokojowej.
  3. Zawieś 10 µL produktu PCR zmieszany z 2 µL buforu ładującego 6×. Umieść 100 bp drabinkę DNA.
  4. Uruchom elektroforęz na 100 V przez 30–40 min.
  5. Zwizualizuj pod światłem UV. Potwierdź, że Warunek 9 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50) daje pojedynczą pasmę ~120 bp (Rysunek 4A).
  6. Użyj zoptymalizowanych stężeń primerów: AF1 10 µM, AF2 1 µM, AF3 0,2 µM, Tracr-R 10 µM.
  7. Wytnij docelową pasmę za pomocą sterylnego skalpela. Ogranicz ekspozycję na UV do ≤30 s.
    UWAGA: Przechowuj plasterki żelu w -20 °C przez maksymalnie 1 tydzień lub zajmij się nimi natychmiast.

5. Oczyszczanie szablonów DNA

  1. Oczyść DNA za pomocą zestawu ekstrakcji z żelu zgodnie z instrukcjami producenta10.
  2. Eluuj DNA w 20–30 µL wolnej od nukleaz wody przegrzewanej do 60 °C.
  3. Zmierzyj stężenie DNA. Typowy wydajność: 15–50 ng/µL; A260/A280: 1,8–2,0.
    UWAGA: Przechowuj oczyszczone DNA w -20 °C przez maksymalnie 1 rok.

6. In vitro transkrypcja i

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłowe zastosowanie protokołu jednoetapowej PCR z nakładaniem (overlapping PCR) pozwala na uzyskanie pojedynczego, wyraźnego prążka DNA o oczekiwanym rozmiarze w analizie za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Nieoptymalne stosunki starterów, w szczególności te z nadmiernym stężeniem starterów wewnętrznych (AF2 i AF3), prowadzą do powstania dodatkowych prążków większych niż oczekiwany produkt, co wskazuje na nieswoistą amplifikację lub tworzenie dimerów starterów, a także do pojawienia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisano jest wydajne, oszczędnościowe protokoło syntezy szablonów DNA sgRNA poprzez strategię jednostopniową PCR z nakładającymi się fragmentami. Metoda ta eliminuje potrzebę konstruowania i klonowania plazmidów, skracając czas przygotowania szablonów z kilku dni do około 5 godzin. Kluczowym aspektem tego podejścia jest systematyczna optymalizacja stosunku primerów, który został określony jako 50:5:1:50 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R), odpowiadające stężeniom roboczym 10 µM, 1 µM, 0,2 µM i 10 µM, odpowiednio. Ten stosunek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnięcia.

Podziękowania

To dzieło zostało wspierane przez Projekt Badań Zdrowia Prowincjonalnej Komisji Zdrowia Hunan (numer grantu W20243264), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Hunan (numer grantu 2023JJ50368), Kluczowy Projekt Badawczy Departamentu Edukacji Prowincji Hunan (numer grantu 24A0607) oraz Projektu Zespołowego Innowacyjnego Pierwszego Szpitala Ludowego w Chenzhou (numer grantu CX202103).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 bp DNA LadderTIANGENMD109Oznacznik wielkości DNA do elektroforezi
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849MŚrodek do amplifikacji PCR
50 bp DNA LadderTIANGENMD108Oznacznik wielkości DNA dla małych fragmentów
6DNA loading bufferTIANGEN1109565Środek do ładowania próbek do elektroforezi
Agarose Gel DNA Recovery KitTIANGENDP219Oczyszczanie DNA z żelu agarozowego
Agarose I Thermo Scientific 17850Przygotowanie żelu agarozowego
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicNarzędzie do projektowania sgRNA
CentrifugeHENGNUO2-16RCentryfugacja próbek
Certified Copper Fetal Bovine SerumUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023ADodatek do hodowli komórek
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682Środki do przygotowania roztworu buforowego TAE
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/Narzędzie do projektowania sgRNA
CO2 incubatorThermo Scientific51032874Inkubacja kultur komórek ssaczy
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/Narzędzie do projektowania sgRNA
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)KeyGEN BioTECHKGL1211-500Środek do hodowli komórek
dsDNaseThermo Scientific EN0771Usunięcie matrycy DNA po transkrypcji
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTXECM830Elektroporacja komórek
EDTA Na2BioSharpBS108Środki do przygotowania roztworu buforowego TAE
Electric thermostatic water bathSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8Inkubacja z kontrolowaną temperaturą
Electrophoresis Apparatus TrophoresisLIUYIDYCP-31BNElektroforeza na żelu agarozowym
Gel Imaging analysis systemShanghHai JiaPengZF-258Wizualizacja i przetwarzanie obrazów żelowych
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5Nukleaza Cas9 do edycji genomu
Genomic DNA extraction kitTIANGENYDP304Izolacja genomowego DNA
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNEBE2040STranskrypcja in vitro sgRNA
MiniAmp ThermocyclerThermo Scientific A37834Amplifikacja PCR
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermo Scientific 2000cIlościowe oznaczanie kwasów nukleinowych
Nucleic acid stain (e.g., GeneRed)TIANGENRT211Wizualizacja DNA na żelu agarozowym
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578Amplifikacja PCR z wysoką wiernością
Primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptOligonukleotydy do montażu szablonu sgRNA
Tris-baseBioSharpBS083Środki do przygotowania roztworu buforowego TAE
VAHTS RNA Clean BeadsVAHTSN412-01Oczyszczanie RNA

Bibliografia

  1. Tamura, R., Kamiyama, D. CRISPR-Cas9-mediated knock-in approach to insert the GFP(11) tag into the genome of a human cell line. Methods Mol Biol. 2564, 185-201 (2023).
  2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Graf, R., Li, X., Chu, V. T., Rajewsky, K. sgRNA sequence motifs blocking efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Cell Rep. 26 (5), 1098 (2019).
  7. Hendel, A., et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).
  8. Brunetti, L., et al. Highly efficient gene disruption of murine and human hematopoietic progenitor cells by CRISPR/Cas9. J Vis Exp. (134), e57278 (2018).
  9. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  10. Bien, H. . Qiagen QIAquick gel extraction kit (28704 and 28706), centrifuge processing. , (2015).
  11. MalagodaPathiranage, K., Banerjee, R., Martin, C. T. A new approach to RNA synthesis: immobilization of stably and functionally co-tethered promoter DNA and T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 52 (17), 10607-10618 (2024).
  12. Xiao, G., et al. Direct detection from sputum for drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using a CRISPR-Cas14a-based approach. BMC Microbiol. 25 (1), 188 (2025).
  13. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
  14. Hu, Z., et al. Customized one-step preparation of sgRNA transcription templates via overlapping PCR using short primers and their application in vitro and in vivo gene editing. Cell Biosci. 9 (1), 25 (2019).
  15. Pan, C., et al. A new method to synthesize multiple gRNA libraries and functional mapping of mammalian H3K4me3 regions. Nucleic Acids Res. 51 (9), e52 (2023).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR guide RNA cloning for mammalian systems. J Vis Exp. (140), e57998 (2018).
  19. Basila, M., Kelley, M. L., Smith, A. V. B. Minimal 2'-O-methyl phosphorothioate linkage modification pattern of synthetic guide RNAs for increased stability and efficient CRISPR-Cas9 gene editing avoiding cellular toxicity. PLoS One. 12 (11), e0188593 (2017).
  20. Kratschmer, C., Levy, M. Effect of chemical modifications on aptamer stability in serum. Nucleic Acid Ther. 27 (6), 335-344 (2017).
  21. Maio, G., et al. Systematic optimization and modification of a DNA aptamer with 2'-O-methyl RNA analogues. ChemistrySelect. 2 (7), 2335-2340 (2017).
  22. Pasternak, A., et al. A chemical synthesis of LNA-2,6-diaminopurine riboside, and the influence of 2'-O-methyl-2,6-diaminopurine and LNA-2,6-diaminopurine ribosides on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 35 (12), 4055-4063 (2007).
  23. Shang, Z., et al. CRISPR/Cas12a with Universal crRNA for Indiscriminate Virus Detection. Molecules. 29 (24), 5842 (2024).
  24. Wang, Z., et al. crRNA scaffold remodeling controls CRISPR–Cas12a activity for enhanced performance. Nucleic Acids Res. 54 (5), 2310-2325 (2026).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Synteza matrycy DNAtranskrypcja in vitrooptymalizacja starter welektroforeza w elu agarozowymkompleks rybonukleoproteinowyelektroporacjaedycja genomu

Powiązane artykuły