Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja pojedynczego jądra od tkanki po endarterektomii wieńcowej pacjentów poddanych przeszczepowi tętnic wieńcowych

686 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70382

⸱

3 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology, Gujarat Biotechnology University, 2U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre

W tym artykule

Podsumowanie

Próbki tkanek po endarterektomii wieńcowej zostały przetworzone w celu wyizolowania pojedynczych jąder przy użyciu zoptymalizowanego protokołu dysocjacji. Integralność izolowanych jąder została zweryfikowana za pomocą trzech uzupełniających się podejść: barwienia trypanowym wykluczającym do oceny integralności błony, mikroskopii konfokalnej opartej na DAPI do potwierdzenia morfologii jądrowej oraz cytometrii przepływowej do ilościowej oceny wydajności i czystości jądrowej.

Streszczenie

Miażdżyca to przewlekła, postępująca choroba zapalna, charakteryzująca się nagromadzeniem blaszki nazębnej w ścianach tętnic. W trakcie powstawania blaszek niektóre zmiany stają się niestabilne, określane jako płytki wysokiego ryzyka, i mogą powodować zawał mięśnia sercowego (MI). Płytka miażdżycowa składa się z komórek mięśni gładkich, komórek śródbłonka, komórek odpornościowych, komórek tłuszczowych oraz komórek martwicy, z których każda może powodować pęknięcie płytki. Kluczowe jest badanie niejednorodności komórkowej wewnątrz blaszek miażdżycowych, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw niestabilności blaszki. Przedstawiamy łatwy do powtórzenia protokół izolowania i walidacji jąder z ludzkiej tkanki endarterektomii wieńcowej pobranej od pacjentów poddawanych operacji przeszczepu tętnic wieńcowych (CABG). Wszystkie tkanki są przechowywane na mokrym lodzie w medium Roswell Park Memorial Institute (RPMI), aby zachować integralność komórek przed zbiorem. Próbki tkanek są drobno mielone, a następnie delikatnie rozbijane mikrotłuczkiem w buforze lizy, aby rozdzielić komórki i uwolnić jądra. Następnie izolowane jądra są oceniane pod kątem integralności i wydajności za pomocą testu wykluczenia trypanowego niebieskiego w mikroskopie złożonym odwróconym. Barwienie DAPI umożliwia wizualizację nienaruszonych jąder za pomocą mikroskopii konfokalnej, a cytometria przepływowa zapewnia ilościową identyfikację opartą na fluorescencji w celu oceny wydajności izolacji jądrowej i potwierdzenia populacji jądrowej. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod izolacji poprzez dysocjację pojedynczych komórek, izolacja jądrowa zmniejsza stres komórkowy i utrzymuje natywne środowisko transkryptomiczne, zapobiegając tym samym zmianom w ekspresji genów. Wysokiej jakości przygotowanie jądrowe uzyskane tą metodą jest kompatybilne z późniejszymi zastosowaniami, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq).

Wprowadzenie

Miażdżycowa choroba sercowo-naczyniowa (ASCVD) jest wiodącą na świecie przyczyną zgonów i niepełnosprawności, a pomimo znaczących postępów terapeutycznych, jej obciążenie pozostajeniezmniejszone. Miażdżyca to przewlekła choroba zapalna ściany tętnicy, napędzana przez złożone i dynamiczne interakcje między różnorodnymi populacjami komórek, które wspólnie koordynują cichy przebieg od wczesnej choroby subklinicznej do zmieniających życie zdarzeń sercowo-naczyniowych (CV)2.

W średnich i dużych tętnicach nagromadzenie się cholesterolu w makrofagach jest cechą charakterystyczną miażdżycy3. Płytka miażdżycowa składa się z kwasów tłuszczowych, cholesterolu, komórek zapalnych, wapnia, fibryny, komórek mięśni gładkich, komórek śródbłonka oraz zanieczyszczeń komórkowych wewnątrz podśródbłonka4. Blaszki miażdżycowe dzielą się na dwa typy: niskiego ryzyka i wysokiego ryzyka. Płytki wysokiego ryzyka rozpoznaje się po tendencji do wywoływania kolejnego zdarzenia sercowo-naczyniowego, zazwyczaj poprzez mechanizmy takie jak erozja płytki lub pęknięcie5.

Cechy płytk wysokiego ryzyka obejmują duże rdzenie lipidowe, kilka komórek zapalnych, mniej komórek mięśni gładkich, cienką włóknistą czapkę, mikrozwapnienie, krwotok wewnątrzblaszkowy, naczynia neo-naczyniowe oraz martwicze jądro6. Wykrywanie blaszek wysokiego ryzyka przeprowadza się klinicznie za pomocą nieinwazyjnych i inwazyjnych metod obrazowania, mianowicie angiografii wieńcowej komputerowej (CCTA) oraz optycznej tomografii koherencyjnej (OCT), odpowiednio 7,8. Pomimo licznych postępów w obrazowaniu sercowo-naczyniowym, nadal trudno jest przewidzieć pęknięcie płytki miażdżycowej powodującej zawał mięśnia sercowego (MI), a nie zawsze jest to przydatne w warunkach klinicznych9.

Pomimo dekad badań, wciąż brakuje nam wiarygodnych, krążących biomarkerów, które mogłyby konkretnie zidentyfikować fenotypy płytk wysokiego ryzyka, co pozostawia istotną lukę w naszym klinicznym leczeniu miażdżycy. Podkreśla to potrzebę stosowania strategii molekularnych, które mogą scharakteryzować te płytki na bardziej fundamentalnym poziomie biologicznym 7,10. W tym kontekście markery oparte na RNA zyskały znaczną uwagę, ponieważ mogą uchwycić złożoną aktywność transkrypcyjną zachodzącą w mikrośrodowisku płytki11. Najnowsze osiągnięcia w sekwencjonowaniu pojedynczych komórek RNA (scRNA-seq) okazały się szczególnie skuteczne, oferując bezprecedensową rozdzielczość profilowania pojedynczych komórek w miażdżycowych płytkach oraz odkrywania odrębnych populacji komórek, wzorców ekspresji genów oraz szlaków molekularnych leżących u podstaw podatności na płytki12,13. Pomimo tych osiągnięć, istnieje niewielka wiedza na temat procesów regulacyjnych, interakcji oraz funkcjonalnego znaczenia różnych typów komórek związanych z rozwojem miażdżycy14.

Gdy obciążenie miażdżycą jest silne i rozlane, chirurgiczna rewaskularyzacja staje się ostateczną strategią leczenia. Endarterektomia wieńcowa (CE) to chirurgiczne uzupełnienie operacji przeszczepu pomostowania tętnic wieńcowych (CABG), podczas której mechanicznie usuwa się płytkę miażdżycową z rozlanie chorych tętnic wieńcowych, aby umożliwić przeszczep pomostowy i osiągnąć całkowitą rewaskularizację mięśnia sercowego15,16. Płytki miażdżyce i preparaty endarterektomii są szczególnie trudne do obróbki, ponieważ zawierają obfite ilości tkanki martwiczej, osadów lipidowych, fibryny i zwapnienia. Gdy te tkanki są rozkładane do analizy, generują one znaczne ilości zanieczyszczeń, które zatykają filtry i układy mikrofluidyczne, co czyni izolację żywotnych pojedynczych komórek niezwykle trudną17,18. W rzeczywistości jedno z badań na płytkach szyjnym wykazało, że żywotne komórki stanowiły mniej niż 1% wszystkich cząstek po przetworzeniu tkankowym; reszta to były po prostu szczątkipłaskowe 18.

Dodatkowo trudność pogłębia fakt, że płytki miażdżycowe znajdują się w stanie przewlekłego stresu metabolicznego i oksydacyjnego, gdzie komórki podlegające apoptozie, starzeniu i innym procesom zwyrodnieniowym sprawiają, że błony komórkowe stają się coraz bardziej delikatne i podatne na uszkodzenia, co czyni izolację żywotnych pojedynczych komórek niezwykle trudną 18,19,20. Mechaniczne i enzymatyczne trawienie potrzebne do przygotowania próbek do scRNA-seq często uszkadza te już uszkodzone komórki, co dodatkowo obniża żywotność i prowadzi do niskiego tempa wychwytywania komórek. Proces ten również prowadzi do selektywnej utraty populacji komórek delikatnych lub rzadkich, co wprowadza istotne uprzedzenia zarówno w danych transkryptomicznych, jak i w typach komórek reprezentowanych w końcowych wynikach. Problem ten staje się jeszcze bardziej widoczny w przypadku zwapnionych lub mocno chorych blaszek, gdzie surowe warunki przetwarzania potrzebne do rozkładu tkanki powodują dodatkowe uszkodzenia żywotności komórek 18,21,22.

Dla kontrastu, jądro pozostaje strukturalnie nienaruszone nawet w tych niekorzystnych warunkach23. Wynika to głównie z otoczki jądrowej, podwójnej lipidowej dwuwarstwy wzmocnionej przez laminy jądrowe (lamin A/C i Lamin B), które zapewniają mechaniczną sztywność i odporność na obciążenia osmotyczne, enzymatyczne i fizyczne, które łatwo zakłócają błonę plazmatyczną 24,25. Błonka jądrowa zachowuje także morfologię jądrową nawet wtedy, gdy otaczająca cytoplazma jest poważnie uszkodzona26. To sprawia, że sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq) jest bardziej praktyczną i niezawodną alternatywą dla sekwencjonowania RNA jednokomórkowego (scRNA-seq) do profilowania tkanki miażdżycowej27. Poprzez przechwytywanie informacji transkrypcyjnej z nienaruszonych jąder zamiast całych komórek, snRNA-seq omija ograniczenia narzucone przez słabą żywotność komórek i wysoką zawartość zanieczyszczeń, umożliwiając dokładniejsze i kompleksowe profilowanie transkryptomiczne mikrośrodowiska płytki18.

Dlatego w niniejszym badaniu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji jąder opracowany specjalnie dla tkanki endarterektomii wieńcowej, wykorzystujący lizę na bazie niejonowego detergentu oraz empirycznie skorygowany czas trwania lizy w zależności od stopnia zwapnienia tkanek, aby konsekwentnie uzyskać wysokiej jakości jądra o zachowanej integralności strukturalnej i RNA, odpowiednią do dalszej analizy snRNA-seq.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone za zgodą i zgodnie z wytycznymi Komitetu Etyki Człowieka Instytutu Kardiologii i Centrum Badawczego ONZ Mehta (EC/Approval/26/Cardio/14/12/2024) oraz Gujarat Biotechnology University (GBU_IHEC/2023/006). Przed pobraniem próbki uzyskano świadomą zgodę wszystkich uczestników. Do obecnego badania wybrano pacjentów poddawanych operacji pomostowania wieńcowego z endarterektomią wieńcową. Po chirurgicznym usunięciu tkanka endarterektomii została natychmiast umieszczona w bezsurowiczym medium RPMI, utrzymywana w temperaturze 4 °C i transportowana do laboratorium w ciągu około 12 godzin w krioikalu. Zobacz Tabelę materiałów , aby poznać szczegóły dotyczące wszystkich materiałów użytych w następującym protokole.

1. Izolacja jąder

UWAGA: Wszystkie etapy wykonuj na lodzie i używaj sterylnych materiałów. Przygotuj wszystkie bufory świeżo.

  1. Umyj tkankę raz lub dwa za pomocą bezsurowicowego medium RPMI, aby usunąć plamy i fragmenty krwi. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś tkankę na sterylną szalkę Petriego i zapisz wagę.
  2. Używając ostrza chirurgicznego (nr 10), pokrój tkankę na małe kawałki o rozmiarze ∼1 mm3 .
  3. Przygotuj 1 mL buforu lizy, łącząc 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 (z użyciem roztworów zapasowych po 1 M dla każdego składnika), 0,1% (v/v) Nonidet P-40 w wodzie wolnej od nukleazy. Dodawaj składniki kolejno w następującej kolejności: najpierw woda wolna od nukleazy, a na końcu Tris-HCl, NaCl, MgCl₂ i NP-40, aby uniknąć pienia.
    UWAGA: Bufor lizowy powinien być przygotowany świeżo w dniu użycia i przechowywany w chłodzie przez cały czas. Nie zastygaj.
  4. Do tkanki dodaj schłodzony bufor lizowy o pojemności 1 mL w rurce mikrowirówki o pojemności 5 mL.
  5. Lizuj tkankę na lodzie mikrotłuczkiem, delikatnie, równomiernie i na przemian kręcąc mikrotłuczkiem zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie. Kontynuuj lizę przez około 30 minut, dbając o to, by próbka pozostała zimna przez cały czas.
    UWAGA: Rozłóż tkankę do mętności. Użyj końcówki 1000 μL, aby delikatnie mieszać pipetowaniem.
  6. Przefiltruj roztwór za pomocą sitnika o wielkości poru 100 μm do rurki wirówki o pojemności 15 mL, aby usunąć zanieczyszczenia i kawałki tkanki.
    UWAGA: Filtrat powinien wyglądać mniej mętnie, z widocznymi zanieczyszczeniami na sicie.
  7. Wiruj jądra w 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą obrotowego wirnika łyżkowego.
    UWAGA: Na dnie rurki powinien utworzyć się widoczny pellet.
  8. Usuń supernatant za pomocą końcówki pipety o standardowym przekształceniu, nie naruszając granulatu.
  9. Przygotuj bufor do mycia i rezawiesji jąder, łącząc 1% albuminy surowicy bydłej (BSA) (przy użyciu 10% roztworu stock), 0,2 U/μL inhibitora RNazy (przy użyciu 20 U/μL roztworu zapasowego) w 1X soli fosforanowej Dulbecco (DPBS). Dodawaj składniki kolejno w następującej kolejności: najpierw DPBS, potem BSA, a na końcu inhibitor RNazy.
    UWAGA: Bufor powinien być przygotowany świeżo w dniu użycia i przechowywany w chłodzie na lodzie przez cały czas. Nie zastygaj.
  10. Ponownie zawiesij pellet w buforze do mycia jąder i ponownej zawiesiny. Przed użyciem schłodzić bufor na lodzie.
  11. Oceń skuteczność lizy i żywotność komórek, barwiąc 5 μL trypanowym niebieskim i licząc w hemocytometrze.
    UWAGA: Jeśli nadal są obecne żywotne komórki, wiruj w 500 x g przez 5 minut w 4 °C, a następnie powtarzaj sekcje 3-10.
  12. Przefiltruj roztwór za pomocą sita o wielkości poru 30 μm do rurki wirówki o pojemności 15 mL, aby usunąć zanieczyszczenia i grudki.
  13. Wiruj jądra w 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą obrotowego wirnika łyżkowego.
  14. Usuń supernatant za pomocą końcówki pipety o standardowym przekształceniu, a następnie ponownie zawiesij pellet w 1 mL bufora do mycia jąder i resuspendacji.

2. Charakterystyka izolowanych jąder

  1. Trypanowe barwienie niebieskie do oceny integralności jąder.
    1. Pobierz 15 μL izolowanego jądra zawiesiny w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
    2. Dodaj 5 μL barwnika trypan blue (0,4% w/v) i delikatnie wymieszaj przez pipetowanie.
    3. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby prawidłowo się zabarwić.
    4. Załaduj 10 μL mieszanki barwistej na hemocytometr.
    5. Obserwuj pod mikroskopem złożonym, odwróconym w celu obejrzenia morfologii i liczenia jąder.
  2. Analiza cytometrii przepływowej zawiesiny pojedynczego jąder
    1. Weź 1 mL zawiesiny izolowanych jąder i wiruj zawiesinę jąder w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirnika łyżkowego z obrotowym wirnikiem.
    2. Usuń supernatant za pomocą końcówki pipety o standardowym przekształceniu i ponownie zawiesij pellet w 200 μL FACS Buffer (1X PBS i 1% BSA).
    3. Podziel 200 μL jąder zawieszonych ponownie na dwa aliquoty: zachowaj 100 μL jako kontrolę bez barwienia i użyj 100 μL jako próbki barwionej.
    4. Dodaj 1 μL 4', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (1 mg/mL zapas) do barwionej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/mL. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 5 minut przed analizą cytometryczną przepływu.
    5. W cytometrze przepływowym używanym w tym badaniu używa się lasera fioletowego przy 405 nm i wykrywa przy użyciu 448/45 nm. Najpierw przeprowadź próbkę kontrolną bez barwienia i pozyskaj minimum 10 000 zdarzeń z całej populacji.
    6. Ustaw napięcie na 183 V dla rozpraszania w przód (FSC), 300 V dla rozpraszania bocznego (SSC) i 400 V dla V450 (laser DAPI). Ustaw próg na 10 000 dla FSC.
      UWAGA: Wszystkie ustawienia napięcia i wzmocnienia instrumentu są stałe na wszystkich próbkach, aby zachować spójność.
    7. Wykreśl pole rozproszenia w przód (FSC-A) względem wysokości rozpraszania w kierunku przód (FSC-H), aby odróżnić singlety od dubletów i agregatów. Narysuj bramkę wokół zdarzeń pokazującą liniową relację, aby zachować tylko jądra singletów.
    8. Wygeneruj wykres dwuwymiarowy FSC-A względem pola rozpraszania bocznego (SSC-A). Zastosuj szeroką bramkę obejmującą całą populację rozpraszania, ponieważ izolowane jądra zazwyczaj wykazują heterogeniczny profil rozpraszania bez wyraźnych podpopulacji.
    9. Stwórz dwuwymiarowy wykres gęstości (pseudokolor) SSC-A kontra Violet o obszarze 450 nm (V450-A). Użyj kontrolki niebarwionej, aby zdefiniować fluorescencję tła i precyzyjnie ustawić bramkę. Zidentyfikuj i zlokalizuj odrębną populację DAPI⁺ odpowiadającą nienaruszonym jądrom.
      UWAGA: Ponieważ stosowany jest pojedynczy fluorochrom (DAPI), kompensacja fluorescencyjna nie jest wymagana.
  3. Obrazowanie izolowanych jąder za pomocą mikroskopii konfokalnej
    1. Weź 50 μL zawiesiny jąder i dodaj 1 μL DAPI (1 mg/mL) do barwionej próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/mL, wymieszaj delikatnie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności przed obrazowaniem konfokalnym.
    2. Zamontuj 5 μL zawieszenia zabarwionych jąder na czystą szklaną szkiełkę i przykryj ją pokrywką.
      UWAGA: Unikaj fiksacji, aby zachować morfologię jądrową.
    3. Wizualizuj jądra za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego. Otwórz oprogramowanie mikroskopu konfokalnego i najpierw obserwuj w jasnym polu 10X, a potem przełącz na 40X jasne pole.
    4. Uzyskanie obrazów konfokalnych za pomocą laserowego skanującego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w detektor spektralny i obiektywy PLAN APO λD 40X (NA 0.95, RI 1.0). Wzbudzić DAPI za pomocą lasera 405 nm i zbierać emisję między 429-474 nm.
    5. Parametry obrazowania były następujące:
      1. Tryb detektora: wielokanałowy (GaAsP)
      2. Skaner: Galvano jednokierunkowy
      3. Tryb skanowania: pasmo
      4. Średnia linii: 2X
      5. Rozdzielczość: 1024 × 1024 piksele
      6. Czas zatrzymania: 2,0 μs
      7. Rozmiar otworu: 47,7 μm
      8. Moc lasera: 0,1-9,3% (w zależności od natężenia pola)
      9. Wzmocnienie detektora: 37,8-45,9%
      10. Zoom: 1,0x
      11. Kalibracja: 0,43-0,58 μm/piksel
    6. Uzyskaj wszystkie zdjęcia aparatem AX z minimalnym trybem przesłuchów i identycznych konfiguracji optycznej, a system perfect focus (PFS) powinien być aktywny podczas obrazowania, aby zachować stabilność na płaszczyźnie z.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tkanka do endarterektomii wieńcowej u ludzi została pobrana od pacjentów poddawanych operacji CABG. Tkanka została zważona i przetworzona w celu izolacji jąder, a dalsze izolowane jądra potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej (Rysunek 1).

Ocena jakości izolacji jąder w Trypanowym błębie
Zważono tkankę przechowywaną w medium RPMI i wymierzono 247,8 mg. Tkanka była drobno pokrojona, a następnie ujednoliczana w buf...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zoptymalizowany sposób izolacji jąder od ludzkiej tkanki endarterektomii wieńcowej opisany jest w obecnym protokole. Opisany tutaj protokół izolacji jądrowej został specjalnie zaprojektowany, aby przezwyciężyć krytyczne ograniczenia w pozyskiwaniu żywotnych, nienaruszonych komórek z zaawansowanych miażdżycowych blaszek wieńcowych. W przeciwieństwie do konwencjonalnych podejść scRNA-seq, które opierają się na surowym trawieniu enzymatycznym i dysocjacji mechanicznej21,30

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konfliktu interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez Indyjską Radę Badań Medycznych (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) oraz współpracę z Instytutem Kardiologii i Centrum Badawczym ONZ Mehta w Ahmedabadzie. Khushi Jani dziękuje University Grant Commission (UGC) oraz Council of Scientific and Industrial Research (CSIR) rządu Indii za przyznanie Joint CSIR-UGC NET kwalifikacji (NTA Reference No.: 241620143543).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 μ Sitnik mMiltenyi Biotech 130-098-463
30 μ Sitnik mMiltenyi Biotech 130-098-458
Albumina surowicy bydlęcejHiMediaTC546-25G
WirówkaMPWNAhttps://mpw.pl/en/offer/mpw-352r
Mikroskop złożonyNikonNA Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ts2 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)
Mikroskop konfokalny NikonNAOdwrócony mikroskop konfokalny Nikon Ti2-E (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)
PokrywkiHiMediaBG011C
Fiolka z szerokim pyskiem CRYOCHILTarsonowie883191
DAPISigmaD9542-5MG
DPBSGibco (Thermofischer)10010-023
Rurka wirówki (15 mL)Tarsonowie546021
Przepływowy cytometr  BD Biosciences663029BD FACSLyric (3L12C Instrument CEIVD)
HemocytometrAxibioCCB 100
Rurka mikrowirówki (1,5 mL)Tarsonowie500010C
Rurka mikrowirówki (5 mL)Tarsonowie500050
MgCl2SigmaM1028-100ML
MikrotłuczekTarsonowie160020
NaClSigmaS9888-500G
NP-40HiMediaMB143-100ML
Woda wolna od nukleazyGibco (Thermofischer)W4502-1L
Inhibitor RNazySigma333540201
RPMI 1640Gibco (Thermofischer)11875093
Slide Riwiera72910135
Tris-HClSigmaT2194-100ML
Trypan blue Sigma302643-25G

Bibliografia

  1. Roth, G. A., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risk factors- 1990-2019. J. Am. Coll. Cardiol. 76 (25), 2982-3021 (2020).
  2. de Winther, M. P. J., et al. Translational opportunities of single-cell biology in atherosclerosis. Eur. Heart J. 44 (14), 1216-1230 (2023).
  3. Mohebbati, R., Momeni-Moghaddam, M. A. The role of red blood cells in cholesterol accumulation and atherosclerotic plaque instability: a perspective on atherosclerosis. Curr. Cardiol. Rev. 21 (5), (2025).
  4. Ajoolabady, A., et al. Inflammation in atherosclerosis: pathophysiology and mechanisms. Cell Death Dis. 15 (11), 817(2024).
  5. Dawson, L. P., Layland, J. High-risk coronary plaque features: a narrative review. Cardiol. Ther. 11 (3), 319-335 (2022).
  6. Tong, W., et al. Highly sensitive magnetic particle imaging of vulnerable atherosclerotic plaque with active myeloperoxidase-targeted nanoparticles. Theranostics. 12 (17), 7641-7641 (2022).
  7. Lu, G., et al. Coronary computed tomography angiography assessment of high-risk plaques in predicting acute coronary syndrome. Front. Cardiovasc. Med. 8, (2021).
  8. Kinoshita, D., et al. High-risk plaques on coronary computed tomography angiography. JACC Cardiovasc. Imaging. 17 (4), 382-391 (2024).
  9. Canu, M., et al. Non-invasive multimodality imaging of coronary vulnerable patient. Front. Cardiovasc. Med. 9, (2022).
  10. Liu, X., et al. Assessment of coronary computed tomography angiography-derived plaque features in the diagnosis of optical coherence tomography-defined vulnerable plaques. Quant. Imaging Med. Surg. 15 (3), 2029-2041 (2025).
  11. Chiorescu, R. M., et al. Vulnerable atherosclerotic plaque: is there a molecular signature. Int. J. Mol. Sci. 23 (21), 13638(2022).
  12. The applications of single-cell RNA sequencing in atherosclerotic disease. Front. Cardiovasc. Med. Slenders, L., Tessels, D. E., van der Laan, S. W., Pasterkamp, G., Mokry, M. 9, (2022).
  13. Adam, C. A., et al. Novel biomarkers of atherosclerotic vascular disease-latest insights in the research field. Int. J. Mol. Sci. 23 (9), 4998(2022).
  14. Ye, W., Chen, Z., Xia, Z., Li, D. Single-cell RNA sequencing in human atherosclerotic plaques reveals a novel smooth muscle cell subtype that possesses multi differentiation potential and shapes the microenvironment. Clin. Exp. Med. 25 (1), 251(2025).
  15. Kelly, J. J., et al. Coronary endarterectomy: analysis of the society of thoracic surgeons adult cardiac surgery database. Ann. Thorac. Surg. 114 (3), 667-674 (2022).
  16. Ghatanatti, R. Coronary endarterectomy: recent trends. J. Clin. DIAGNOSTIC Res. , (2017).
  17. Li, Y., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic cell populations and differential gene expression patterns in control and aneurysmal human aortic tissue. Circulation. 142 (14), 1374-1388 (2020).
  18. Alsaigh, T., Evans, D., Frankel, D., Torkamani, A. Decoding the transcriptome of calcified atherosclerotic plaque at single-cell resolution. Commun. Biol. 5 (1), 1084(2022).
  19. Iqbal, F., Lupieri, A., Aikawa, M., Aikawa, E. Harnessing single-cell RNA sequencing to better understand how diseased cells behave the way they do in cardiovascular disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 41 (2), 585-600 (2021).
  20. Ahmad, H., et al. Single cell RNA sequencing of haematopoietic cells in fresh and frozen human atheroma tissue. Cardiovasc. Res. 121 (3), 396-404 (2025).
  21. Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circ. Res. 127 (11), 1437-1455 (2020).
  22. Williams, J. W., et al. Single cell RNA sequencing in atherosclerosis research. Circ. Res. 126 (9), 1112-1126 (2020).
  23. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J. Pathol. Transl. Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  24. Gruenbaum, Y., Foisner, R. Lamins: Nuclear intermediate filament proteins with fundamental functions in nuclear mechanics and genome regulation. Annu. Rev. Biochem. 84 (1), 131-164 (2015).
  25. Zwerger, M., Ho, C. Y., Lammerding, J. Nuclear mechanics in disease. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13 (1), 397-428 (2011).
  26. Dechat, T., et al. Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin. Genes Dev. 22 (7), 832-853 (2008).
  27. Oh, J. -M., et al. Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing. Exp. Mol. Med. 54 (12), 2128-2134 (2022).
  28. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat. Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  29. Gulko, A., et al. Protocol for flow cytometry-assisted single-nucleus RNA sequencing of human and mouse adipose tissue with sample multiplexing. STAR Protoc. 5 (1), 102893(2024).
  30. Fernandez, D. M., et al. Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques. Nat. Med. 25 (10), 1576-1588 (2019).
  31. Galvis, A. E., Fisher, H., Camerini, D. NP-40 fractionation and nucleic acid extraction in mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (20), (2017).
  32. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nat. Med. 25 (8), 1280-1289 (2019).
  33. Pan, H., et al. Single-cell genomics reveals a novel cell state during smooth muscle cell phenotypic switching and potential therapeutic targets for atherosclerosis in mouse and human. Circulation. 142 (21), 2060-2075 (2020).
  34. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  35. Litviňuková, M., et al. Cells of the adult human heart. Nature. 588 (7838), 466-472 (2020).
  36. Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes Dev. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
  37. Rani, U., et al. Evaluation of use of RPMI Medium to preserve cell morphology for pleural/peritoneal fluid cytology. J. Cytol. 39 (1), 26-29 (2022).
  38. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends Cell Biol. 31 (11), 888-897 (2021).
  39. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat. Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  40. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nat. Protoc. 11 (3), 499-524 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Blaszka mia d ycowaprotok izolacji j der kom rkowychcytometria przep ywowamikroskopia konfokalnabarwienie b knitem trypanubarwienie DAPIsekwencjonowanie RNA pojedynczych j derheterogenno kom rkowa
Izolacja pojedynczego jądra od tkanki po endarterektomii wieńcowej pacjentów poddanych przeszczepowi tętnic wieńcowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.