Integratywna analiza multiomiczna Buti Huatan Tang w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc

Podsumowanie

Wieloomiczne profilowanie Buti Huatan Tang (BTHTT) w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc ujawnia jej potencjał do modulowania osi metabolycznej IL-1R2/IL-1β-hormonu tarczycy. Prace te stanowią ramy dla dalszej mechanistycznej walidacji bioaktywnych składników BTHTT, tworząc fundament dla przyszłych badań interwencji przyczynowych, które będą potrzebne do potwierdzenia tej osi.

Streszczenie

Badanie to wykorzystało wieloomikę i ramy biologii obliczeniowej do zbadania terapeutycznego potencjału formuły Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (TCM) Buti Huatan Tang (BTHTT) przeciwko przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc (POChP). Po interwencji BTHTT zaobserwowano istotne poprawy fizjologiczne w modelu szczura. Analiza histologiczna wykazała odwrócenie patologicznych uszkodzeń płuc, natomiast badania biochemiczne i transkryptomika potwierdziły normalizację poziomów IL-1β i IL-1R2 . Dodatkowo profilowanie metaboliczne wykazało, że BTHTT korygował zaburzenia poziomów hormonów tarczycy T3 i T4. Zaobserwowano negatywną korelację między osią IL-1β/IL-1R2 a tymi hormonami tarczycy, co wskazuje, że ich regulacja wiąże się z terapeutycznym efektem formuły. Poza bezpośrednimi pomiarami, algorytmy uczenia maszynowego zidentyfikowały dziesięć genów sygnaturowych POChP z baz danych klinicznych. Analiza wzbogacenia szlaków sugeruje, że BTHTT może działać poprzez interakcje cytokiny-cytokiny-receptory oraz szlaki syntezy hormonów tarczycy. Ponadto, choć in vivo zidentyfikowano 283 składniki, związki takie jak tanshinone IIA i kryptotanshinon są obecnie uznawane za kandydatów na substancje aktywne. Ich rola jako głównych kierowców jest wspierana przez model, w którym stabilnie wiążą się z IL-1R2; wnioskowanie to opiera się na symulacjach dokowania molekularnego i dynamiki molekularnej (MD), a nie na bezpośredniej izolacji eksperymentalnej. Ogólnie dane wspierają model, w którym BTHTT wywiera wielocelowy efekt na POChP, modulując stan zapalny i homeostazę metaboliczną. To zintegrowane podejście zapewnia udoskonalone podstawy naukowe dla klinicznego zastosowania BTHTT i wskazuje konkretne ścieżki przyszłej walidacji eksperymentalnej.

Wprowadzenie

Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), jedna z najczęstszych chorób układu oddechowego w praktyce klinicznej, stała się trzecią najczęstszą przyczyną zgonów na świecie ze względu na niezwykle wysoki wskaźnik niepełnosprawności i nawracające ostre zaostrzenia¹. POChP była istotnym czynnikiem prowadzącym do utraty zdolności roboczej w populacji oraz gwałtownego wzrostu kosztów opieki rodzinnej, przy czym straty społeczne i ekonomiczne znacznie przewyższały większość chorób przewlekłych². W ramach "Inicjatywy Zdrowych Chin 2030" POChP została uznana za kluczową chorobę do profilaktyki i leczenia. Ze względu na niepełne zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw POChP, głównym leczeniem pozostało łączne stosowanie oskrzelowych dylatatorów i kortykosteroidów. Chociaż takie podejście przyniosło stosunkowo wyraźną ulgę w objawach, nie może zapobiec postępującemu pogorszeniu funkcji płuc. Ponadto długotrwałe stosowanie kortykosteroidów nieuchronnie zwiększa częstość wystąpień niepożądanych, co dodatkowo wpływa na długoterminową skuteczność leków^{oraz tolerancję} pacjentów. Badania wykazały, że nawet przy potrójnej terapii 28%–31% pacjentów nadal doświadcza ostrych zaostrzeń lub pogorszenia objawów. Dlatego opracowanie skutecznych leków na POChP pozostaje kluczowym i podstawowym zagadnieniem^w obecnych badaniach nad POChP4.

Aby sprostać tym potrzebom, opracowano klasyczne formuły TCM, takie jak Buti Huatan Tang (BTHTT), Shengmai Yin i Bu Fei Tang. Wśród nich BTHTT wyróżnił się szczególnie znaczącym efektem w tonifikacji płuc, zwiększaniu energii oraz usuwaniu flegmy w celu łagodzenia kaszlu 5,6,7,8. BTHTT była szeroko stosowana w leczeniu klinicznym POChP, nie tylko ze względu na niezwykłą skuteczność i minimalne skutki uboczne, ale także ze względu na potencjał do odwrócenia postępującego spadku funkcji płuc. Dawał wielkie obiecujące warunki w kontekście klinicznym i społecznym oraz miał potencjał do "rozwoju wtórnego" jako główny lek, o znaczącej wartości naukowej i ekonomicznej 9,10,11,12. Jednak z powodu braku systematycznych, długoterminowych badań naukowych, badania nad BTHTT zazwyczaj cierpią na niejasne zrozumienie jego podstaw składowych oraz nieokreślone główne cele działania. Zasadniczo wynikało to z istotnych braków w badaniach nad głównym mechanizmem i potencjalną podstawą substancji terapeutycznej BTHTT.

W odpowiedzi na tę cechę, integracja wielu technologii omiki, takich jak metabolomika i transkryptomika, a także wieloalgorytmowych metod eksploracji, koncentrując się na głównych korelacjach między charakterystycznymi kluczowymi genami a kluczowymi szlakami metabolicznymi w mikrośrodowisku organizmu 13,14,15, może jedynie badać istotę leczenia, ale także oceniać synergiczną skuteczność aktywnych składników. Szczególny nacisk kładzie się na oś hormonów tarczycy, ponieważ nowe badania wskazują, że dysfunkcja tarczycy jest częstą chorobą współistniejącą w POChP, często korelując ze zwiększonym stanem zapalnym ogólnoustrojowym i upośledzeniem funkcji mięśni oddechowych. Modulacja tej osi może stanowić nową ścieżkę przywracania homeostazy metabolicznej w chorobach płuc ^16,17.

Podsumowując, badanie przyjęło podejście trójtorowe, łączące integrację wieloomicznych z biologią obliczeniową, oparte na założeniu zgodności zespołów i wzorów. Z jednej strony wykorzystywał techniki farmakochemii surowicy TCM do identyfikacji składników BTHTT przenoszonych przez krew w skutecznych warunkach. Z kolei, koncentrując się na kluczowych genach charakterystycznych POChP, wykorzystano kompleksową metabolomikę tkankową do wykrywania biomarkerów chorób z endogennych małych cząsteczek oraz do precyzyjnej oceny ogólnych efektów formuły. Tymczasem, w połączeniu z wieloalgorytmowym eksplorowaniem i analizą identyfikacji transkryptomicznej, zidentyfikowano geny charakterystyczne regulowane przez BTHTT w skutecznych warunkach oraz przeprowadzono analizę korelacji między kluczowymi genami charakterystycznymi a kluczowymi szlakami metabolicznymi. Potencjalna podstawa substancji terapeutycznej została przesiewana poprzez molekularne dokowanie i analizę dynamiki molekularnej.

Na podstawie naszego systemu multi-omics oraz profilu farmakologicznego BTHTT, niniejsze badanie proponuje następujące testowalne prognozy. Modulacja przeciwzapalna: Interwencja BTHTT znacząco zredukuje markery zapalenia ogólnoustrojowego i płucnego, szczególnie poprzez normalizację osi ekspresji IL-1β/IL-1R2, aby złagodzić uszkodzenia tkanek. Odbudowa metaboliczna: BTHTT zmienia sygnały w szlaku syntezy hormonów tarczycy, prowadząc do mierzalnej korekty poziomu T3/T4 oraz późniejszej poprawy stanu metabolicznego mikrośrodowiska płuc. Metaboliczna renowacja: BTHTT zmienia sygnały w szlaku syntezy hormonów tarczycy, prowadząc do mierzalnej korekty poziomu T3/T4 oraz późniejszej poprawy stanu metabolicznego mikrośrodowiska płuc.

Protokół

UWAGA: Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

Pozyskiwanie danych klinicznych i ich wstępne przetwarzanie
Aby zbadać molekularne sygnatury POChP, pobrano zbiory danych transkryptomicznych z bazy Gene Expression Omnibus (GEO). Wybrano łącznie pięć zbiorów danych: GSE11784, GSE12472, GSE16972, GSE38974 i GSE222965. Surowe dane oraz pliki adnotacji platformy zostały pobrane do mapowania sondy do genu. Gdy wiele sond celowało w jeden gen, maksymalna wartość ekspresji była zachowywana. Powstałe matryce ekspresji genów (wiersze jako geny, kolumny jako próbki) zostały połączone w jeden zbiór danych odkrywczych. Aby uwzględnić techniczne różnice między różnymi platformami mikromacierzy i grupami badawczymi, korekcja efektu partii została przeprowadzona za pomocą algorytmu ComBat z pakietu sva R. Skuteczność korekty została zweryfikowana za pomocą wykresów analizy głównych składników (PCA). Po korekcie wsadowej wykorzystano połączony zbiór danych odkrywania do analizy różnicowej. Geny różnicowo ekspresyjne (DEG) między pacjentami z POChP a zdrowymi kontrolami zostały zidentyfikowane za pomocą pakietu limma. Progi istotności zostały ustalone na |logFC| ≥ 1 i p ≤ 0,05.

Aby zidentyfikować najbardziej odporne geny charakterystyczne, zintegrowano trzy niezależne algorytmy uczenia maszynowego. Aby zapewnić niezawodność modeli i zapobiec wyciekom danych, proces wyboru cech był zagnieżdżony w pętlach walidacji krzyżowych, gdzie to było możliwe, a zbiór danych odkrywania był ściśle oddzielony od niezależnych zestawów walidacyjnych. Model LASSO został zastosowany do DEG za pomocą pakietu glmnet. Zastosowaliśmy 10-krotną walidację krzyżową, aby określić optymalny parametr kary. Optymalna wartość parametru karnego odpowiadająca minimalnemu błędowi walidacji krzyżowej została wybrana jako próg do identyfikacji genów cech podstawowych. SVM było wykorzystywane do szeregowania genów na podstawie ich dyskryminacyjnej mocy. Zastosowano 10-krotną strategię walidacji krzyżowej, aby zidentyfikować punkt minimalnego błędu uogólnienia, a tym samym określić optymalną liczbę charakterystycznych genów. Pakiet randomForest został użyty do szeregowania DEG na podstawie ich średniej poprawności spadku oraz indeksu Gini. Geny o najwyższych ocenach ważności zostały wybrane jako cechy związane z chorobą.

Przecięcie cech zidentyfikowanych przez LASSO, SVM i randomForest zostało wykorzystane do określenia ostatecznych genów kluczowych cech. Diagnostyczna wydajność tych genów została oceniona za pomocą analizy krzywej Charakterystyki Operacyjnej Odbiorcy (ROC). Obszar pod krzywą (AUC) oraz powiązane 95% przedziały ufności (CI) zostały obliczone przy użyciu pakietu pROC. Gen uznano za mającycy wysoką wartość diagnostyczną, jeśli AUC > 0,70. Na koniec poziomy ekspresji i dokładność diagnostyczną tych genów zostały dodatkowo zweryfikowane w niezależnym zestawie walidacyjnym, aby zapewnić uogólnialność wyników.

Korzystając z PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) i banku leków (https://go.drugbank.com/), uzyskano łącznie 12 specyficznych profili leków, takich jak LABA, LAMA, SABA, SAMA, flutikazon propionian, budezonid, beklometazon, flutikazon, salmeterol, umeclidinium, vilanterol, teofilina. Skompilowane cele zostały skalibrowane przy użyciu bazy danych Uniprot (https://www.uniprot.org/), podczas której usunięto geny nieludzkie, a nieprawidłowe zduplikowane cele usunięto, aby uzyskać ustandaryzowane nazwy genów. Wpisując słowo kluczowe "przewlekła obturacyjna choroba płuc", "POChP" w bazach danych GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (https://www.omim.org/) oraz DisGENET (https://www.disgenet.org/), uzyskano cele związane z chorobą. Wszystkie cele z trzech baz danych zostały skonsolidowane w pliku Excel, usunięto zduplikowane geny, a dane skalibrowano za pomocą bazy Uniprot w celu uzyskania ostatecznych informacji o genach docelowych choroby.

Rozwój modelu uczenia maszynowego
Wieloalgorytmiczny framework uczenia maszynowego został zbudowany przez sekwencyjnie wykorzystujące pakiety R glmnet, e1071 oraz randomForest. Konkretnie, regresja LASSO została przeprowadzona do redukcji wymiarowości opartej na karach, analiza Support Vector Machine (SVM) została wykorzystana do oceny błędów walidacyjnych na podstawie grupowania próbek, a Random Forest do filtrowania cech według wskaźników ważności. Proces ten dał odpowiadające wizualizacje diagnostyczne, w tym krzywe walidacji krzyżowej oraz wykresy bąbelków ważności genów. Po stworzeniu modelu przeprowadzono analizę diagramu Venna na zestawach genów zidentyfikowanych przez te liczne algorytmy, aby wyodrębnić nakładające się geny cech "przecięcia", co zwiększyło wiarygodność potencjalnych biomarkerów. Następnie wyodrębniono macierz ekspresji tych genów przecięć, aby zwizualizować różnice między grupami za pomocą wykresów skrzypiec. Na koniec krzywe ROC zostały wygenerowane za pomocą iteracyjnych pętli dla każdego genu, aby obliczyć powierzchnię pod krzywą (AUC), potwierdzając ich wartość diagnostyczną jako kandydatów na biomarkery.

Indukcja modelem zwierzęcym
Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Guizhou (2303411) i przestrzegał wytycznych ARRIVE oraz przepisów dotyczących dobrostanu zwierząt. Łącznie 72 samce szczurów Sprague-Dawley (SD) o SPF (230 ± 20 g). Po tygodniu adaptacyjnego pobytu w warunkach standardowych (25 ± 1 °C, 50 ± 5% wilgotności, 12-godzinny cykl światła-ciemności) szczury zostały losowo podzielone na grupę kontrolną (grupa C) (n = 24) i grupę modelową (grupa M) (n = 48).

Grupa M była poddana modelowaniu dwuczynnikowemu: przerywana ekspozycja na dym papierosowy (9 tygodni, 6 dni w tygodniu, 3 papierosy klasy badawczej dziennie podzielone na 2 sesje, 30 minut na sesję) oraz intratchealna instopacja LPS (200 μg na instylację, raz co drugi tydzień)^18,19. Grupa C otrzymała równoważną objętość soli fizjologicznej w normie. Po pomyślnym modelowaniu grupy zostały losowo podzielone na grupę M (n = 12), grupę z wysoką dawką BTHTT (grupa H) (wysoka, 1× dawka kliniczna, n = 12) oraz grupę z niską dawką BTHTT (grupa L) (niska, 1/2× dawka kliniczna, n = 12), z ciągłą interwencją dawczą przez 2 tygodnie. Grupy C i M otrzymały wodę destylowaną synchronicznie.

Parametry masy ciała i spontanicznej aktywności były rejestrowane co tydzień. Na koniec modelowania i leczenia pobrano tkankę płucną, surowicę, surowicę oraz płyn płuczący oskrzelowo-pęcherzykowy (BALF). Poziomy markerów zapalnych (tj. TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, OPN i MCP-1) były mierzone metodą ELISA zgodnie z instrukcjami z zestawu. Przeprowadzono także analizy patologii tkanek oraz multiomiki.

Podawanie leczenia
Buti Huatan Tang (BTHTT) składa się z dziewięciu tradycyjnych chińskich ziół leczniczych: Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Astragali Radix, 15 g), Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix, 15 g), Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Kora Cinnamomi, 15 g), Angelica sinensis (Oliv) Diels (Angelicae Sinensis Radix, 10 g), Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma, 15 g), Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae folium, 10 g), Raphanus sativus L. (Raphani Sperm, 10 g), Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen, 10 g) oraz Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Mahoniae Folium, 10 g). Zioła były moczone w wodzie o 10-krotnej łącznej wadze przez 30 minut, a następnie dekoktowano przez godzinę. Wywar był filtrowany, a filtrat zbierano i dzielono na trzy równe części do podawania doustnego.

Na podstawie bezpieczeństwa klinicznego i skuteczności, standardowa dawka BTHTT dla dorosłych wynosiła 1,57 g∙^kg-1∙^day-1 zgodnie z wytycznymi klinicznymi. Biorąc pod uwagę współczynnik konwersji dawki dla szczurów, który wskazywał, że standardowa dawka leku dla szczurów wynosiła 6,3× dawki standardowej u ludzi, odpowiadająca grupa H dla szczurów została ustawiona na 9,9 g∙kg-1∙dzień-1, a grupa L na połowę tej dawki (4,95 g∙^kg-1∙^dzień-1). Ponieważ ostateczna skoncentrowana objętość BTHTT wynosiła 50 mL, objętość podawana dla grupy H u szczurów wynosiła około 1,6 mL, a dla grupy L około 0,8 mL. Lek podawano raz dziennie za pomocą doustnej gavage.

Tkanka i zbieranie BALF
W punktach końcowych eksperymentalnych (tydzień 9 i 11 tydzień) szczury były znieczulone poprzez zastrzyk dootrzewnowkowy z 5% pentobarbitalu sodu (1 mL/100 g). Krew pobierano z żyły wrotnej, pozostawiano na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirowano w 13 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant przechowywano w temperaturze -80 °C. Tkanki płuc były szybko zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C. BALF został pobrany przez trzy kolejne płukania z zimnym PBS.

Analiza transkryptomiki
Całkowite RNA zostało wyekstrahowane z tkanki płucnej i kontrolowane jakościowo, stosując (_{A 260}/A₂₈₀ > 1,8) (RIN ≥ 7,0. Skonstruowano biblioteki sekwencjonowania RNA: mRNA wzbogacono oligo(dT), było fragmentowane i wykorzystywane do syntezy dwuniciowego cDNA, które następnie było ligowane do adaptacji oligonukleotydów i amplifikowane przez PCR. Biblioteki były ilościowo określane i sprawdzane przed sekwencjonowaniem. W tym inspekcję dystrybucji zawartości, analizę rozkładu gęstości FPKM dla każdej próbki oraz ogólną analizę jakości RNA-seq²⁰.

Surowe dane transkryptomiczne generowane przez platformę sekwencjonowania były przetwarzane za pomocą skryptów Perl do usuwania sekwencji adapterów i odczytów niskiej jakości (odczyty z bazami Q ≤ 25, co stanowi > 60% lub N > 5%). Po tym procesie filtracji uzyskano czyste odczyty. Czyste odczyty zostały wyrównane z genomem referencyjnym za pomocą HISAT2, a poziomy ekspresji genów zostały zmierzone w celu obliczenia wartości FPKM. Przeprowadzono analizę różnicową ekspresji (z kryteriami przesiewowymi |log2FC| > 1 oraz p-adj < 0,05). Adnotacja czynników transkrypcyjnych opierała się na bazach danych Animal TFDB lub Pfam/DBD, dopasowując identyfikatory genów i informacje o domenach białkowych²¹.

Zastosowano ortologiczne mapowanie genów, aby zapewnić rzetelność metodologiczną dla walidacji międzygatunkowej. Strategia ta polegała na pozyskiwaniu ortologiów u szczurów dla podstawowych ludzkich genów (np. SRPX2, IL-1R2, TFF3) z wykorzystaniem baz danych NCBI HomoloGene i Ensembl BioMart. Selekcja była ograniczona do par genów wykazujących wyraźną relację mapowania "jeden do jednego" oraz wysoką tożsamość sekwencji białkowej. W przypadkach, gdy obecnych było wielu kandydatów, preferowano pary ortologiczne certyfikowane przez HGNC. Aby zapewnić wysoką precyzję wykrywania, zaprojektowano konkretne primery RT-qPCR oparte na sekwencjach mRNA zidentyfikowanych ortologów szczurów. Kryteria walidacji definiowano na podstawie spójności kierunku ekspresji oraz weryfikacji funkcjonalnej. Spójność kierunku ekspresji: W modelu POChP wywołanego dymem u szczurów, RT-qPCR wykazał, że trendy ekspresji genów docelowych w tkance płuc szczura były w pełni zgodne z tymi obserwowanymi w ludzkich zbiorach danych klinicznych GEO. Geny wykazujące tę samą polaryzację zmian między gatunkami uznano za posiadające cechy ochronne jako biomarkery choroby. Weryfikacja patologiczna: Po uzyskaniu spójności ekspresji przeprowadzono analizę korelacji w celu potwierdzenia udziału tych genów w patologicznej ewolucji POChP.

Workflow metabolomiki
Tkanka płucna (20–50 mg) została ujednoliczona w wstępnie schłodzonej wodzie metanolowo-acetonitrylowo-(2:2:1, v/v) i sonikowana w kąpieli lodowej. Homogenat był wirowany w 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant został skoncentrowany w próżni, ponownie rozpuszczony w wodzie acetonitrylowej (1:1, v/v) i przefiltrowany przez membranę o średnicy 0,22 μm w celu analizy LC-MS²².

Separację chromatograficzną uzyskano za pomocą kolumny UPLC na bazie amidów (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm). Temperatura kolumny utrzymywana była na poziomie 25 °C. Faza mobilna składała się z (A) wody zawierającej 25 mM octaniego amonu i 25 mM amoniaku oraz (B) acetonitrylu. Przepływ został ustawiony na 0,5 mL/min, a objętość wtrysku wynosiła 2 μL. Program elucii gradientowej przedstawiał się następująco: 0–0,5 min, 95% B; 0,5–7 min, liniowy spadek B z 95% do 65%; 7–8 min, liniowy spadek B z 65% do 40%; 8–9 min, B utrzymany na 40%; 9–9,1 min, liniowy wzrost B z 40% do 95%; 9,1–12 min, B utrzymał 95%. Podczas całej analizy próbki były przechowywane w temperaturze 4 °C w autosamplerze. Aby zapewnić stabilność systemu i wiarygodność danych eksperymentalnych, próbki analizowano losowo, z próbkami kontroli jakości (QC) rozmieszczonymi w kolejce. Analiza spektrometrii mas została przeprowadzona za pomocą ultrawydajnego systemu chromatografii cieczowej (UHPLC) sprzężonego ze spektrometrem mas. Próbki zostały zjonizowane za pomocą jonizacji elektrosprayowej (ESI) zarówno w modzie dodatnim, jak i ujemnym. Ustawienia źródła ESI i MS były następujące: gaz w nebulizatorze (Gaz 1) ustawiono na 50, gaz pomocniczy (Gaz 2) na 2, temperatura źródła jonów na 350 °C, a napięcie natryskowe (ISVF) na 3 500 V w trybie dodatnim jonów i 2 800 V w trybie ujemnym. Zakres masy dla MS1 został ustawiony od 70 do 1 200 Da, z rozdzielczością 60 000 i czasem akumulacji skanu 100 ms. W przypadku MS2 zastosowano akwizycję zależną od danych (DDA) z energią kolizji stopniowej. Zakres mas dla MS2 również został ustawiony od 70 do 1 200 Da, z rozdzielczością 60 000 i czasem akumulacji skanu 100 ms. Czas dynamicznego wykluczenia ustawiono na 4 sekundy.

Surowe dane metabolomiczne były konwertowane do formatu mzXML i następnie przetwarzane pod kątem wyrównania szczytów, korekcji czasu retencji oraz ekstrakcji obszaru szczytów. Przepływ procesu wstępnego przetwarzania danych obejmował następujące kroki: Po pierwsze, usunięto szczyty jonowe z brakującym wskaźnikiem > 50%. Po drugie, pozostałe brakujące wartości zostały sprowadzone za pomocą algorytmu KNN. Po trzecie, cechy metaboliczne o względnym odchyleniu standardowym (RSD) >50% zostały odrzucone. Jakość danych eksperymentalnych oceniano za pomocą analizy głównych składników (PCA) oraz klasteryzacji próbek QC. Kolejne analizy obejmowały statystykę univariabilną (np. testy t), statystyki wieloczynnikowe (PLS-DA), różnicowy przesiew metabolitów (VIP > 1 i p < 0,05) oraz analizę wzbogacenia szlaku KEGG (test hipergeometryczny)^23,24.

Ustanowienie metod analitycznych dla komponentów in vivo i in vitro
Przygotowanie próbek BTHTT do testów in vitro : BTHTT był ekstrahowany przez dekokcję w wodzie (2 x 30 min), skoncentrowany do 1,1–1,2 g/mL, a następnie liofilizowany. Przed analizą 600 μL roztworu proszku liofilizowanego mieszano z 400 μL metanolu, ponownie rozpuszczano w 40% metanolu i wirowano, aby zebrać supernatant.

Przygotowanie próbek BTHTT do testów in vivo : Serum zostało odproteinowane przez wymieszanie z metanolem (1:1) i wytrącenie w temperaturze −20 °C przez 30 minut, a następnie przez 20 minut w wirówce. Supernatant był suszony próżniowo i ponownie rozpuszczany w 40% metanolu, aby uzyskać ostateczną próbkę. Do przygotowania surowicy pustej + próbek BTHTT odpowiednia ilość surowicy pustej została dosypana do supernatantu in vitro BTHTT, a pozostałe kroki wykonano zgodnie z opisaniem.

Próbki były rozdzielane za pomocą systemu UHPLC wyposażonego w kolumnę UPLC o odwróconej fazie (2,1 mm × 100 mm, 1,8 μm). Temperatura kolumny była utrzymywana na poziomie 35 °C, a przepływ ustawiono na 0,3 mL/min. Faza komórkowa składała się z (A) 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie oraz (B) 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitryle. Elucia gradientowa została wykonana zgodnie z Tabelą 1.

Spektrometr mas był używany do pozyskiwania widm zarówno MS1, jak i MS2. Spektrometr masowy był sprzężony z systemem UHPLC i działał zarówno w trybach dodatniego, jak i ujemnego ESI. Parametry ESI były następujące: napięcie natryskowe 3 800 V (ESI+) / 3500 V (ESI-), ciśnienie gazu w osłonie 45 arb, ciśnienie gazu pomocniczego 20 arb, temperatura rury transferowej 320 °C oraz temperatura parownika 350 °C. Tryb detekcji został ustawiony na pełny skan/zależny od danych MS2 (Full-MS/dd-MS2) z rozdzielczościami 60 000 dla MS1 i 15 000 dla MS2. Do fragmentacji MS/MS wybrano 10 najważniejszych jonów MS1 o stopniowo znormalizowanych energiach zderzeniowych 20, 40 i 60. Zakres masy dla MS1 został ustalony od 90 do 1 300 Da.

W analizie in vivo , obejmującej próbki grupowe puste, próbki grupy dawkowanej oraz próbki grupy pustej + BTHTT, precyzyjnie wstrzyknięto 6 μL każdej próbki. Do analizy in vitro BTHTT wstrzyknięto 2 μL próbki. Każda partia próbek z grupy pustej i dawkowanej była wstrzykiwana raz, próbki grupy pustej + BTHTT w potrójnym egzemplarzu, a próbki BTHTT w pięciokopiacie.

Dane w formacie mzXML były przetwarzane, a związki identyfikowane na podstawie lokalnej, wysokorozdzielczej komercyjnej bazy danych spektrometrii mas TCM. Kryteria identyfikacji zostały ustalone następująco: błąd masowy <25 ppm dla MS1 oraz wynik dopasowania > 0,7 dla MS2 (gdzie wynik odzwierciedlał podobieństwo jonów fragmentów, a ≥0,7 to wiarygodny próg)^25,26. Analiza statystyczna obejmowała liczenie i klasyfikację związków (np. flawonoidy, alkaloidy), co było wykonywane wraz z adnotacjami z bazy danych spektrometrii masowej²⁷.

Dokowanie molekularne i symulacja MD
Aby zbadać potencjalne tryby wiązania między zidentyfikowanymi charakterystycznymi białkami a odpowiadającymi im ligandami, przeprowadzono in silico dokowanie molekularne. Trójwymiarowe struktury małych cząsteczek zostały pobrane z bazy danych PubChem, a ich konfiguracje geometryczne zoptymalizowane. Struktury krystaliczne docelowych białek zostały uzyskane z RCSB Protein Data Bank (PDB). Za pomocą PyMOL usunięto cząsteczki wody i heteroatomy, a kokrystalizowane ligandy zostały wyekstrahowane, aby zdefiniować współrzędne aktywnego miejsca. Dodano atomy wodoru, a ładunki Gasteigera przypisano za pomocą oprogramowania. Przeprowadzono symulacje dokowania, generując 15 niezależnych konformacji na jeden bieg. Do dalszej analizy wybrano konformację o najniższej energii wiązania. Aby rygorystycznie scharakteryzować interakcje niekowalencyjne, kompleksy receptor-ligand zostały przeanalizowane za pomocą profilera interakcji białko-ligandów (PLIP). UWAGA: Ważne jest, aby podkreślić, że wyniki dokowania zapewniają wsparcie strukturalne dla potencjalnych interakcji molekularnych i stanowią podstawę do dalszego dynamicznego udoskonalania; jednak nie stanowią one samodzielnego dowodu na skuteczność biologiczną.

Aby ocenić stabilność i ewolucję konformacyjną przewidywanych kompleksów białko-ligandów w warunkach fizjologicznie istotnych, przeprowadzono symulacje dynamiki molekularnej przy użyciu pakietu oprogramowania GROMACS. Pliki topologiczne zarówno dla białek, jak i ligandów zostały wygenerowane na podstawie pola siłowego GROMOS96 43a1. Każdy kompleks został umieszczony w centrum dwunastościennego pudełka, zachowując minimalną odległość 1,0 nm od krawędzi pudełek, i rozwiązany za pomocą modelu wodnego SPC. Aby zapewnić neutralność elektryczną, do systemu dodawano jony sodu lub chlorku w razie potrzeby. Minimalizacja energii była wykonywana za pomocą algorytmu najstromszego opadania aż do momentu, gdy maksymalna siła wynosiła mniej niż 1 000,0 kJ∙^mol-1∙^nm-1. System był następnie wyważany w dwóch etapach: najpierw zastosowano zespół NVT do ogrzewania systemu do 300 K na 100 ps za pomocą termostatu V-rescale; po drugie, do stabilizacji ciśnienia przy 1 barie powyżej 100 ps użyto zespołu NPT za pomocą barostatu Parrinello-Rahmana. Symulacje produkcyjne prowadzono przez łączny czas trwania 10 ns z krokiem czasowym 2 fs. Dalekosiężne oddziaływania elektrostatyczne obliczano metodą Particle Mesh Ewald (PME), natomiast krótkodystansowe oddziaływania van der Waalsa i elektrostatyczne były kontrolowane z promieniem odcięcia 1,2 nm. Aby zapewnić niezawodność symulacji, tam, gdzie to było możliwe, przeprowadzono trzy niezależne przejścia. Stabilność kompleksów oceniano ilościowo poprzez obliczenie średniego odchylenia kwadratowego korzenia (RMSD) oraz fluktuacji średniej kwadratowej podstawy korzenia (RMSF) atomów szkieletu białka względem struktury początkowej. Osiągnięcie płaskowyżu w profilu RMSD było głównym kryterium równowagi układu i stabilności strukturalnej.

Ogólna analiza statystyczna
W tym eksperymencie wykonywano obliczenia grupowe za pomocą testów t lub jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA).

Wyniki

Przewidywanie kluczowych genów charakterystycznych w POChP
Po korekcie danych klinicznych z wielu platform mikromacierzy (Plik uzupełniający 1–Rysunek S1) przeprowadzono analizę różnicowej ekspresji. Zidentyfikowano 34 geny kandydatów (32 zwykłe i 2 obniżone), w tym SRPX2, CLDN10 i TFF3 (Rysunek 1A).

Aby udoskonalić tych kandydatów w solidny podpis predykcyjny, zastosowano trzy algorytmy uczen...

Dyskusja

Synteza i utrzymanie poziomu hormonów tarczycy są istotne dla pacjentów z POChP i wykraczają daleko poza samą funkcję hormonalną, głęboko wpływając na postęp choroby, stan odżywienia, funkcję płuc oraz ogólne rokowanie 31,32,33. Szczególnie podczas ostrych zaostrzeń pacjenci z POChP często wykazywali stan podobny do niedoczynności tarczycy, określany jako "zespół niskiego T3". Zgłoszono, że obniżony poziom hormonów tarczycy był ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acetonitryl (stopień chromatograficzny)	Merck, Niemcy	1499230-935
Agilent 4150 bioanalyzer	Agilent Technologies, USA
Octan amonu	SIGMA, Niemcy	SRE0035-20230321
Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Angelicae Sinensis Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny	20240807
Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Astragali Radix) i tak dalej;	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny	20240601
ChemOffice		Oprogramowanie do rysowania struktury chemicznej i modelowania molekularnego
Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Kora Cinnamomi),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny	20240901
Wirówka Eppendorf 5430 R	Eppendorf, Niemcy
Eksperymentalne papierosy	Harbin Taihua, Chiny	20230208
GraphPad Prism 8		Oprogramowanie do analizy statystycznej i tworzenia wykresów
Papierosy Huangshan		Papierosy o jakości badawczej do eksperymentów z ekspozycją na dym
IL-1β Zestaw ELISA	Szanghajska biotechnologia powiązana z enzymami, Chiny	E-EL-R0012c-20230522
Platforma sekwencjonowania Illumina Novaseq 6000	Illumina, USA
Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny	20240201
Lepidium sativum L. (Raphani Sperm)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny	20240301
Lipopolisacharyd (LPS)	Shandong Huino Pharmaceutical, Chiny	20230315
Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Folium Mahoniae)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny	20240301
Metanol (klasa chromatograficzna)	Fisher, USA	DK745764
Nanodrop ND-2000 spektrofotometr	Thermo Scientific, USA
Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae folium)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny	20240510
Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny	20250201
Fluorometr Qubit 4.0	Thermo Fisher Scientific, USA
Zestaw do budowy biblioteki RNA	ABclonal, USA	RK20301-20230415
SMINA		Oprogramowanie do dokowania molekularnego
Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chiny	20240902
Rejestrator spontanicznych aktywności małych zwierząt (KW-ZF)	Nanjing Karlvin Biotechnology, Chiny
Pentobarbital sodu	Shanghai Experimental Reagent Procurement Company, Chiny	20230412
TNF-α Zestaw ELISA	Szanghajska biotechnologia powiązana z enzymami, Chiny	E-EL-R2856c-20230522
Baza danych MS z medycyny tradycyjnej chińskiej (Shanghai Applied Protein Technology Co., Ltd.)		komercyjna baza danych spektrometrii mas tradycyjnej medycyny chińskiej
Odczynnik Trizol	Magen, Chiny	20230508
UPLC BEH kolumna amidowa		Kolumna analityczna UHPLC oparta na amidach
Kolumna UPLC HSS T3		Kolumna analityczna UHPLC z odwróconą fazą (typ T3)
System Vanquish Neo UHPLC-Orbitrap Exploris 480 MS	Thermo Scientific, USA
System MS Vanquish UHPLC-Q-Exactive HF-X	Thermo Scientific, USA