Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybka produkcja rekombinowanego rybonukleazy SLFN14 u człowieka oraz analiza stechiometryczna za pomocą fotometrii masowej

961 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70393

⸱

20 lutego 2026

 ,  , 
1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje produkcję rekombinowanej ludzkiej rybonukleazy SLFN14 oraz jej stechiometryczną analizę za pomocą fotometrii masowej.

Streszczenie

Rybonukleazy to wyspecjalizowana klasa białek wiążących RNA, które katalizują rozszczepienie RNA i przyczyniają się do różnych procesów biologicznych, w tym regulacji genów. Niemniej jednak struktura, funkcja i regulacja wielu ludzkich rybonukleaz pozostają słabo scharakteryzowane ze względu na wyzwania związane z produkcją białek rekombinowanych. Metoda ta opisuje efektywne podejście do ekspresji, oczyszczania i stechiometrycznej analizy rybonukleazy Schlafen 14 (SLFN14) u człowieka. SLFN14 z oznakowaniem rekombinantowym flagowym był wyrażany w komórkach zawiesinowych HEK293 i izolowany za pomocą szybkiego, dwuetapowego procesu oczyszczania obejmującego chromatografię anty-Flag affinity, a następnie niskorozdzielczą chromatografię wykluczenia wielkościowego. Fotometria masowa, czuła technika pojedynczą, wykazała, że w warunkach fizjologicznych SLFN14 tworzy stabilny homodimer związany z komórkowym RNA, podczas gdy wysoka ilość soli sprzyja dysocjacji RNA, zachowując układ homodimerów. Powstałe rekombinowane ludzkie białko SLFN14 nadaje się do dalszych badań strukturalnych oraz jakościowych testów biochemicznych. To szybkie podejście do izolacji i charakteryzacji próbek przez rekombinowane ludzkie białka jest szeroko zastosowane do produkcji innych rybonukleaz ssaków oraz białek wiążących RNA, przeznaczonych do charakterystyki biofizycznej i biochemicznej.

Wprowadzenie

Schlafen 14 (SLFN14) to niedostatecznie zbadany rybonukleaz i czynnik restrykcyjny ssakówgospodarza 1,2,3. Ludzkie białko SLFN14 należy do sześcioosobowej rodziny regulatorów genów SLFN, odgrywających rolę w odporności, aktywności przeciwwirusowej, chemowrażliwości oraz różnicowaniu komórek 4,5,6,7,8. Mechanistyczne wglądy w rolę regulatorów genów SLFN pozostają niepełne; jednak wielu członków prowadzi działalność rybonukleazową niezbędną do kontroli translacyjnej 7,9. Rybonukleazy SLFN są aktywowane podczas homodymeryzacji białek, tworząc szczelinę wiążącą RNA złożoną w rozszczepieniu substratu10,11. Aby chronić komórki przed fałszywym rozszczepieniem RNA, większość rybonukleaz SLFN istnieje głównie jako monomer i oczekuje na aktywację przez sygnały molekularne specyficzne dla każdego członka rodziny 5,7,11,12.

Rekombinowana produkcja ludzkiego SLFN14 umożliwiła kompleksowe badania molekularne tego wcześniej niedostatecznie zbadanego rybonukleazy, dostarczając nowych informacji na temat jego funkcji i regulacji 2,13,14. Oczyszczone rekombinowane białko SLFN14 przyspieszyło charakterystykę swojej aktywności transferowej RNA zależnej od struktury przy użyciu testów in vitro RNAna cięciu RNA 2,14. Badania kriomikroskopii elektronowej (cryoEM) oczyszczonego białka SLFN14 ujawniają również układ homodimerów SLFN14, gdzie dupleksowane RNA ładuje się do centralnej szczeliny 2,13,14. Zespół wyższego rzędu SLFN14 został dodatkowo scharakteryzowany przez fotometrię masową, technikę pojedynczej cząsteczki do pomiaru masy cząsteczkowej. Niespodziewanie, ta wrażliwa technika pokazuje, że SLFN14 głównie tworzy homodymer odporny na sól, ale może także tworzyć homotetramer wrażliwy na sól o nieznanej funkcji 2,13,14. Łącznie możliwość uzyskania oczyszczonego ludzkiego białka SLFN14 była kluczowym kamieniem milowym, umożliwiającym wczesne molekularne wglądy, które z pewnością zainspirują ekscytujący nowy etap badań nad kontrolą translacyjną pośredniczoną przez SLFN14.

Rekombinowana rybonukleaza SLFN14 historycznie była trudna do pozyskania przy użyciu standardowych strategii produkcji białek. Oryginalny raport opisujący aktywność enzymatyczną SLFN14 zauważał jego niską wydajność, obniżoną stabilność i niską rozpuszczalność1. Ludzkie białko SLFN14 charakteryzuje się długim łańcuchem polipeptydowym, wyraźną hydrofobowością oraz cytotoksycznością zależną od rybonukleazy, które razem w dużej mierze utrudniają stosowanie konwencjonalnych systemów ekspresji bakterii 1,13,14. Jednak zaawansowane maszyny translacji eukariotycznej i chaperonów oferują potężną alternatywę, która efektywnie produkuje pełnowymiarowe ludzkie białkoSLFN14 15. Zarówno systemy ekspresji baculowirusa, owada i ssaków zostały wykorzystane do uzyskania pełnowymiarowego ludzkiego białka SLFN14 do badań krioEM oraz testów biochemicznych 2,13,14. Jednak w niektórych przypadkach białko SLFN14 pochodzące od owadów wymagało mutacji stabilizującej, aby zapobiec agregacji próbek2. Dostarczanie genów za pomocą bakulowirusa wiąże się również z dużym zaangażowaniem i długim czasem realizacji, co opóźnia postęp badań15,16. Z kolei rekombinowane białko SLFN14 izolowane z gospodarza ekspresyjnego ssaka oferuje przewagę szybkości i eliminuje konieczność inżynierii białek podczas optymalizacji próbek.

Metoda ta została zaprojektowana tak, aby zapewnić stosunkowo szybkie i niewymagające podejście do produkcji rekombinowanego białka typu dzikiego typu SLFN14, odpowiedniego do dalszych badań molekularnych. Wykorzystanie komórek ssaków zapewnia niemal naturalne środowisko do zachowania prawidłowego fałdowania białek bez potrzeby inżynierii białek SLFN1413. Metoda dostarczania genów oparta na chemikaliach, w przeciwieństwie do strategii wektora wirusowego, również przyspiesza czas produkcji z miesięcy do15 dni. Aby zrównoważyć stosunkowo wysokie koszty hodowli komórek ssaków, metoda ta wykorzystuje ekonomiczny odczynnik transfekcyjny polietyliminy (PEI) oraz efektywne komórki transfekcyjnie 293 (HEK293) w zawiesinach 17,18. Aby zminimalizować utratę białek podczas przetwarzania próbek, procedura ta wykorzystuje również strategie niskiego spożycia próbki do oczyszczania białek SLFN14 oraz analizy stechiometrycznej do kontroli jakości próbki. Ten czterodniowy protokół zawiera szczegółowe informacje dotyczące przeprowadzenia 1) ekspresji genów przejściowych w komórkach HEK293, 2) dwuetapowego workflow chromatografii z użyciem kolumn spinowych oraz 3) określenia stechiometrii białek za pomocą fotometrii masowej. Końcowym produktem tego zabiegu jest ludzkie białko SLFN14 typu dzikiego typu zawierające podwójny C-końcowy znacznik Myc-Flag (SLFN14Myc-Flag), który może być wykorzystywany do dalszych badań krioEM oraz jakościowej charakterystyki biochemicznej13. To wszechstronne podejście można zastosować do izolowania i charakteryzowania innych niedostatecznie zbadanych ludzkich białek wiążących ludzkie RNA, szczególnie dużych i cytotoksycznych genów rybonukleazy, które często są trudne do nadekspresji w heterologicznych układach ekspresji. W związku z tym protokół ten obniża barierę kompleksowej charakterystyki molekularnej ludzkiego proteomu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty z udziałem hodowli komórek HEK293 powinny być przeprowadzane w warunkach poziomu biobezpieczeństwa 2 (BSL-2) zgodnie z zatwierdzonymi protokołami biobezpieczeństwa instytucjonalnego.

1. Przejściowa ekspresja SLFN14Myc-Flag w komórkach ssaków

  1. Nasiać komórki zawiesiny HEK293 ssaków o pojemności 0,5 x 10,6 komórek/mL do podgrzanego, bezsurowicowego medium wzrostu na końcową objętość 320 mL w przewietrzonej kolbie o pojemności 1 L.
  2. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C, 125 obr./min, 8%CO2, wilgotności 75-80% przez 24-32 godziny.
  3. Sprawdź, czy liczba komórek wynosi 1,2-10 x 10,6 komórek/mL i żywotność powyżej 90%, używając barwnika trypanowego niebieskiego i licznikakomórek 19.
  4. Przelej 40 mL hodowli do ośmiu stożkowych probówek.
  5. Komórki pobierać przez wirowanie w dawce 400 x g przez 5 minut w temperaturze 20-25 °C.
  6. Wyrzuć podłoże wzrostu.
  7. Delikatnie zawiesz każdą granulkę komórkową w 38 mL podgrzanego, bezsurowicznego medium transfekcyjnego, aby uzyskać końcową objętość 304 mL.
    UWAGA: Pozostałe 16 ml oryginalnej objętości hodowli opisanej w kroku 1.1 zostanie dostarczone przez mieszankę transfekcyjną opisaną w kroku 1.12.
  8. Przełóż ogniwa do nowej piersiówki o pojemności 1 L z przegrodą z przegrodą.
  9. W stożkowej probówce dodaj 320 μg oczyszczonego DNA plazmidowego kodującego rekombinowany gen SLFN14Myc-Flag do 8 ml bezsurowicznego medium transfekcyjnego i inkubuj przez 5 minut w temperaturze 20-25 °C.
    UWAGA: Stężenie plazmidów wynosi zazwyczaj 500 ng/μL przy końcowej objętości 640 μL.
  10. Równocześnie z krokiem 1,9 należy dodać 960 μg sterylizowanego PEI filtrem 0,22 μm do 8 ml bezsurowicznego medium transfekcyjnego i inkubować przez 5 minut w temperaturze 20-25 °C.
    UWAGA: Materiał roboczy to zazwyczaj 1 mg/mL przy końcowej objętości 960 μL.
  11. Powoli dodawaj mieszaninę PEI (patrz krok 1.10) kropelo do roztworu DNA plazmidowego rekombinowanego (patrz krok 1.9) i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 20-25 °C.
  12. Powoli dodawaj 16 ml mieszaniny DNA/PEI kroplami do komórek przygotowanych w kroku 1.8.
  13. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C, 125 obr./min, 8%CO2, wilgotności 75-80% przez 48 godzin.
  14. Przelej 40 mL transfekowanych komórek do ośmiu stożkowych probówek.
  15. Pobrano transfekowane komórki przez wirowanie w dawce 400 x g przez 5 minut w temperaturze 20-25 °C.
  16. Przelej supernatant i przechowuj ośmiokomórkowe granulki w temperaturze -80 °C.

2. Dwustopniowa rekombinowana oczyszczanie SLFN14Myc-Flag

  1. Chromatografia powinowactwa antyflagowego.
    Wykonaj protokół chromatografii anty-Flag w duplikacie, używając czterech granulek komórkowych od kroku 1.16 dla każdego przygotowania.
    1. Przygotowanie żywicy.
      1. Wyrównuj żywicę antyflagową agarozową do 20-25 °C przez 15 minut.
      2. Delikatnie ponownie zawiesić żywicę, odwracając butelkę tuż przed przelaniem 40 μL zawiesiny żywicy 50% do rurki mikrowirówki o pojemności 2 mL.
        UWAGA: Odetnij koniec końcówki pipety, aby łatwo zebrać lepką zawiesinę.
      3. Ponownie zawiesić żywicę w 1 mL buforu wysokosolnego (50 mM Tris pH 7,4, 600 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20).
      4. Inkubuj przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
      5. Wiruj zawiesinę żywiczną w ilości 8 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
      6. Aspiruj i wyrzucaj bufor High Salt Wash, uważając, aby nie naruszyć żywicy.
    2. Wyjaśnienie lizatu komórkowego.
      1. Każdą transfekcję komórki ponownie zawiesić 225 μL schłodzonego buforu resuspendacyjnego (50 mM Tris pH 7,4, 600 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,5% Triton-X-100, 1 mM PMSF, 5 μg/mL Leupeptyny, 1 mM Benzamidyny, 0,7 μg/mL Pepstatyny A, 0,25 U/mL nukleazy Genius) dla łącznej objętości 900 μL w czterech pelletach komórkowych.
      2. Przełóż ogniwa do rurki mikrowirówki o pojemności 2 mL, która została wcześniej schłodzona na lodzie.
      3. Inkubuj rurkę mikrowirówki poziomo na nutatorze przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
        UWAGA: Przechowuj 20 μL aliquot całkowitego lizatu w temperaturze -20 °C w celu rozwiązywania problemów w przypadku niskiej ekspresji białek.
      4. Lizat komórkowy klaruj przez wirowanie w dawce 21 300 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Wychwytywanie i płukanie powinowactwa białkowego.
      1. Połącz oczyszczony lizat (patrz krok 2.1.2.4) z wyrównaną żywicą antyflagową (patrz krok 2.1.1.6).
      2. Inkubuj mieszaninę lizatanu i żywicy w rurce mikrowirówki ustawionej poziomo na nutatorze przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
      3. Wiruj mieszaninę lizatanu i żywicy w 8 000 x g przez 2 minuty w 4 °C, aby utworzyć granulat żywicy.
      4. Usuń około 700 μL supernatantu, uważając, aby nie rozbić granulki żywicy.
        UWAGA: Przechowuj aliquot 20 μL supernatantu w temperaturze -20 °C po wiązaniu żywicy, aby rozwiązywać problemy w przypadku niskiej wydajności wychwytu.
      5. Ponownie zawiesić pozostałą mieszankę żywicy i supernatantu i przenieść roztwór do pustej kolumny spinowej o pojemności 800 μL, która została włożona do pustej rurki mikrowirówki o pojemności 2 mL.
      6. Wiruj kolumnę wirową w 1000 x g przez 2 minuty w 4 °C i odrzucaj przepływ.
      7. Przepłucz pustą rurkę mikrowirówki od etapu 2.1.3.5 500 μL bufora wysokosolnego i przelej roztwór do kolumny spinowej.
        UWAGA: Ten krok pomaga odzyskać resztki żywicy pozostającej w rurce mikrowirówki.
      8. Wiruj kolumnę wirową w 1000 x g przez 2 minuty w 4 °C i odrzucaj przepływ.
      9. Dodaj 500 μL buforu wysokosolnego do kolumny spinowej. Wiruj kolumnę wirową w 1000 x g przez 2 minuty w 4 °C i odrzucaj przepływ. Powtarzaj ten krok, łącznie cztery płukania o wysokiej ilości soli.
      10. Dodaj do kolumny spinowej 500 μL buforu płukania o niskiej zawartości soli (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20). Wiruj kolumnę wirową w 1000 x g przez 2 minuty w 4 °C i odrzucaj przepływ. Powtarzaj ten krok, aby dać łącznie dwa płukania o niskiej zawartości soli.
      11. Dodaj do kolumny spinowej 500 μL buforu ATP Wash Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20, 10 mM ATP). Zatkaj dno kolumny spinowej i inkubuj przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odłącz kolumnę spinową i wiruj w 1000 x g przez 2 minuty w 4 °C i odrzucaj przepływ. Powtarzaj ten krok, aby uzyskać łącznie cztery płukania ATP.
      12. Wykonaj końcowe płukanie, dodając 500 μL bufora niskosolnego do kolumny spinowej. Wiruj kolumnę wirową w 1000 x g przez 2 minuty w 4 °C i odrzucaj przepływ.
    4. Elution białka przez peptyd 3xFlag.
      1. Osusz dolną część kolumny wirującej ściereczką o niskiej ilości kłaczków, aby usunąć nadmiar płynu i zatkać dolną część kolumny spinującej.
      2. Bezpośrednio na żywicę dodaj 55 μL buforu 3xFlag Elution Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20, 300 μg/mL 3xFlag peptydu).
      3. Zamknąć otwór kolumny wirowej parafilmem i umieścić kolumnę w rurce mikrowirówki o pojemności 1,7 mL.
      4. Inkubuj kolumnę wirową pionowo na nutatorze przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
        UWAGA: Aby utrzymać kolumnę wirową pionowo, zamontuj na nutatorze stojak rur mikrowirówek za pomocą gumek.
      5. Usuń parafilm i korek kolumny obrotowej. Pobierz eluowane rekombinowane białko SLFN14Myc-Flag w czystej probówce mikrowirówki o pojemności 1,7 mL przez wirowanie w dawce 1000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
      6. Zachowaj 50 μL eluatu anty-Flag do dalszej chromatografii wykluczania rozmiaru oraz 5 μL do analizy SDS-PAGE.
  2. Chromatografia wykluczająca rozmiar.
    Wykonaj protokół chromatografii wykluczenia rozmiaru z użyciem buforu odsolonego o niskiej zawartości soli (150 mM NaCl) do standardowej analizy białek SLFN14Myc-Flag lub buforu odsolonia o wysokiej zawartości soli (500 mM NaCl) do charakterystyki apo SLFN14Myc-Flag .
    1. Połącz dwie eluaty anty-żywicy o pojemności 50 μL z etapu 2.1.4.6, aby uzyskać łącznie próbkę 100 μL.
    2. Przygotuj kolumnę odsolniającą o pojemności 0,5 mL z odcięciem masy cząsteczkowej 40 kDa, poluzując korek, zdejmując dolne zamknięcie i wkładając kolumnę do rurki mikrowirówki o pojemności 2 mL.
    3. Wiruj kolumnę odsalania w 700 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C, aby usunąć roztwór magazynujący w kolumnie. Zrezygnuj z przepływu.
    4. Dodaj 300 μL bufora odsolania o niskiej lub wysokiej zawartości soli (20 mM Tris pH 7,4, 150/500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM TCEP) do kolumny odsalania spinowego. Wiruj kolumnę wirową w 700 x g przez 1-2 minuty w 4 °C i odrzucaj przepływ. Wykonaj ten krok trzy razy, aby w pełni wyrównać kolumnę.
    5. Osusz dno kolumny odsalania wirującej o niskiej ilości kłaczków.
    6. Przenieś kolumnę odsalania spinowego do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,7 mL.
    7. Dodaj 100 μL połączonego eluatu anty-Flag (patrz krok 2.2.1) do środka warstwy kolumny, nie zakłócając przy tym żywicy.
    8. Elutuj rekombinowane białko SLFN14Myc-Flag , wirując kolumnę odsolania spinową w ilości 700 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
    9. Zachować 95 μL odzyskanego białka rekombinowanego do charakteryzacji molekularnej oraz 5 μL do analizy SDS-PAGE.
  3. Scharakteryzować oczyszczoną próbkę białka zflagą myc-flag SLFN14.
    1. Wykonaj elektroforezę żelową z dodecylosiarczanem sodu poliakrylamidowym (SDS-PAGE).
      1. Połącz 5 μL buforu próbki 2x Laemmli z 5 μL alikwotami próbki pobranej na różnych etapach protokołu oczyszczania.
      2. Próbki cieplne w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
      3. Rozdziel szeroką drabinę białek wraz z 10 μL mieszaniny próbki i buforu Laemmli o 4-15% SDS-PAGE przy napięciu 200V przez 30 minut.
      4. Wizualizuj pasma białkowe, barwiąc żel roztworem barwienia Coomassie G-250 przez 30 minut na orbitalnym shakerze i odbarwiaj żel dejonizowaną wodą na orbitalnym shakerze, aż tło będzie czyste.
      5. Sprawdź powstałe pasma białkowe, aby upewnić się, że pobrana próbka z etapu 2.2.9 jest pojedynczym pasmem białkowym odpowiadającym teoretycznej masie cząsteczkowej SLFN14Myc-Flag wynoszącej 107,5 kilodalton (kDa).
    2. Ilościowo określić białka i kwasy nukleinowe za pomocą spektrofotometrii UV/vis (spektrofotometrii UV/vis).
      1. Wyłącz mikroobjętościowy spektrofotometr z 2 μL buforu odsolonia o niskiej lub wysokiej zawartości soli, odpowiadając buforowi magazynującemu białko.
      2. Zmierz absorpcję przy 260 nm i 280 nm z 2 μL odzyskanego rekombinowanego białka SLFN14Myc-Flag (patrz krok 2.2.9) za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
      3. Oblicz stężenie białkaMyc-Flag rekombinowanego SLFN14, używając zarejestrowanej absorbancji przy 280 nm oraz jej współczynnika wygaszania (93330 M-1 cm-1) według prawa Beer-Lamberta20.
      4. Oblicz współczynnik absorpcji próbki A260/280, dzieląc wartość absorbancji zarejestrowaną przy 260 nm przez wartość absorbancji zmierzoną przy 280 nm, aby określić, czy kwas nukleinowy współoczyszcza z rekombinowanym białkiem SLFN14Myc-Flag .
        UWAGA: Stosunek A260/280 powyżej 0,7 prawdopodobnie wskazuje na obecność kwasunukleinowego 21.
    3. Ilościowo określ komórkowe RNA za pomocą fluorometrii.
      1. Ilościowo określ zawartość RNA, używając 1-3 μL odzyskanego białka rekombinowanego z etapu 2.2.9, używając fluorescencyjnego barwnika22 o wysokiej czułości stypyzowanego dla RNA.

3. Analiza masy cząsteczkowej SLFN14Myc-Flag za pomocą fotometrii masowej

  1. Konfiguracja instrumentu z fotometrem masowym.
    1. Włącz laser za pomocą przełącznika z tyłu skrzynki elektronicznej fotometru masowego.
    2. Włącz deck izolacyjny i kliknij przycisk "izolacja", aby zminimalizować drgania instrumentów.
    3. Otwórz oprogramowanie AcquireMP.
    4. Poczekaj godzinę, aż instrument osiągnie równowagę termiczną.
  2. Przygotowanie preparatów okładkowych.
    1. Trzymaj szklaną osłonę w pozycji pionowej za pomocą miękkiej pęsety.
    2. Opłucz obie strony szklanej pokrywy wodą ultraczystą typu I, a następnie użyj alkoholu izopropylowego. Powtórz ten krok łącznie trzy razy.
    3. Płucz każdą stronę szklanej pokrywy po raz ostatni raz wodą ultraczystą typu I przez 45 sekund.
    4. Delikatnie usuwaj nadmiar kropel wody z szklanej pokrywy poprzez aspirację, używając czystej końcówki pipety podłączonej do linii próżniowej.
    5. Przechowuj szkieletową okładkę w plastikowym pudełku wyłożonym papierem do obiektywu, aby przetransportować go do fotometru masy.
  3. Zamontuj suwak pokrywy na instrumencie.
    1. Umieść silikonową uszczelkę z 6 dołkami na metalowym narzędziu wyrównującym za pomocą miękkiej pęsety.
    2. Umieść czysty szklany pokrywak z kroku 3.2.5 na silikonową uszczelkę i delikatnie dociskaj miękką pęsetę wokół silikonowej uszczelki.
      UWAGA: Nie wywieraj nacisku na studnie próbkowe.
    3. Umieść kroplę oleju immersyjnego na okulusie fotometru masowego.
    4. Odwróć szkiełkę oklepu tak, aby silikonowa uszczelka była skierowana do góry i delikatnie umieść szkiełkę na oculusie za pomocą miękkiej pęsety.
    5. Zabezpiecz lewy górny i prawy dolny róg szkła za pomocą magnesów.
    6. W trybie sterowania bocznego wybierz lewy górny dół w oprogramowaniu AcquireMP, aby wyrównać laser ze środkiem studni.
  4. Analizuj szerokie standardy białek.
    1. Przygotuj 50x roztwór kalibaru o szerokim zakresie (90 kDa do 1 MDa) przez rozcieńczenie 1 μL zapasu 500x kaliberu do 9 μL 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.
    2. Przygotuj roboczy materiał 5x kalibaru, łącząc 2 μL 50x roztworu szerokozakresowego z etapu 3.4.1 z 18 μL 1x fosforanem buforowanym solą fizjologiczną.
    3. Dodaj 10 μL 0,22 μm filtrowanego buforu odsolania o niskim lub wysokim zawartości soli do pustego otworu.
      UWAGA: Ważne jest, aby dopasować filtrowany bufor w tym kroku do bufora użytego do przygotowania próbki SLFN14Myc-Flag w kroku 2.2.9.
    4. Zamknij pokrywę.
    5. W sekcji Znajdź fokus kliknij "rozcieńczenie kropli" w oprogramowaniu AcquireMP, aby określić właściwe ognisko dołka próbki.
    6. Dodaj 10 μL roboczego materiału 5x kalibru do kropli buforu (patrz krok 3.4.3) i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać roztwór.
    7. Zamknij pokrywę.
    8. Sprawdź ustawienia instrumentów, aby upewnić się, że wartości ruchu, sygnału, nasycenia i ostrości są stabilne i optymalne.
      UWAGA: Optymalne wartości będą wyglądać na niebiesko, a wartości odstające będą pomarańczowe.
    9. Kliknij "nagrywaj" w oprogramowaniu AcquireMP, aby nagrać 60-sekundowy film.
    10. Zapisz plik wynik (.mpr) z opisowym tytułem i znacznikiem czasu.
  5. Stwórz krzywą kalibracyjną.
    1. Otwórz oprogramowanie DiscoverMP.
    2. W sekcji pomiary kliknij przycisk "+ otwórz" i przejdź do pliku wyników kalibru od kroku 3.4.10.
    3. Kliknij dwukrotnie na plik ze standardami białkowymi, aby zobaczyć wyniki.
    4. W konfiguracji wykresu dostosuj granice kontrastu odpowiednio do 0,00000 i -0,03000.
    5. Ręcznie zdefiniuj krzywą Gaussa dla pierwszych czterech standardowych pików białka, przeciągając kursor po każdym z nich.
    6. Kliknij "Create" i wybierz "mass calibration".
    7. W nagłówku kalibru przypisz każdy dopasowany pik od kroku 3.5.5 do jego znanej masy cząsteczkowej odpowiednio 86, 172, 258 i 344 kDa.
    8. Sprawdź, czy krzywa kalibracyjna ma R2 bliski 1,0 oraz maksymalny błąd masowy (MME) poniżej 2%.
    9. Kliknij "potwierdź kalibrację" i zapisz plik krzywej kalibracji (.mc).
      UWAGA: Fotometr masowy powinien być kalibrowany co godzinę.
  6. Analizuj rekombinowane białko SLFN14Myc-flag w warunkach o niskiej i wysokiej zawartości soli.
    1. Przygotuj roztwór 50 μL rekombinowanego białka SLFN14Myc-Flag o pojemności 50 nM (patrz krok 2.2.9) z użyciem buforu odsolonia o niskiej zawartości soli do standardowej analizy próbek w warunkach fizjologicznych lub buforu odsolowania wysokosolnym do charakteryzacji próbki białka apo.
    2. Wiruj mieszaninę białek SLFN14Myc-Flag o pojemności 50 nM w dawce 21 300 x g przez 10 minut w temperaturze 20-25 °C, aby usunąć potencjalne kruszyny białkowe i pył.
    3. W trybie sterowania bocznego kliknij "następna studnia" w oprogramowaniu AcquireMP.
    4. Do studni załaduj 10 μL przefiltrowanego bufora odsolonia o niskim lub wysokim zawartości soli o pojemności 0,22 μm i zamknij pokrywę.
      UWAGA: Ważne jest, aby w tym kroku dopasować filtrowany bufor do bufora użytego do przygotowania rozcieńczenia próbki SLFN14Myc-Flag w kroku 3.6.1.
    5. W sekcji znajdź fokus kliknij "rozcieńczenie kropli", aby określić właściwe ognisko nowej studni próbki.
    6. Załaduj 10 μL rekombinowanego roztworu białka SLFN14Myc-Flag o masie 50 nM od kroku 3.6.2 do kropli buforowej i delikatnie pipetuj w celu wymieszania próbki.
    7. Zamknij pokrywę i upewnij się, że ustawienia instrumentów są optymalne zgodnie z krokiem 3.4.8.
    8. Kliknij "nagrywaj" w oprogramowaniu AcquireMP, aby nagrać 60-sekundowy film.
      UWAGA: Optymalna rozdzielczość masy osiąga się na podstawie 60-sekundowego filmu z łączną liczbą około 1000-4000 nagrań.
    9. Zapisz plik wynik (.mpr) z opisowym tytułem i znacznikiem czasu.
  7. Oblicz masę cząsteczkową i stechiometrię rekombinowanego białka SLFN14Myc-Flag .
    1. W sekcji pomiarów w oprogramowaniu DiscoverMP kliknij przycisk "+ otwórz", aby wybrać plik wyników z kroku 3.6.9.
    2. W sekcji kalibracji kliknij dwa kliknięcia na plik krzywej kalibracji utworzony w kroku 3.5.9, aby zastosować kalibrację.
    3. Ręcznie zdefiniuj krzywą Gaussa dla każdego obserwowanego gatunku SLFN14Myc-Flag , przesuwając kursor po każdym piku, aby uzyskać obliczoną wartość masy cząsteczkowej.
    4. Oblicz średnią masę cząsteczkową dla każdego oligomerowego gatunku na podstawie trzech niezależnych pomiarów, wraz z odpowiadającym jej odchyleniem standardowym.
    5. Określ stechiometrię rekombinowanego białkaMyc-Flag SLFN14 poprzez ocenę średniej obliczonej masy cząsteczkowej z liczbami całkowitymi wartości teoretycznej masy protomeru SLFN14Myc-Flag .
      UWAGA: Teoretyczna masa monomeru SLFN14Myc-Flag wynosi 107,5 kDa, dimer 215 kDa, trimer 322,5 kDa, a tetramer 430 kDa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wektor ssaków zaprojektowany do przejściowej ekspresji genów pełnowymiarowego ludzkiego białka SLFN14Myc-Flag jest zilustrowany na Rysunku 1. Dwuetapowy proces oczyszczania przedstawia izolację białkaMyc-Flag SLFN14 z komórek HEK293 (Rysunek 2A). Skuteczny reprezentatywny żel denaturujący oczyszczonego białkaMyc-Flag SLFN14 pokazano na Rysunku 2B. Etap chromatografii powinowactwa opiera się na selekt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kilka kluczowych kroków podkreśla wydajność i wszechstronność tego protokołu produkcji białek. Aby zmaksymalizować wydajność białek rekombinowanych, wykorzystujemy komórki HEK293, które mają wysoki pobór obcych plazmidów i mogą być hodowane w zawiesinach, aby zmaksymalizować gęstość komórek w średniej objętości23. W tym szeroko skalowym protokole dostarczania transgenów stosuje się odczynniki PEI, ponieważ pozwala osiągnąć wysoką efektywność transfekcji przy stosunkowo niskich kosztach w porównani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Pillon za krytyczną lekturę tego rękopisu. Prace te były wspierane przez Program Badań Zewnętrznych Amerykańskiego Narodowego Instytutu Zdrowia, Narodowy Instytut Nauk Medycznych Ogólnych (NIGMS; R35GM147123 dla M.C.P.) przekazany Baylor College of Medicine i przeniesiony do State University of New York w Buffalo. C.D.M. było wspierane przez stypendium szkoleniowe NIH (Grant nr T32 GM159557).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanol (b-Me)SigmaM3148-500ML14,3 M Solutions tock
AcquireMP 2024 R2Refeyn/Oprogramowanie do akwizycji danych
Adenozyna-5'-trifosforan trihydrat soli sodowej (ATP)Chem-Impex International00015-100Gdostosuj roztwór do pH 7,0
Żel powinowactwa Anti-Flag M2MilliporeA2220Żywica antyflagowa
Hydrat chlorowodorku benzzamidynySigmaB6506-25GInhibitor proteazy
Standardy białek o szerokim zakresie (10-250 kDa)Bio-RadP7719SStandardy białek z prestaincją
Hrabina 3InvitrogenA49862Automatyczny licznik komórek
DiscoverMP v2024 R2Refeyn/Oprogramowanie do analizy danych
Sól fizjologiczna Dulbecco z buforem fosforanowymCorning21-031-CV1x roztwor
Peptyd DYKDDDDKThermo Fisher ScientificA36805Peptyd 3xFlag
Ogniwa FreeStyle 293-FThermo Fisher ScientificR79007Komórki zawiesiny ssaków
Złożone w DMF Geniust M nucleaseSanta CruzSC-391121BNukleaza uniwersalna
HyClone CDM4HEK293 mediaCytivaSH3085802Medium wzrostu bez surowicy
Multimedia HyClone SFM4Transfx-293CytivaSH3086002Ośrodek transfekcyjny przejściowy
Immersol 518FZeiss4Y00-R0DY-1007-3BF3Olej immersyjny
Alkohol izopropylowyMacron Fine Chemicals3032-02
Bufor próbek LaemmliBio-Rad16107372x zapas roztworu
LeupeptinVWRJ580-25MGInhibitor proteazy
Chlorek magnezu heksahydrat (MgCl2)Fisher ScientificM33-500
MassFerence P1 RefeynMP-CON-41033Kolba kalibru 500x
Zestaw do przygotowania próbek MassGlass UCRefeynMP-CON-21022Suwak i uszczelka
Kolumna mikro-biospinowaBio-Rad7326204Pusta kolumna spinowa z polipropylenu
System Milli-Q IQ 7000MilliporeZIQ7000T0CUltraczysta woda typu I
Mini-Protean TGX żele wolne od plamBio-Rad45680864-15% STRONA SDS
Minitron z wilgotnością, chłodzeniem i CO2Infors72175Wstrząsanie inkubatorowe
Zestaw do wyrównania MPRefeynMP-CON-21019Narzędzie do ustawiania ustawiania, pęseta miękka, magnes
NanofotometrImplenNP80Spektrofotometr UV-vis
NutatorMarka Clay Adams421105
Pepstatin ASanta CruzSC-45036BInhibitor proteazy
Fenylosulfonylofluorek (PMSF)Research Products InternationalP20270-25.0Inhibitor proteazy
Poliwęglanowa kolba do wstrząsania  Duran Wheaton KimbleWPFBC1000SWentylowana flaszka bazowa z przegrodami
Polietyimina (PEI) MW 40 000Nauki polinaukowe24765Odczynnik transfekcyjny
Fluorometr Qubit 4Thermo Fisher ScientificQ33226
Zestaw do testowania wysokiej czułości na kubity RNAThermo Fisher ScientificQ32852ilościowa analiza za pomocą barwnika specyficznego dla RNA
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6065Coomassie G-250
DNA plazmidowe z ekspresją SLFN14OrygeneRC226257klon ORF oznaczony przez człowieka
Chlorek sodu (NaCl)Millipore1.37017
Tris, pH 7,4Thermo Fisher ScientificJ60202. K21 m buforowany roztwór
Tris (2-karboksyetylo) fosfinowodorek (TCEP)Złota BiotechnologiaTCEP10TCEP
Triton X-100VWRM143-1Ldetergent
Bejca trypanowego niebieskiegoThermo Fisher ScientificT102820,4% zapasów roztworu
Tween 20VWR0777-1Ldetergent
TwoMPRefeynMP-PRO-00001Fotometr masy
Kolumna Desaltin Zeba 40KThermo Fisher ScientificA57759Chromatografia wykluczenia rozmiaru

Bibliografia

  1. Pisareva, V. P., Muslimov, I. A., Tcherepanov, A., Pisarev, A. V. Characterization of novel ribosome-associated endoribonuclease slfn14 from rabbit reticulocytes. Biochemistry. 54 (21), 3286-3301 (2015).
  2. Li, M., et al. Human schlafen 14 cleavage of short double-stranded rnas underpins its antiviral activity. Adv Sci (Weinh). 12 (37), e01727(2025).
  3. Seong, R. K., et al. Schlafen 14 (slfn14) is a novel antiviral factor involved in the control of viral replication. Immunobiology. 222 (11), 979-988 (2017).
  4. Jo, U., Pommier, Y. Structural, molecular, and functional insights into schlafen proteins. Exp Mol Med. 54 (6), 730-738 (2022).
  5. Lee, S., et al. Velcrin-induced selective cleavage of trna(leu)(taa) by slfn12 causes cancer cell death. Nat Chem Biol. 19 (3), 301-310 (2023).
  6. Murai, J., Thomas, A., Miettinen, M., Pommier, Y. Schlafen 11 (slfn11), a restriction factor for replicative stress induced by DNA-targeting anti-cancer therapies. Pharmacol Ther. 201, 94-102 (2019).
  7. Zhang, P., et al. Schlafen 11 triggers innate immune responses through its ribonuclease activity upon detection of single-stranded DNA. Sci Immunol. 9 (96), eadj5465(2024).
  8. Li, M., et al. Codon-usage-based inhibition of hiv protein synthesis by human schlafen 11. Nature. 491 (7422), 125-128 (2012).
  9. Valenzuela, C., Saucedo, S., Llano, M. Schlafen14 impairs hiv-1 expression in a codon usage-dependent manner. Viruses. 16 (4), (2024).
  10. Metzner, F. J., et al. Mechanistic understanding of human slfn11. Nat Commun. 13 (1), 5464(2022).
  11. Garvie, C. W., et al. Structure of pde3a-slfn12 complex reveals requirements for activation of slfn12 rnase. Nat Commun. 12 (1), 4375(2021).
  12. Kugler, M., Metzner, F. J., Witte, G., Hopfner, K. P., Lammens, K. Phosphorylation-mediated conformational change regulates human slfn11. Nat Commun. 15 (1), 10500(2024).
  13. Van Riper, J., et al. Cryoem structure of the slfn14 endoribonuclease reveals insight into rna binding and cleavage. Nat Commun. 16 (1), 5848(2025).
  14. Luo, M., et al. Structural and functional characterization of human slfn14. Nucleic Acids Res. 53 (10), (2025).
  15. Schellenberg, M. J., Maheshwari, S., Pillon, M. C. Encyclopedia of cell biology. Vol. 1, Elsevier. 57-73 (2022).
  16. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system. J Vis Exp. (173), e62510(2021).
  17. Ojha, R., Timin, E., Szirovicza, L., Xu, W., Hepojoki, J. A systematic comparison of in-house prepared transfection reagents in the delivery of mrna or DNA to a wide range of cultured cells. J Biol Chem. 301 (12), 110742(2025).
  18. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension. J Vis Exp. (106), e53568(2015).
  19. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell counting and viability assessment of 2d and 3d cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay. Biol Proced Online. 19, 8(2017).
  20. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4 (11), 2411-2423 (1995).
  21. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. Biotechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  22. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the qubittm rna hs assay using rna spike-in. BMC Mol Biol. 16, 9(2015).
  23. Swiech, K., et al. Transient transfection of serum-free suspension hek 293 cell culture for efficient production of human rfviii. BMC Biotechnol. 11, 114(2011).
  24. Gu, J., et al. Correction: Advances in the structures, mechanisms and targeting of molecular chaperones. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 117(2025).
  25. Bernhard, H., et al. Structural basis of spliced leader rna recognition by the trypanosoma brucei cap-binding complex. Nat Commun. 16 (1), 685(2025).
  26. Lai, S. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211(2021).
  27. Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of igg molecules: Structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function. MAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
  28. Marenchino, M., Armbruster, D. W., Hennig, M. Rapid and efficient purification of rna-binding proteins: Application to hiv-1 rev. Protein Expr Purif. 63 (2), 112-119 (2009).
  29. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Sci Adv. 7 (46), eabk0734(2021).
  30. Carrasco-Zanini, J., et al. Mapping biological influences on the human plasma proteome beyond the genome. Nat Metab. 6 (10), 2010-2023 (2024).
  31. Adhikari, S., et al. A high-stringency blueprint of the human proteome. Nat Commun. 11 (1), 5301(2020).
  32. Liao, J. Y., et al. Rbpworld for exploring functions and disease associations of rna-binding proteins across species. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D220-D232 (2025).
  33. Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcarcel, J., Hentze, M. W. Rna-binding proteins in human genetic disease. Nat Rev Genet. 22 (3), 185-198 (2021).
  34. Poodts, J., et al. Improved expression of sars-cov-2 spike rbd using the insect cell-baculovirus system. Viruses. 14 (12), (2022).
  35. Mckenzie, E. A., Abbott, W. M. Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Methods. 147, 40-49 (2018).
  36. Shi, X., Jarvis, D. L. Protein n-glycosylation in the baculovirus-insect cell system. Curr Drug Targets. 8 (10), 1116-1125 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Produkcja białek rekombinowanychbiałka wiążące RNAzawiesina komórek HEK293chromatografia powinowactwachromatografia żelowastechiometria białekżel SDS-PAGEcharakterystyka biochemiczna
Szybka produkcja rekombinowanego rybonukleazy SLFN14 u człowieka oraz analiza stechiometryczna za pomocą fotometrii masowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.