Artykuł badawczy

Porównawcza ocena biofilmu in vitro Staphylococcus aureus na powierzchniach zmodyfikowanych glikolem z polilaktynowym kwasem mlekowym i polietylen-tereftalianem

DOI:

10.3791/70394

⸱

3 kwietnia 2026

 ,  ,  , 
1Laboratory of Emerging Infectious Diseases, School of Medicine, Pontifícia Universidade Católica do Paraná

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to ocenia powstawanie biofilmu na 3D drukowanym kwasie polimlekowym (PLA) oraz glikolu polietylen-tereftalianowym (PETG) przy użyciu modeli statycznych, półstatycznych oraz dynamicznych in vitro . Metodologia ta wspiera bezpieczniejszy rozwój urządzeń medycznych i rozwija badania nad biofilmem w biomateriałach drukowanych w 3D.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Druk trójwymiarowy (3D) przyspieszył rozwój indywidualnych urządzeń medycznych, jednak tworzenie biofilmu na materiałach drukowanych pozostaje poważnym zagrożeniem dla bezpieczeństwa i wydajności implantów. Ponieważ chemia materiałów i cechy powierzchni zależne od odcisków mogą wpływać na przyczepność bakterii i tolerancję na antybiotyki, potrzebne są ustandaryzowane podejścia in vitro umożliwiające znaczące porównania powszechnie stosowanych polimerów do druku 3D. Porównujemy tutaj rozwój biofilmu na kwas polimlekowy (PLA) i glikolu tereftalianu polietylenu (PETG) za pomocą wielomodelowego ramowego systemu oceny in vitro , który obejmuje komplementarne aspekty biologii biofilmu, w tym wczesną adhezję, dojrzewanie i tolerancję antybakteryjną, zarówno w warunkach statycznych, jak i przepływowych. Biofilmy S. aureus zostały opracowane i ocenione przy użyciu ilościowych (dopuszczalne obciążenie bakteriami i minimalnym stężeniem eradykacji biofilmu [MBEC]) oraz jakościowych (skaningowa mikroskopia elektronowa). Zarówno PLA, jak i PETG wspierały tworzenie biofilmu w różnych modelach; jednak PLA wykazywał wyższą wczesną adhezję i większą gęstość biofilmu. W testach statycznych PLA wykazało wyższe wartości CFU niż PETG, podczas gdy wartości vancomycyny MBEC były zbliżone między materiałami. Różnice zależne od testu w MBEC zaobserwowano na różnych platformach, co podkreśla, jak struktura modelu może wpływać na pozorną podatność na antybaktery. Pod wpływem przepływu dynamicznego obciążenie biofilmem wzrastało w stosunku do warunków statycznych, przy minimalnych różnicach zależnych od materiału. Łącznie wyniki te podkreślają podatność obu polimerów na tworzenie biofilmu i pokazują wartość wielomodelowego modelu do oceny zachowania biofilmu związanego z materiałem oraz benchmarkingu właściwości antydrobnoustrojowych na substratach istotnych dla urządzeń drukowanych 3D.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najnowsze osiągnięcia w druku 3D doprowadziły do rosnącego wykorzystania urządzeń medycznych drukowanych w 3D ze względu na ich opłacalność, wysoką precyzję, złożoną konstrukcję, efektywne wykorzystanie materiałów oraz projektowanie dostosowane do pacjenta 1,2. Te postępy napędzają znaczący postęp kliniczny w rozwoju spersonalizowanych implantów ortopedycznych 3,4,5,6, czaszkowo-twarzowych 7,8, zębów 1,9 oraz kręgosłupa10,11.

Liczne techniki i materiały pozwalają obecnie na precyzyjną kontrolę parametrów projektowych, co umożliwia optymalizację charakterystyki powierzchni i poprawę ogólnej funkcjonalności urządzenia 2,12,13. Powierzchnia implantu jest niezwykle ważna, ponieważ stanowi główny interfejs z otoczeniem gospodarza i wpływa na odpowiedzi immunologiczne, przyczepność bakteryjną oraz integrację tkanek — czynniki niezbędne dla długoterminowej wydajności urządzenia14,15. Jednak to samo interfejs stanowi również poważne wyzwanie, ponieważ infekcje związane z implantowalnymi urządzeniami medycznymi mogą prowadzić do poważnych powikłań i często są trudne do leczenia ze względu na zdolność patogenów do tworzenia biofilmów przymocowanych do powierzchni 16,17,18,19.

W tym kontekście testy in vitro modeli biofilmu na materiałach przeznaczonych do produkcji wszczepialnych urządzeń medycznych stanowią fundamentalny etap w ocenie ryzyka i procesie rozwoju produktu20. Testy te umożliwiają badanie podatności materiału na adhezję mikroorganizmów, tworzenie i dojrzewanie biofilmów, a także ocenę skuteczności strategii przeciwdrobnoustrojowych lub modyfikacji powierzchni mających na celu zapobieganie rozwojowi mikroorganizmów.

Kolejnym ograniczeniem wielu testów biofilmu in vitro jest to, że często przeprowadza się je na pojedynczym, standaryzowanym podłożu (często jednym polimerze lub uniwersalnym materiale laboratoryjnym), zakładając domyślnie, że wyniki są przenosalne na wszystkie materiały urządzenia21. Jest to problematyczne dla urządzeń medycznych drukowanych w 3D, gdzie chemia polimerów i cechy powierzchni zależne od produkcji mogą się znacznie różnić i bezpośrednio wpływać na przyczepność bakterii, dojrzewanie biofilmu oraz tolerancję antybakteryjną22. W konsekwencji ocena zachowania biofilmu na rzeczywistych polimerach używanych w produkcji, zamiast ekstrapolacji z jednego referencyjnego substratu, rozwiązuje ważną lukę w obecnej praktyce testowania.

Ponieważ powierzchnia implantu jest kluczowym interfejsem z gospodarzem, silnie wpływa na adhezję bakteryjną i tworzenie biofilmu, które są podstawą wielu infekcji i niepowodzeń leczenia związanych z urządzeniami. Założyliśmy hipotezę, że powszechnie stosowane polimery drukowane w 3D różnią się zdolnością do wspierania rozwoju biofilmu S. aureus oraz podatnością na usuwanie biofilmu za pomocą vankomycyny. W związku z tym przeprowadziliśmy jakościową i ilościową ocenę powstawania biofilmu na modelach materiałów drukowanych w 3D. W niniejszym badaniu przeprowadzono jakościową i ilościową ocenę powstawania biofilmu na modelach materiałów drukowanych w 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie niebezpieczne substancje (np. glutaraldehyd, bufor sodu kakodylatany, heksametylodylazana [HMDS] oraz etanol) były traktowane zgodnie z instytucjonalnymi politykami Ochrony Środowiska i Bezpieczeństwa (EHS). Przygotowanie i stosowanie lotnych/toksycznych odczynników odbywało się w certyfikowanym okapie chemicznym z odpowiednim sprzętem ochronnym (fartuch laboratoryjny, ochrona oczu i rękawice chemiczne), a łatwopalne rozpuszczalniki trzymano z dala od źródeł zapłonu. Odpady chemiczne były segregowane i zbierane w odpowiednio oznakowanych pojemnikach (w tym dedykowane odpady zawierające arsen dla kakodylatów oraz rozpuszczalniki dla HMDS/etanolu) w celu utylizacji w ramach instytucjonalnego programu odpadów niebezpiecznych. Materiały biologicznie niebezpieczne (kultury bakteryjne, zanieczyszczone płytki i jednorazowe materiały) były dekontaminowane zgodnie z procedurami biobezpieczeństwa (np. autoklawowanie lub zatwierdzone środki dezynfekcyjne) przed utylizacją, a wszelka sterylizacja tlenkiem etylenu przeprowadzana zgodnie z protokołami i wymaganymi praktykami napowietrzania.

Modele drukowane w 3D
Modele zaprojektowano przy użyciu darmowego oprogramowania wspomaganego komputerowo i wydrukowano na drukarce 3D wyposażonej w technologię modelowania osadzania fuzyjnego, z włóknami o średnicy 1,75 mm (PLA) i glikolu z polietylen-tereftalianu (PETG) (Tabela materiałów). Parametry druku użyte do wytwarzania próbek były następujące: prędkość ruchu dyszy (0,4 mm) 1800 mm/min; prędkość pierwszej warstwy 300 mm/min; temperatura dyszy przy wytłaczaniu 220 °C (PLA) i 255 °C (PETG); temperatura warstwy 60 °C; wysokość warstwy 0,08 mm; szerokość wytłaczania 0,48 mm i; gęstość wypełnienia 100% dla wszystkich próbek. Żadna z próbek nie wymagała stosowania konstrukcji nośnych. Modele 3D składały się z dysków, płyt płaskich, urządzenia biofilmowego Calgary (CBD) oraz zmodyfikowanego urządzenia Robbinsa (MRD). Dyski zaprojektowano jako cylinder o średnicy 6 mm x 6 mm wysokości.

Dla CBD stworzono model (Tabela materiałów). CBD składało się z dwóch części: płyty bazowej, standardowej mikromiareczki z 96 dołkami (format ANSI/SLAS) oraz pokrywy (płytka kołkowa): pokrywki polimerowej (PLA lub PETG) z 96 cylindrycznymi kołkami o średnicach 2 mm i wysokości 5 mm. MRD został opracowany z pinami o średnicy i wysokości 4 mm zamocowanymi w modelu gwintowanym (Tabela materiałów). Po zakończeniu procesu druku modele były ostrożnie usuwane z płyty roboczej, wizualnie sprawdzane pod kątem odkształceń, a następnie sterylizowane tlenkiem etylenu.

Model dysku statycznego biofilmu
Metoda ta została użyta do indukowania powstawania biofilmu na PLA przy użyciu wcześniej opisanych cylindrycznych dysków 6 mm × 6 mm23 (Rysunek 1).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Dyski PLA i PETG oraz płytka z 24 dołkami do tworzenia biofilmu na modelach tych dysków. (A) Reprezentatywne dyski PLA i PETG drukowane w 3D przed szczepieniem bakteryjnym i tworzeniem biofilmu. (B) Dyski PLA i PETG umieszczone w 24-dołkowej płycie podczas indukcji biofilmu w warunkach hodowli in vitro . Skróty; PLA = kwas polimlekowy; PETG = glikol z polietylentereftalianu zmodyfikowany. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

S. aureus przechowywano w temperaturze −80 °C w tryptycznym bulionie sojowym (TSB) z dodatkiem 15% glicerolu, a przed każdym eksperymentem hodowano na agarze krwi i inkubowano przez 24 godziny w 37 °C. Izolowana kolonia została ponownie zawieszona w 10 mL TSB uzupełnionym 50 mM glukozą, dodana do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i inkubowana przez 24 godziny w 37 °C w orbitalnym shakerze przy 120 obr./min. Powstała hodowla była wirowana przez 5 minut przy 200 x g, a supernatant odrzucano. Pellet był myty trzykrotnie 10 mL sterylnego NaCl o stężeniu 0,9%. W ostatnim etapie płukania pellet został ponownie zawieszony w 10 mL świeżego TSB, aby uzyskać bakteryjną zawiesinę o mętności równoważnej standardowi McFarlanda 0,5 (około 1,5 ×10 8 CFU/mL), określonym przez nefelometrię. Następnie zawieszenie zostało rozcieńczone w stosunku 1:10 na 10 mL TSB w stożkowej probówce o pojemności 15 mL, aby uzyskać końcowe stężenie bakteryjne 107 CFU/mL. W eksperymentach z dyskami do każdej jamki sterylnych płytek 24-dołkowych dodano 2 mL poprzedniej zawiesiny bakteryjnej, aby pokryć każdą grupę dysków (PLA i PETG) na 2 godziny i umożliwić przyczepność komórek. Dyski były następnie aseptycznie przenoszone za pomocą sterylnych pęset na nową sterylną płytkę 24-dołkową zawierającą 2 mL 0,9% NaCl, aby usunąć komórki planktonowe. Do dołków dodano świeże 10 mL TSB, a płytki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Podczas tego etapu komórki przylegające do powierzchni dysków tworzyły biofilm. Po inkubacji podłoże hodowlane było zasysane, a dyski myto 2 mL 0,9% NaCl, aby usunąć pozostałe medium i komórki nieprzylegające. Przygotowano płytkę 24-dołkową z 1 mL roztworu wankomycyny przy rozcieńczeniach seryjnym (2–4 096 mg/L), a dyski zanurzano przez 24 godziny. Włączono grupę kontrolną bez wankomycyny (NaCl 0,9%). Po 24 godzinach dyski były myte 2 mL NaCl 0,9%.

Aby ilościowo określić obecność przyklejonych bakterii na dyskach, każdy dysk był przenoszony za pomocą sterylnej pęsety do mikrorurki zawierającej 1 mL sterylnego NaCl o stężeniu 0,9% i sonifikowany w kąpieli ultradźwiękowej przez 15 minut w temperaturze 40 kHz i 37 °C, aby odłączyć przyklejone komórki. Mikrorurki były wirowane przez 60 sekund, aby zapewnić całkowite rozbicie skupisk komórek. Alikwoty 100 μL nierozcieńczonej próbki (10°) oraz rozcieńczeń 10⁻2 i 10⁻4 w sterylnym 0,9% NaCl zostały posypane na TSA i inkubowane przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Wzrost bakterii ilościowo określono przez zliczenie CFU na płytce i wyrażono jako CFU/mL.

24-dołkowe płytki płaskie dla minimalnego stężenia erozykacji biofilmu
W eksperymentach na płytkach 24-dołkowych do każdej studni dodano 3 mL zawiesiny bakteryjnej (przygotowanej jak opisano powyżej) na 2 godziny, aby zapewnić odpowiednią przyczepność komórek. Następnie zasysto bakteryjną zawiesinę, a następnie dodano 3 mL sterylnego NaCl 0,9% w celu usunięcia komórek planktonowych. Następnie dodano świeże 3 mL TSB, a płytki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. W tym etapie komórki przylegające do powierzchni studni tworzyły biofilm. Po inkubacji TSB został aspirowany, a doły były myte 3 mL 0,9% NaCl, aby usunąć pozostałe medium i komórki nieprzylegające. Do każdego dołku dodano 3 mL roztworu wankomycyny przy seryjnych rozcieńczeniach (2–4 096 mg/L). Włączono grupę kontrolną bez wankomycyny (NaCl 0,9%).

Po 24 godzinach roztwór został usunięty, a każdą studnię delikatnie dwukrotnie myto 3 mL 0,9% NaCl. Do każdej studni dodano trzy mililitry 0,9% NaCl, płytę zakręcono i uszczelniono parafilmem, a następnie sonifikowano w kąpieli ultradźwiękowej przez 15 minut przy 40 kHz i 37 °C, aby odłączyć przyklejony biofilm. Z odwiertów pobrano alikwoty o pojemności 100 μL, a nierozcieńczone próbki (10°) oraz rozcieńczenia 10⁻2 i 10⁻4 przygotowane w sterylnym 0,9% NaCl zostały pokryte na TSA i inkubowane przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Wzrost bakterii następnie zmierzono przez liczenie CFU/mL. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach. Minimalne stężenie eradykacji biofilmu (MBEC) zostało zdefiniowane jako redukcja co najmniej 3 log10 w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 2).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Drukowane płytki z 24 dołkami. (A) Płytki z 24 dołkami drukowane z PLA. (B) Płytki z 24 dołkami drukowane z PETG. Skróty; PLA = kwas polimlekowy; PETG = glikol z polietylentereftalanianu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Urządzenie biofilmowe z Calgary
CBD składa się z mikromiatnicy z 96 dołkami oraz pokrywki z 96 kołkami, z których każdy jest zaprojektowany tak, aby precyzyjnie pasować do dołka po umieszczeniu pokrywki na płytce. Aby wywołać tworzenie biofilmu, każdy dołek sterylnej płytki z 96 dołkami wypełniano 200 μL zawiesiny bakteryjnej, a następnie na płytę umieszczano sterylne pokrywki kołków. Złożone płytki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w warunkach statycznych, aby umożliwić wywoływanie biofilmu na kołkach. Po inkubacji pokrywki były delikatnie płukane na 96-dołkowej płycie zawierającej 200 μL 0,9% NaCl, aby usunąć komórki planktonowe. Płytka z kołkami została zanurzona w innej 96-dołowej płytce zawierającej wankomycynę w progresywnych stężeniach (2–4 096 mg/L) i inkubowana w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w warunkach statycznych.

Płytkę z kołkami płukano w 96-dołkowej płycie zawierającej 200 μL 0,9% NaCl, a kołki starannie wytłoczono na 15 cm płycie TSA i inkubowano w 37 °C przez 24 godziny. Zaobserwowano wzrost bakterii, a MBEC zdefiniowano jako najniższe stężenie, przy którym nie występuje wzrost. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach (Rysunek 3).

figure-protocol-3
Rysunek 3: Urządzenie Calgary i płytki płaskie z 96 dołkami drukowane PLA i PETG. (A) Urządzenie Calgary drukowane PLA. (B) Płytki płaskie z 96 dołkami drukowane PLA. (C) Urządzenie Calgary drukowane PETG. (D) Płytki płaskie z 96 dołkami drukowane PETG. Skróty; PLA = kwas polimlekowy; PETG = glikol tereftalianu polietylenu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Układ dynamiczny działający w ciągłych warunkach przepływu
Każdy MRD zawiera pięć indywidualnych kołków zamocowanych w modelu gwintu śrubowego i ułożonych liniowo wzdłuż kanału o prostokątnym przekroju. System dynamiczny składał się z kolby zawierającej 1 L roztworu, z antybiotykiem do testu podłączonym do pompy perystaltycznej za pomocą silikonowej rurki sprzężonej z MRD. Montaż odbywał się w laminarnej szafie przepływu powietrza, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Średni przepływ utrzymywano na poziomie 1 mL/min i był cyrkulowany przez system przez 24 godziny. Płyn przechodzący przez MRD jest wyrzucany do innej szklanej kolby (bez recyrkulacji).

Biofilmy S. aureus były indukowane na kołkach MRD, które upuszczano na płytki z 24 dołkami z TSB o stężeniu 107 CFU/mL. Kołki były delikatnie płukane przez zanurzenie w 24-dołkowej płycie wypełnionej 3 mL roztworu 0,9% NaCl. Kołki były starannie wkręcane do MRD (n = 5). Roztwór wankomycyny (40 mg/L) rozcieńczony w 0,9% NaCl był infuzowany przez MDR za pomocą pompy, jak opisano powyżej, przez 24 godziny. Włączono grupę kontrolną bez antybiotyków (0,9% NaCl). Stężenie to wybrano na podstawie stężenia surowicy uzyskanego podczas wysokich dawek dożylnej wankomycyny, jak opisano wcześniej24. Sworznie zostały aseptycznie wyjęte z MRD za pomocą sterylnych pęset, umieszczone w mikrorurkach zawierających 1 mL sterylnego NaCl 0,9% po umyciu 0,9% NaCl i sonifikowane w kąpieli ultradźwiękowej przez 15 minut w temperaturze 40 kHz i 37 °C, aby zapewnić całkowite odłączenie biofilmu. Mikrorurki były wirowane przez 60 sekund, a procedurę powtarzano trzy razy, aby rozbić pozostałości biofilmu. Aliquoty o pojemności 100 μL były nakładane na TSA, a płytki inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Wzrost bakterii został zmierzony i wyrażony jako CFU/mL (Rysunek 4).

figure-protocol-4
Rysunek 4: Zmodyfikowane urządzenie Robbinsa z PETG i PLA oraz zdjęcie systemu dynamicznego. (A) zmodyfikowane urządzenie Robbinsa drukowane za pomocą PETG lub PLA. (B) Zdjęcie systemu dynamicznego. Skróty; PLA = kwas polimlekowy; PETG = glikol polietylentereftalanowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Skaningowa mikroskopia elektronowa
Aby zobrazować morfologię i strukturę biofilmów, wykonano na dyskach skaningową mikroskopię elektronową (SEM). Biofilm został indukowany na dyskach, zgodnie z protokołami. Dyski zostały ostrożnie usunięte z płyty za pomocą sterylnych pęset i utrwalone roztworem (0,68 g sacharozy, 0,42 g kakodylatu sodu, 0,6 mL 30% glutaraldehydu) z 19,4 mL wody dejonizowanej, przez 45 minut. Następnie próbki zostały przelane do roztworu buforowego (0,68 g sacharozy i 0,42 g kakodylatu sodu) na 10 minut. Następnie próbki były odwodnione w serii stopniowego etanolu (35%, 50%, 70% i 100%) przez 10 minut każda. Następnie próbki zostały przeniesione do kolejnej szalki Petriego i pokryte 100% heksametyldisilazanem na 10 minut. Na koniec dyski zostały powlekione złotem za pomocą pompy obrotowej i zamontowane na metalowym odcinku do obserwacji pod różnymi powiększeniami na skaningowym mikroskopie elektronowym (Rysunek 5).

figure-protocol-5
Rysunek 5: Skaningowa mikroskopia elektronowa modeli drukowanych 3D PLA i PETG z indukcją biofilmu i bez. (A) Zdjęcie elektronowe PLA bez biofilmu mikroskopii skaningowej. (B) Zdjęcie elektronowe PETG bez biofilmu. (C) Zdjęcie elektronowe bakterii tworzących biofilm na dyskach PLA mikroskopią skaningową. (D) Zdjęcie elektronowe bakterii tworzących biofilm na dyskach PETG z mikroskopią skaningową. C i D pokazują typowe cechy biofilmów: organizację bakterii w strukturę 3D, przyleganie do powierzchni oraz obecność macierzy zewnątrzkomórkowej. Biały pasek skali oznacza 10 μm. Skróty; PLA = kwas polimlekowy; PETG = glikol polietylen-tereftalan. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza statystyczna
Niektóre analizy były opisowe. W przypadku danych ilościowych wielkość próby uzasadniała zastosowanie mediany z zakresem interkwartylowym, a do porównania statystycznego zastosowano test Manna-Whitneya. Wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model dysku statycznego biofilmu
Badanie to służy do określania MBEC na pojedynczych próbkach. Progresywne, podwójne rozcieńczenia wankomycyny wykazały bazową formację biofilmu na poziomie 7,48 ×10,5 CFU/mL [IQR 6,34–8,72] dla PLA oraz 3,60 × 10,5 CFU/mL [IQR 3,08–5,52] dla PETG. Chociaż oba materiały wykazywały gęstość biofilmu w zakresie 105, zaobserwowano statystycznie istotną różnicę w produkcji biofilmu między nimi (p = 0,015). Po ekspozycji na wankomycynę MBEC wynosił 512...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie proponuje kompleksową ocenę in vitro powstawania biofilmu na polimerach medycznych klasy 3D, w szczególności PLA i PETG, z użyciem czterech uzupełniających się platform eksperymentalnych: statycznych testów dyskowych, modeli płyt 24-dołkowych, CBD oraz systemu dynamicznego przepływu opartego na MRD. Poprzez integrację tych modeli, celem badania mają na celu scharakteryzowanie, jak różne materiały drukarskie zachowują się pod wpływem indukcji biofilmu S. aureus oraz określenie MBEC wank...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktów interesów. ChatGPT był używany do przeglądu gramatyki.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Renee Fleeman za zaproszenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% NaClFresenius Kabi Brasil, Ceara, Brazylia17811
drukarka 3D z technologią modelowania fuzowanego osadzania (Bambu X1-Carbon)  Laboratorium Bambu, Shenzhen, ChinyPF001-P
Agar krwistyNewProv, Paraná, BrazyliaPA31
Urządzenie Calgary do pobrania biofilmuBrak towarzystwaZobacz link (bez numerów katalogowych)https://www.printables.com/model/1464751-calgary-model-biofilm
Wielodołkowa płytka hodowli komórkowej, 24 dołkiGreiner Bio-One, Kremsmü nster & Ouml; sterreich, Austria 662160
Wirówka (5910 Ri)Eppendorf, Hamburg, Niemcy5943000511
Rurka wirówki sterylna 15 mLCorning, Missouri, USA430790
Rurka wirówki sterylna 50 mLCorning, Missouri, USA430291
Elektroniczny kontroler pipety (Easypet® 3)Eppendorf, Hamburg, Niemcy4430000018
Etanol (≥ 99,5%, odczynnik ACS)Sigma-Aldrich, Missouri, USA459844
GlutaraldehydMerck, Darmstadt, Niemcy8143931000
HeksametyldisilazanaMerck, Darmstadt, Niemcy440191
Inkubator (502/4-C)Fanem, SÃ o Paulo, Brazylia502007700
Szafa z laminarnym przepływem powietrza (BioSEG 9)Veco, Sã o Paulo, Brazylia1EAC3770
Pipeta mechaniczna (Eppendorf Reference® 2)Eppendorf, Hamburg, Niemcy4924000061
Zmodyfikowane urządzenie Robbinsa do pobraniaBrak towarzystwaZobacz link (bez numerów katalogowych)https://www.printables.com/model/1481700-robbins-device-modified
Nephelometer Alfakit, Florianó polis, Brazylia7718
Orbitalny potrząsacz (INNOVA 44R)Eppendorf, Hamburg, NiemcyM1282-0314
Parafilm MAmcor, Illinois, USAPM-996
Pompa perystaltyczna (Minipuls® 3)Gilson, Villiers-le-Bel, FrancjaF117604
Szalka Petriego (90 x 15 mm)Greiner Bio-One, Sã o Paulo, Brazylia630164
Końcówka pipety 1– 200μ LCorning, Missouri, USACLS4142
Glikol z polietylen-tereftalianu (PETG)Creality, Chiny44759
Ultrafuse i rejestracja kwasu polimlekowego (PLA); PLA PRO1BASF, Maarssen, HolandiaPR1-7501A075
Pompa obrotowa (Q150R ES Plus)Quorum Technologies, Lewes, Wielka Brytania13034
Skaningowy mikroskop elektronowy (Vega3 LMU)Tescan, Brno, CzechyZobacz link (bez numerów katalogowych)https://tescan.com/product-portfolio
Pipeta serologiczna 10 mLCorning, Missouri, USACLS4488
Kakodylan soduSigma-Aldrich, Missouri, USAC0250
Gronkowec aureus ATCC® Szczep 25923Laborclin, Pinhais, Brazylia660674
SacharozaSigma-Aldrich, Missouri, USA59378
Plik do pobrania z płaskim dnem z 24 dołkamiBrak towarzystwaZobacz link (bez numerów katalogowych)www.printables.com/model/104339-24-well-plates 
Tryptyczny agar sojowy  Kasvi, Madryt, HiszpaniaK25-1068
Tryptyczny bulion sojowy  Sigma-Aldrich, Missouri, USA22092
Ultra Low Freezer (IULT 335 D)Indrel, Paran á, Brazylia12038
Kąpiel ultradźwiękowa (Soniclean 15)Sanders Medical, Minas Gerais, BrazyliaZobacz link (bez numerów katalogowych)https://sandersdobrasil.com.br/produto/lavadora-ultrassonica-soniclean-15d/
WankomycynaABL, SÃ o Paulo, Brazylia15,56,20,041
Wir (FLEXVORTEX)Loccus, SÃ o Paulo, Brazylia4500

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kouhi, M., et al. Recent advances in additive manufacturing of patient-specific devices for dental and maxillofacial rehabilitation. Dent Mater. 40 (4), 700-715 (2024).
  2. Mamo, H. B., Adamiak, M., Kunwar, A. 3D printed biomedical devices and their applications: A review on state-of-the-art technologies, existing challenges, and future perspectives. J Mech Behav Biomed Mater. 143, 105930(2023).
  3. Przadka, M., et al. Advances in 3D printing applications for personalized orthopedic surgery: From anatomical modeling to patient-specific implants. J Clin Med. 14 (11), (2025).
  4. Ling, K., Wang, W., Liu, J. Current developments in 3D printing technology for orthopedic trauma: A review. Medicine (Baltimore). 104 (12), e41946(2025).
  5. Long, T., Tan, L., Liu, X. Three-dimensional printing in modern orthopedic trauma surgery: A comprehensive analysis of technical evolution and clinical translation. Front Med (Lausanne). 12, 1560909(2025).
  6. Cong, B., Zhang, H. Innovative 3D printing technologies and advanced materials revolutionizing orthopedic surgery: Current applications and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 13, 1542179(2025).
  7. Slavin, B. V., et al. 3D printing applications for craniomaxillofacial reconstruction: A sweeping review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (12), 6586-6609 (2023).
  8. Moncayo-Matute, F. P., et al. 3D printing and virtual surgical planning in craniofacial and thoracic surgery: Applications to personalised medicine. J Pers Med. 15 (9), (2025).
  9. Dimitrova, M., et al. Recent advances in 3D printing of polymers for application in prosthodontics. Polymers (Basel). 15 (23), (2023).
  10. Iqbal, J., et al. Recent advances of 3D-printing in spine surgery. Surg Neurol Int. 15, 297(2024).
  11. Hajnal, B., et al. Clinical applications of 3D printing in spine surgery: A systematic review. Eur Spine J. 34 (2), 454-471 (2025).
  12. Paul, G. M., et al. Medical applications for 3D printing: Recent developments. Mo Med. 115 (1), 75-81 (2018).
  13. Liaw, C. Y., Guvendiren, M. Current and emerging applications of 3D printing in medicine. Biofabrication. 9 (2), 024102(2017).
  14. Mendonça, C. J. aD., Dantas, L. R., Soni, J. F., Tuon, F. F. Antimicrobial action of a biodegradable thermoplastic impregnated with vancomycin for use in 3D printing technology. Braz Arch Biol Tech. 67, 13(2024).
  15. Dantas, L. R., Witt, M. A., Carneiro, E., Tuon, F. F. Nanoarchitectonics for advancing bone graft technology: Integration of silver nanoparticles against bacteria and fungi. Microorganisms. 12 (12), 2616(2024).
  16. Stewart, P. S., Bjarnsholt, T. Risk factors for chronic biofilm-related infection associated with implanted medical devices. Clin Microbiol Infect. 26 (8), 1034-1038 (2020).
  17. Amod, A., Anand, A. A., Sahoo, A. K., Samanta, S. K. Diagnostic and therapeutic strategies in combating implanted medical device-associated bacterial biofilm infections. Folia Microbiol (Praha). 70 (2), 321-342 (2025).
  18. Oliva, A., et al. Challenges in the microbiological diagnosis of implant-associated infections: A summary of the current knowledge. Front Microbiol. 12, 750460(2021).
  19. Veerachamy, S., Yarlagadda, T., Manivasagam, G., Yarlagadda, P. K. Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: A review. Proc Inst Mech Eng H. 228 (10), 1083-1099 (2014).
  20. Ortis, G. B., et al. Additive manufacturing, thermoplastics, CAD technology, and reverse engineering in orthopedics and neurosurgery applications to preventions and treatment of infections. Antibiotics (Basel). 14 (6), 561(2025).
  21. Coenye, T., Nelis, H. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. J Microbiol Methods. 83 (2), 89-105 (2010).
  22. Riga, E. K., Vohringer, M., Widyaya, V. T., Lienkamp, K. Polymer-based surfaces designed to reduce biofilm formation: From antimicrobial polymers to strategies for long-term applications. Macromol Rapid Commun. 38 (20), 1700216(2017).
  23. Soni, J. F., et al. Evaluation of silver nanoparticle-impregnated PMMA loaded with vancomycin or gentamicin against bacterial biofilm formation. Injury. 54 (6), 110649(2023).
  24. Borges, N. H., Suss, P. H., Ortis, G. B., Dantas, L. R., Tuon, F. F. Synergistic activity of vancomycin and gentamicin against Staphylococcus aureus biofilms on polyurethane surface. Microorganisms. 13 (5), 1119(2025).
  25. Pedroni, M. A., et al. Different concentrations of vancomycin with gentamicin-loaded PMMA to inhibit biofilm formation of Staphylococcus aureus and their implications. J Orthop Sci. 29 (1), 334-340 (2024).
  26. Tuon, F. F., et al. Antimicrobial treatment of Staphylococcus aureus biofilms. Antibiotics (Basel). 12 (1), 87(2023).
  27. Tuon, F. F., Dantas, L. R., Suss, P. H., Tasca Ribeiro, V. S. Pathogenesis of the Pseudomonas aeruginosa biofilm: A review. Pathogens. 11 (3), 300(2022).
  28. Carstensen, S., et al. Transcriptional evaluation of functional genes of resistance, biofilm, and quorum sensing in ctx-m15 ESBL-producing Klebsiella pneumoniae after meropenem concentration based on serum level. Res Microbiol. , (2025).
  29. Kraft, L., Ribeiro, V. S. T., Goncalves, G. A., Suss, P. H., Tuon, F. F. Comparison of amphotericin B lipid complex, deoxycholate amphotericin B, fluconazole, and anidulafungin activity against Candida albicans biofilm isolated from breakthrough candidemia. Enferm Infecc Microbiol Clin (Engl Ed). 41 (10), 596-603 (2023).
  30. Chaiben, V., et al. A carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii outbreak associated with a polymyxin shortage during the COVID pandemic: An in vitro and biofilm analysis of synergy between meropenem, gentamicin, and sulbactam. J Antimicrob Chemother. 77 (6), 1676-1684 (2022).
  31. Da Rocha, L., et al. Evaluation of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilm adherence to PEEK and titanium-alloy prosthetic spine devices. Eur J Orthop Surg Traumatol. 32 (5), 981-989 (2022).
  32. Mendonca, J. R., Dantas, L. R., Tuon, F. F. Activity of multipurpose contact lens solutions against Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, and Candida albicans biofilms. Ophthalmic Physiol Opt. 43 (5), 1092-1099 (2023).
  33. Koch, J. A., et al. Staphylococcus epidermidis biofilms have a high tolerance to antibiotics in periprosthetic joint infection. Life (Basel). 10 (11), 314(2020).
  34. Dunne, W. M. Jr Bacterial adhesion: Seen any good biofilms lately. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 155-166 (2002).
  35. Beckman, R. L. T., Cella, E., Azarian, T., Rendueles, O., Fleeman, R. M. Diverse polysaccharide production and biofilm formation abilities of clinical Klebsiella pneumoniae. NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 151(2024).
  36. Dantas, L. R., Ortis, G. B., Suss, P. H., Tuon, F. F. Advances in regenerative and reconstructive medicine in the prevention and treatment of bone infections. Biology (Basel). 13 (8), 582(2024).
  37. Molina-Manso, D., et al. In vitro susceptibility to antibiotics of staphylococci in biofilms isolated from orthopaedic infections. Int J Antimicrob Agents. 41 (6), 521-523 (2013).
  38. Cieslinski, J., et al. Direct detection of microorganisms in sonicated orthopedic devices after in vitro biofilm production and different processing conditions. Eur J Orthop Surg Traumatol. 31 (6), 1113-1120 (2021).
  39. Fernandez-Grajera, M., Pacha-Olivenza, M. A., Fernandez-Calderon, M. C., Gonzalez-Martin, M. L., Gallardo-Moreno, A. M. Dynamic adhesive behavior and biofilm formation of Staphylococcus aureus on polylactic acid surfaces in diabetic environments. Materials (Basel). 17 (13), 3184(2024).
  40. Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. New technologies for studying biofilms. Microbiol Spectr. 3 (4), (2015).
  41. Sikdar, R., Elias, M. H. Evidence for complex interplay between quorum sensing and antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa. Microbiol Spectr. 10 (6), e0126922(2022).
  42. Kruger, H. C., et al. Antimicrobial action, cytotoxicity, calcium ion release, and pH variation of a calcium hydroxide-based paste associated with Myracrodruon urundeuva Allemao extract. Aust Endod J. 48 (1), 170-178 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Polimery do druku 3Dtworzenie biofilmuocena in vitrotolerancja na rodki przeciwdrobnoustrojoweskaningowa mikroskopia elektronowatesty statyczneprzep yw dynamiczny

Powiązane artykuły