Artykuł metodologiczny

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

DOI:

10.3791/70396

⸱

13 lutego 2026

 , 
1Division of Liver Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibroblasty obecne w tkankach są komórkowymi czynnikami napędzającymi włóknienie tkanek. W wątrobie komórki wątrobowe gwiaździste (HSC), czyli rezydentne pericyty o unikalnej "gwiaździstej" morfologii, aktywują się w fibrogenne miofibroblasty podczas urazu, tworząc bliznę wątrobową. Chociaż dekady badań wyjaśniły główne szlaki sygnalizacyjne leżące u podstaw aktywacji HSC, funkcjonalne znaczenie ich charakterystycznej morfologii dendrytycznej pozostaje nieuchwytne ze względu na techniczne ograniczenia w obrazowaniu i analizie. Protokół ten oferuje kompleksowy proces obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii HSC w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne HSC z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość w próbkach tkankowych o grubości kilku centymetrów. Usunięte próbki są obrazowane za pomocą zoptymalizowanych platform mikroskopii konfokalnej, a zbiory danych obrazów przetwarzane są w niestandardowym procesie analizy do trójwymiarowej rekonstrukcji pojedynczych HSC w rozdzielczości pojedynczej komórki. Razem ten pipeline umożliwia powtarzalne mapowanie morfologii HSC w złożonym mikrośrodowisku wątroby, w tym ich procesów dendrytycznych i relacji przestrzennych z sąsiednimi komórkami. Poza wątrobą, przepływ pracy jest adaptowalny do fibroblastów w innych narządach, takich jak płuco, nerki, jelita i serce, gdzie rezydujące komórki mezenchymalne wykazują podobne funkcje fibrogenne w chorobach. Proponowane ramy ustanawiają zatem podstawę metodologiczną do porównawczych badań międzynarządowych w celu zbadania relacji struktura i funkcja fibroblastów oraz podatności terapeutyczne w chorobach włóknistych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Włóknienie, czyli patologiczne bliznowactwo tkanek, jest ostatnią wspólną ścieżką niemal wszystkich przewlekłych chorób narządów i przyczynia się do około 40% zgonów w krajach uprzemysłowionych.1. W wątrobie włóknienie powstaje w wyniku przewlekłych zaburzeń wątroby, takich jak wirusowe zapalenie wątroby, używanie alkoholu lub coraz częściej zaburzenia metaboliczne związane ze steatotyczną chorobą wątroby (MASLD), która obecnie dotyka 30-40% dorosłych w USA. Przewlekłe uszkodzenia wątroby i wynikające z nich postępujące włóknienie znacznie zwiększają ryzyko końcowych chorób wątroby, takich jak marskość wątroby, niewydolność wątroby i rak wątrobowokomórkowy2, 3,4,5.

Komórki wątrobowe gwiaździste (HSC) są kluczowe dla homeostazy wątroby i fibrogenezy. W zdrowych wątrobach HSC występują w stanie spokojnym, magazynującym witaminę A i przyczyniają się do homeostazy hepatocytów, a ogólnie całej wątroby 6,7. Jest to wyraźnie potwierdzone badaniami wyczerpania HSC, gdzie usunięcie niemal wszystkich HSC w zdrowej wątrze zmniejsza masę wątroby i poważnie ogranicza regenerację wątroby 7,8. Po urazie HSC aktywują się w komórkach podobnych do miofibroblastów, które się mnożą, migrują do uszkodzonych miejsc i produkują nadmiar macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), tworząc włókniste blizny. Aktywowane HSC w wątrobach włóknistych są również źródłem fibroblastów związanych z nowotworem i odgrywają rolę promującą nowotwory w raku wątrobowokomórkowym 9,10,11,12. Spoczynkowe HSC posiadają unikalną, neuronowatą morfologię z małymi ciałami komórkowymi, z których wyrastają projekcje na daleki zasięg. HSC zmieniają się w płaski, arkuszowy kształt miofibroblastu po aktywacji w włóknieniu13. Chociaż dziesięciolecia badań wyjaśniły szlaki sygnalizacyjne kontrolujące produkcję ECM przez HSC, funkcjonalne znaczenie ich odrębnej morfologii neuronalnej, sposób regulacji, czy mogą ułatwiać interakcje w niszy HSC oraz przyczyniać się do fibrogeniczności i chorób HSC, pozostają nieuchwytne14,15.

Obecne metody wizualizacji morfologii HSC ograniczają się do dwuwymiarowych (2D) obrazów komórek hodowanych in vitro lub przekrojów tkanek in vivo i rzadko obejmują całą morfologię HSC z projekcjami rozciągającymi się na kilka długości ciał komórek we wszystkich kierunkach. Ponadto najczęściej stosowany marker HSC, desmin, nie jest w stanie w pełni uchwycić unikalnej, neuronowatej morfologii HSC w barwieniu immunofluorescencyjnym, ponieważ desmin jest białkiem cytoszkieletu, które znakuje jedynie włókna pośrednie w HSC16. Dotychczasowe wyzwania metodologiczne utrudniały pełne uchwycenie morfologii HSC i ich interakcji komórkowych w sposób trójwymiarowy (3D) w ich naturalnym kontekście z rozdzielczością pojedynczych komórek. W rezultacie fundamentalne pytania dotyczące tego, jak morfologia HSC odnosi się do ich stanu funkcjonalnego i interakcji z sąsiednimi typami komórek, pozostają nierozwiązane.

Niniejszy artykuł przedstawia innowacyjny i kompleksowy proces obrazowania oraz analizy umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii HSC w nienaruszonej tkance wątroby. Metoda ta integruje kilka kluczowych innowacji: (1) znakowanie fluorescencyjne HSC z wykorzystaniem modeli myszy genetycznych reporterów, (2) optymalizację perfuzji i fiksacji wątroby in situ w celu zachowania nienaruszonej architektury tkanek i relacji komórkowych, (3) zmodyfikowany protokół oczyszczania tkanek oparty na iDISCO w celu uzyskania przezroczystości optycznej17, (4) wysokorozdzielcza mikroskopia konfokalna do głębokiego rejestrowania obrazów tkankowych oraz (5) spersonalizowany proces obliczeniowy do rekonstrukcji obrazów 3D oraz analiza ilościowa poszczególnych HSC. Protokół nakłada pewne ograniczenia dotyczące wielkości tkanek i zaangażowania czasowego, które należy uwzględnić. Razem protokół ten zapewnia solidne i powtarzalne ramy do rejestrowania złożonej struktury 3D HSC oraz mapowania ich relacji przestrzennych z sąsiednimi komórkami naczyniowymi, immunologicznymi i miaskrzymowymi. Strategie i procesy przedstawione tutaj dla wątroby są łatwo adaptowalne także do innych narządów 17,18,19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na mysach użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych Szkoły Medycyny Icahn przy Mount Sinai. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Generowanie myszy z HSC oznaczonymi tdTomato (TdT)

  1. Uruchom hodowców Tg(lox-stop-lox-TdTomato) x Tg(Lrat:Cre) (szczep Jackson Laboratories #00791420 oraz Mutant Mouse Resource & Research Centers (MMRRC) szczep #06959521-JAX, odpowiednio).
    UWAGA: Spodziewaj się żwirku po 3 tygodniach. Do rozrodu używaj samic LratCre, ponieważ wykazano pewną ekspresję Cre w linii zarodkowej samców.
  2. Zbieranie ogonów i miotu genotypu F1, aby zidentyfikować Tg(Lrat:Cre); Myszy Tg(LSL-TdT), które selektywnie ekspresują fluorofor TdTomato w komórkach wątrobowych gwiazd.

2. Perfuzja i fiksacja wątroby in situ

  1. Przygotowanie przed operacją
    1. Przygotuj mieszankę ketaminy i ksylazyny do znieczulenia myszy, mieszając 2 mL ketaminy, 1 mL ksylazyny i 7 ml wody.
      UWAGA: Ketamina jest substancją kontrolowaną i wymaga odpowiedniej licencji oraz regulacji do użytku laboratoryjnego.
    2. Przygotuj roztwór perfuzji 4% paradehydu (PFA) w 1x soli fosforanowej z buforem fizjologicznym (PBS).
    3. Ustaw pompę perystaltyczną, pozwalając 1x PBS przepływać przez rurkę i ustaw przepływ na 2 mL/min.
      UWAGA: Upewnij się, że w rurce nie ma pęcherzyka powietrza.
  2. Zważ mysz, aby określić ilość mieszanki ketaminy i ksylazyny do wstrzyknięcia.
  3. Wstrzyknij mieszankę ketaminy i ksylazyny dootrzewnowej do myszy.
    UWAGA: Wstrzyknąć 200 μL mieszanki na każde 20 g wagi myszy.
  4. Umieść mysz w pojemniku z pokrywką i odczekaj około 20 minut, aż mysz zostanie całkowicie unieczulona.
    UWAGA: Uszczypnij palce myszy, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu. Upewnij się, że mysz jest nadal żywa w momencie inicjacji perfuzji.
  5. Przenieś mysz ze szklanego pojemnika na platformę chirurgiczną w pozycji leżącej.
    UWAGA: PFA jest toksyczne i lotne; Dlatego przeprowadz procedurę perfuzji w okapu chemicznym. Należy gromadzić i utylizować przepływ PFA zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa.
  6. Uszczypnij dłonie stopy myszy kleszczemi, aby upewnić się, że mysz nie ma żadnych odruchów ani spazmów.
  7. Wbij cztery dłonie igłami, aby rozłożyć odwłok myszy.
  8. Spryskaj odwłok 70% etanolem, aby zwilżyć futro.
  9. Użyj kleszczy, aby podnieść skórę na środku odbrzucha, ustawić się z tylnymi nogami i zacząć ciąć skórę (obie warstwy), aby odsłonić odwłok.
  10. Użyj patyczków watowych z nawilżeniem PBS, aby przesunąć jelita i inne narządy na bok i unieść lewy płat.
  11. Ostrożnie przetnij błonę połączoną między lewym płatem a płatem ogonowym.
  12. Użyj szwów, aby zawiązać u górnej podstawy lewego płata.
  13. Przetnij lewy płat poniżej węzła szwowego i odłóż lewy płatek na bok do pobierania i przetwarzania próbek tkanek, w zależności od potrzeb eksperymentalnych (takich jak bezpośrednie zamrożenie w ciekłym arze, osadzenie w związku o optycznej temperaturze cięcia (OCT) lub utrwalanie formaliny).
  14. Użyj wacików z nawilżoną PBS, aby przesunąć wątrobę i odsłonić żyłę wrotną.
  15. Ostrożnie wprowadź igłę cewnika do żyły wrotnej mniej więcej w połowie długości żyły wrotnej.
    UWAGA: Aby wspomóc włożenie cewnika, podnieś ciało myszy, umieszczając kleszcze pod ciałem, aby uzyskać płaską powierzchnię. Ostrożnie wyrównaj igłę cewnika tak równolegle jak to możliwe do żyły wrotnej przed włożeniem.
  16. Wyjmij igłę cewnika.
    UWAGA: Upewnij się, że krew wraca się przez cewnik, aby wskazać na pomyślne założenie.
  17. Uruchom pompę perfuzyjną z przepływem 2 mL/min, połącz rurkę z cewnikem i przeinfunduj wątrobę 20 mL 1x PBS.
    UWAGA: Upewnij się, że cewnik jest całkowicie wypełniony krwią, a rurka całkowicie wypełniona buforem perfuzyjnym, zanim podłączysz je, aby absolutnie nie dostały się do organizmu pęcherzyki powietrza.
  18. Zacisnij tętnicę płucną nad wątrobą hemostatem, aby zatrzymać 1x PBS przed przejściem przez serce.
  19. Przetnij dolną żyłę główną (dolną), aby uwolnić nagromadzone ciśnienie.
  20. Reguluj prędkość pompy do 5 mL/min.
    UWAGA: Na zakończenie przelewu należy odczekać około 15 minut.
  21. Zatrzymaj pompę, aby zmienić zawartość zbiornika na 4% PFA.
    UWAGA: Upewnij się, że nie wprowadzasz pęcherzyków powietrza do rury, zatrzymując pompę, gdy w zbiorniku jest jeszcze ciecz.
  22. Przekręć wątrobę 25 mL 4% PFA.
  23. Po zakończeniu perfuzji usuń wątrobę od otaczających narządów, przecinając tkanki łączące.
  24. Umieść wątrobę w stożkowej probówce o pojemności 50 mL, wypełnionej 25 ml 4% PFA.
  25. Umieść rurkę poziomo na ławce bujającej się na noc w temperaturze 4 °C przy 1,5 obr./min, aby zapewnić ruch roztworu.
  26. Myj wątrobę 3 razy w 1x PBS na ławce bujającej przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy 1,5 obr./min.
  27. Przechowuj wątrobę w 20 mL 1x PBS z stężeniem 0,02% NaN3 w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Przechowywać wątrobę długoterminowo na tym etapie, co najmniej do roku.

3. Oczyszczanie tkanek na bazie iDISCO+

UWAGA: Oryginalny opis protokołu iDISCO+ jest dostępny w wieku 17

Dzień 1: Próbka odwodnienia

  1. Pokrój próbki wątroby na kawałki o rozmiarach około 0,5-1 cm3.
    UWAGA: Różne próbki tnij na różne kształty, aby ułatwić wykrywanie podczas etapów obrazowania.
  2. Przygotuj rozcieńczenia 20% (objętość/objętość), 40%, 60% i 80% metanolu w wodzie w osobnych szklanych butelkach.
  3. Wkładaj próbki wątroby do szklanych fiolek z zakrętkami (np. 4-7 mL).
    UWAGA: Włóż do 6 kawałków próbki wątroby w jednej szklanej fiolce o pojemności 7 mL.
  4. Próbkę odsusz za pomocą rozcieńczenia metanolu z serii H2O, 20% (vol/vol), 40%, 60% i 80% przez 1 godzinę każdą w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym przy 8 obr./min, bez wirowania.
  5. Przemyj próbkę kolejnym 100% metanolem na rotatorze kół przy 8 obr./min, bez wirowania przez godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Schłodź próbkę w temperaturze 4 °C przez 30 minut do 1 godziny.
  7. Przygotuj rozcieńczenie DCM w stężeniu 66% (vol/vol) w metanolu w szklanej butelce.
    UWAGA: Za każdym razem przygotowuj nowe rozcieńczenia. Do przygotowania roztworu używaj cylindrów szklanych, ponieważ DCM może rozpuszczać plastik, taki jak polistyren.
  8. Inkubuj próbki w roztworze 66% DCM/metanolu przez noc na rotatorze kołowym przy 8 obr./min w temperaturze pokojowej, bez wirowania.
    UWAGA: Uważaj, aby próbki nie wypływały na górę po dodaniu roztworu.

Dzień 2: Próbka wybielania

  1. Przemyj próbkę dwukrotnie 100% metanolem na rotatorze koła przy 8 obr./min, bez wirowania przez 1 godzinę za każdym razem w temperaturze pokojowej.
  2. Schłodź próbkę w temperaturze 4 °C przez 30 minut do 1 godziny.
  3. Wybielaj próbkę w schłodzonym 5%H2O2 w metanolu (1 objętość 30%H2O2 do 5 woluminów metanolu) na rotatorze kół przy 8 obr./min, bez wirowania, w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Za każdym razem przygotuj nowe rozwiązanie.

Dzień 3-5: Próbka permeabilizacji

  1. Nawodnij metanol/serię H2O: 80%, 60%, 40%, 20%, 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze kół przy 8 obr./min, bez wirowania.
  2. Przemyj próbkę dwukrotnie w PTx.2 (Tabela 1) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym o częstotliwości 8 obr./min, bez udziału w wirowaniu.
  3. Inkubuj próbki w roztworze permeabilizacji (Tabela 1) w temperaturze 37 °C przez 2 dni.

Dzień 5-17: Immunoznakowanie

  1. Blokuj próbki w roztworze blokującym (Tabela 1) przez 2 dni w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Za każdym razem przygotowuj świeży środek blokujący ze względu na niestabilność surowicy osiołka. Przechowuj pozostałe środki blokujące w temperaturze 4 °C do miesiąca.
  2. Inkubuj próbki w przeciwciałach pierwotnych rozcieńczonych w PTwH (Tabela 1) z 5% DMSO i 3% surowiką Donkey w temperaturze 37 °C na rotatorze kołowym przy 5 obr./min, bez wirowania przez 4 dni.
    UWAGA: Zacznij od rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych 1:500.
  3. Przemywaj próbki w PTwH 4-5 razy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym z prędkością 8 obr./min, bez udziału w wirowaniu (centrifugation).
    UWAGA: Opcjonalnie pozostawić próbki do prania przez noc.
  4. Inkubować próbki w przeciwciałach wtórnych i propidiu rozcieńczonym w PTwH z 3% surowiką Donkey w temperaturze 37 °C na rotatorze kołowym przy 5 obr./min, bez wirowania przez 4 dni.
    UWAGA: Zacznij od rozcieńczenia przeciwciał wtórnych 1:500. Użyj rozcieńczenia jodku propidiu w stosunku 1:250 z roztworu 5 mg/mL z jodku propidiu.
  5. Przemywaj próbki w PTwH 4-5 razy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym z prędkością 8 obr./min, bez udziału w wirowaniu (centrifugation).
  6. Pozostawić próbkę w PTwH na noc, w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym przy 8 obr./min, bez wirowania.

Dzień 18: Oczyszczanie

  1. Próbkę odsusz za pomocą rozcieńczenia metanolu w serii H2O, 20% (vol/vol), 40%, 60%, 80% przez 1 godzinę każdą w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym przy 8 obr./min, bez wirowania.
  2. Przemyj próbkę dwukrotnie 100% metanolem na obrot przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze kół przy 8 obr./min, bez udziału w wirowaniu.
  3. Inkubuj próbkę w rozcieńczonych 66% (vol/vol) DCM w metanolu przez 3 godziny w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym przy 8 obr./min, bez wirowania.
  4. Przemyj próbkę dwukrotnie w 100% DCM przez 15 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze kołowym przy 8 obr./min, bez wirowania.
  5. Inkubuj próbkę w DBE przez noc w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem.
  6. Przechowuj próbki przez dłuższy czas w DBE do roku bez wpływu na sygnał barwienia.

4. Obrazowanie mikroskopem konfokalnym

  1. Umieść wyczyszczoną próbkę w misce o szklanym dnie o średnicy 35 mm i szklanym dnie o rozmiarze #1.5.
  2. Napełnij miskę cynamatem etylom, aby całkowicie zanurzyć próbkę.
  3. Umieść antenę na konfokalnym i dostosuj ostrość, aby wybrać najlepszą płaszczyznę, która daje najjaśniejszy sygnał.
  4. Pobierz obraz kafelkowy na najjaśniejszym poziomie, aby uchwycić duży obszar próbki, używając formatu 1024 x 1024 i prędkości 600.
    UWAGA: Użyj niższego celu (10x lub 20x) dla obrazu kafelka, aby zmniejszyć czas obrazowania i rozmiar pliku.
  5. Na podstawie obrazu kafelka wybierz interesujące obszary, aby zebrać skan z-skan o wyższej rozdzielczości.
  6. Wykonaj skan z-scan przez wyczyszczoną tkankę, obejmując całą jej głębokość z najlepszą rozdzielczością mikroskopu, używając formatu 1024 x 1024 i prędkości 600.
    UWAGA: Użyj obiektywu 40x w zanurzeniu olejowym, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość dla HSC.
  7. Zapisz pliki obrazów w formacie LIF i podglądaj pliki za pomocą Fiji lub ImarisViewer 11.0.0.

5. Analiza obrazów do rekonstrukcji 3D oraz analiza ilościowa poszczególnych HSC

  1. Konwertowanie plików obrazów do formatu IMS za pomocą ImarisFileConverter 10.2.0.
  2. Użyj modelu powierzchniowego w Imaris 10.2.0, aby wykryć obiekt na obrazach.
  3. Użyj kreatora Tworzenia, aby przeprowadzić analizę wybranego obszaru zainteresowania 3D, a następnie zastosować ją na całym obrazie.
    UWAGA: Użyj tego, aby przyspieszyć proces analizy.
  4. Wybierz kanał źródłowy, absolutną intensywność i odznacz przycisk wygładzania, aby określić próg intensywności dla całego obrazu.
  5. Zmodyfikuj próg, aby uchwycić wszystkie obiekty na obrazie.
  6. Użyj liczby wokseli do filtrowania obiektów zanieczyszczenia.
  7. Sfinalizuj czarodzieja, naciśnij przycisk statystyki, aby uzyskać wszystkie pomiary statystyczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udana perfuzja i utrwalenie wątroby myszy reprezentowane jest jednolitym bladym, beżowo-żółtym kolorem wątroby, co odzwierciedla efektywne usuwanie krwi i penetrację utrwalacza (Rysunek 1A,B). Nieprawidłowa perfuzja powoduje powstawanie ciemnoczerwonych lub brązowych obszarów zakrzepów, co obniża przejrzystość optyczną i powoduje wysoki sygnał tła w tych obszarach próbek (rysunek 1C).

Podczas oczyszczania tkanek próbk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje powtarzalny i elastyczny proces przygotowywania próbki, prowadzący do trójwymiarowej wizualizacji i ilościowej analizy morfologii HSC w nienaruszonej tkance wątroby. Integracja genetycznego znakowania komórek fluorescencyjnego, perfuzji wątroby in situ oraz zmodyfikowanej metody oczyszczania iDISCO+ umożliwia obrazowanie dużych objętości tkanek w rozdzielczości pojedynczych komórek, przy jednoczesnym zachowaniu architektury przestrzennej mikrośrodowiska wątroby.

K...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te są wspierane przez programy 1R01 DK136016-01 oraz 5P30CA196521 (grant NCI center). Mikroskopia i/lub analiza obrazowa została przeprowadzona w Microscopy and Advanced Bioimaging CoRE w Icahn School of Medicine w Mount Sinai. Badania te były częściowo wspierane przez Tisch Cancer Institute at Mount Sinai, P30 CA196521 - Grant wspierający ośrodki onkologiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-RFP, królik, wstępnie adsorbowaneRockland600-401-379
4-komorowa szklana płytka o średnicy 35 mm z mikrowgłębiem 20 mm, szyba pokrywa #1.5CellvisD35C4201,5N
Zastrzyk AnaSed (zastrzyk z ksylazyny)Akorn, Inc.NDC 593990110-2020 mg/mL
Stożkowe rurki wirówkowe: 50ml Falcon352098
Patyki watoweMedlineMDS202000
Zakrzywione zamki  HemostatyFisher Scientific16-100-117
Cy3-sprzężony AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-165-153
Delikatne nożyczki do obsługi 4,75" Zakrzywione, ostre/tępeInstrument chirurgiczny Roboz
728501
Eter dibenzylowy (DBE), 98%Sigma Aldrich108014
Dichlorometan (DCM) i nie wiadomo; ≥ 99.8%Sigma Aldrich270997
Dimetylosiarkowotlenkowy (DMSO), ≥ 99.9%Sigma AldrichD8418
Przeciwciało przeciwwtórne przeciwciało przeciw królikom osiołkiemu przeciwciału przeciw królikom (H+L) z silną adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA31573
Serum osłaEMD MilliporeS30
Cynaminian etylo, 99%Sigma Aldrich112372
Extra drobne nożyczki do mikrorozcinania; Łopatka 24 mmFisher ScientificNC9232515
Szczur przeciwciała monoklonalne F4/80ThermoFisher Scientific14-4801-82
FidżiNIH
KleszczeFisher ScientificNC9214139
GlycineBio-Rad1610718
Sól sodowa heparynyChem-Impex29984
Piec hybrydyzacyjny HybaidTriad ScientificMaxi 14
Nadtlenek wodoru, 30%Sigma Aldrich31642
Oprogramowanie Imaris 10.2.0Instrumenty Oksfordzkie
Oprogramowanie ImarisFileConverter 10.2.0Instrumenty Oksfordzkie
ImarisViewer 11.0.0Instrumenty Oksfordzkie
Cewnik dożylnyExel International Inc.EXE 26751
Ketamina, zastrzyk chlorowodorkuDechraB8U4100 mg/mL
Oprogramowanie LAS X 4.4.0.24861Leica
Mikroskop konfokalny Leica Stellaris 8Leica
Metanol, klasa HPLCFisherA452-2
Rotator wielofunkcyjnyScientific Industries, Inc.Model 151
Druty (27G x 1/2'')BD305109
Paraformadehylde, proszek, 95%Sigma Aldrich158127
Pompa perystaltycznaGilsonModel Minipuls 3
Rura pompy perystaltycznej, MasterFlexThermo Scientific96400-163,1 mm średnicy x 7,6 m rurka silikonowej utwardzonej nadtlenkiem utlenionej, rozmiar L/S 16, 1/8 cala z wężem
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)CytivaSH30256.01Bezpłodny, pH 7,0–7,2, bez wapnia, magnezu
Propidium jodek, ≥ 94,0% (HPLC)Sigma AldrichP4170
ŻyletkiAmerican Line66-0362
Platforma bujanaVWRModel 200
Azyd sodu i ga; 99.5%Sigma AldrichS2002
SzewEthiconJ109T
Strzykawka (1 mL)BD309628
TritonX-100SigmaT9284
Tween-20Thermo ScientificJ20605-AP
Fiolki, z nakrętką z nakrętką i zakrętką z aluminiową okładką, gotoweSigma Aldrich27470-Utom 7 mL, fiolka z bursztynowego szkła, O.D. × H 17 mm & razy; 60 mm, gwint do 15-425

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Henderson, N. C., Rieder, F., Wynn, T. A. Fibrosis: from mechanisms to medicines. Nature. 587 (7835), 555-566 (2020).
  2. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  3. Amini-Salehi, E., et al. Global prevalence of nonalcoholic fatty liver disease: An updated review meta-analysis comprising a population of 78 million from 38 countries. Arch Med Res. 55 (6), 103043(2024).
  4. Ekstedt, M., et al. Fibrosis stage is the strongest predictor for disease-specific mortality in NAFLD after up to 33 years of follow-up. Hepatology. 61 (5), 1547-1554 (2015).
  5. Hagström, H., et al. Fibrosis stage but not NASH predicts mortality and time to development of severe liver disease in biopsy-proven NAFLD. J Hepatol. 67 (6), 1265-1273 (2017).
  6. Geng, Y., Schwabe, R. F. Hepatic stellate cell heterogeneity: Functional aspects and therapeutic implications. Hepatology. , (2025).
  7. Trinh, V. Q. -H., et al. Hepatic stellate cells maintain liver homeostasis through paracrine neurotrophin-3 signaling that induces hepatocyte proliferation. Sci Signal. 16 (787), eadf6696(2023).
  8. Sugimoto, A., et al. Hepatic stellate cells control liver zonation, size and functions via R-spondin 3. Nature. 640 (8059), 752-761 (2025).
  9. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  10. Gäbele, E., Brenner, D. A., Rippe, R. A. Liver fibrosis: Signals leading to the amplification of the fibrogenic hepatic stellate cell. Front Biosci. 8 (4), 69-77 (2003).
  11. Marra, F. Hepatic stellate cells and the regulation of liver inflammation. J Hepatol. 31 (6), 1106-1119 (1999).
  12. Milani, S., et al. Procollagen expression by nonparenchymal rat liver cells in experimental biliary fibrosis. Gastroenterology. 98 (1), 175-184 (1990).
  13. Sato, M., Suzuki, S., Senoo, H. Hepatic stellate cells: Unique characteristics in cell biology and phenotype. Cell Struct Funct. 28 (2), 105-112 (2003).
  14. Du, K., Jun, J. H., Dutta, R. K., Plasticity Diehl, A. M. heterogeneity, and multifunctionality of hepatic stellate cells in liver pathophysiology. Hepatol Commun. 8 (5), e0411(2024).
  15. Trivedi, P., Wang, S., Friedman, S. L. The power of plasticity-Metabolic regulation of hepatic stellate cells. Cell Metab. 33 (2), 242-257 (2021).
  16. Niki, T., et al. Comparison of glial fibrillary acidic protein and desmin staining in normal and CCl4-induced fibrotic rat livers. Hepatology. 23 (6), 1538-1545 (1996).
  17. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  18. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  19. Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (1), 43-55 (2014).
  20. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  21. Mederacke, I., et al. Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independent of its aetiology. Nat Commun. 4, 2823(2013).
  22. Slater, T. F., Cheeseman, K. H., Ingold, K. U. Carbon tetrachloride toxicity as a model for studying free-radical mediated liver injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 311 (1152), 633-645 (1985).
  23. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387(2021).
  24. Shrirao, A. B., et al. Autofluorescence of blood and its application in biomedical and clinical research. Biotechnol Bioeng. 118 (12), 4550-4576 (2021).
  25. Croce, A. C., Bottiroli, G. Lipids: Evergreen autofluorescent biomarkers for the liver functional profiling. Eur J Histochem. 61 (2), 2808(2017).
  26. Jafree, D. J., Long, D. A., Scambler, P. J., Moulding, D. Tissue clearing and deep imaging of the kidney using confocal and two-photon microscopy. Methods Mol Biol. , 103-126 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki gwia dziste w trobyutrwalanie tkanek tissue clearingmikroskopia konfokalnarekonstrukcja tr jwymiarowaobrazowanie tkanki w trobymiofibroblasty fibrogenneznakowanie fluorescencyjnemodele w troby myszy

Powiązane artykuły