Ocena wpływu triptolidu na gefirynę, kolybystynę i autofagię w hipokampie w modelu myszym Aβ1-42

Podsumowanie

Ten protokół opisuje ustanowienie skupione Aβ1-42-indukowanego modelu choroby Alzheimera u myszy oraz ocenę wpływu tryptolidu na białka związane z inhibitorowymi synapsami hipokampu, sygnałowanie PI3K/Akt/GSK-3β oraz markery związane z autofagią.

Streszczenie

Choroba Alzheimera wiąże się z dysfunkcją synaps, ale standaryzowane procedury oceny, w jaki sposób patologia wywołana przez Aβ wpływa na białka związane z synapsami hamującymi oraz na sygnał związany z autofagią po interwencji kandydackiej, pozostają ograniczone. Ten protokół opisuje przepływ pracy do ustanowienia modelu choroby Alzheimera wywołanej przez Aβ1-42 u myszy i oceny wpływu triptolidu na Gephyrin, Collybistin, sygnał PI3K/Akt/GSK-3β oraz markery związane z autofagią w hipokampie. Dorosłe myszy C57BL/6J otrzymują dwustronne wkłucie do komór mózgu Aβ1-42 przygotowane w warunkach indukujących agregację, po czym codzienna administracja dootrzewnowa triptolidu z dodatkiem lub bez inhibitora PI3K LY294002. Uczenie przestrzenne i pamięć są oceniane za pomocą testu z labiryntem Morrisa. Uszkodzenie neuronów hipokampu i depozycja Aβ są oceniane poprzez barwienie hematoksyliną i eozyną oraz immunohistochemiczną ocenę Aβ, a lizaki hipokampu są analizowane metodą Western blotting w celu ilościowego określenia Gephyrin, fosforylowanego Gephyrin, Collybistin, białek sygnałowych PI3K/Akt/GSK-3β, LC3-II/I oraz p62. Kluczowe zagadnienia proceduralne obejmują standaryzowaną przygotowanie Aβ1-42, dokładne sterotaksyczne wkłucie, spójne warunki testów behawioralnych, ocenę regionu zainteresowania w sposób ślepy oraz standaryzowaną analizę obrazu i densytometrii. Za pomocą tego przepływu pracy, podawaniu Aβ1-42 przypisano deficyty uczenia przestrzennego i pamięci, uszkodzenie neuronów hipokampu, depozycję Aβ, zmniejszenie ekspresji Gephyrin i Collybistin, zmiany w sygnałowaniu PI3K/Akt/GSK-3β oraz zwiększenie akumulacji LC3-II/I i p62. Triptolid częściowo odwrócił te zmiany behawioralne, histologiczne i molekularne, podczas gdy LY294002 osłabiał jego działanie. Ten protokół może być wykorzystany do oceny zmian molekularnych w hipokampie wywołanych przez Aβ oraz interwencji kandydackich, z uwzględnieniem faktu, że ten model nie odwzorowuje przewlekłego, wieloczynnikowego przebiegu choroby Alzheimera u ludzi.

Wprowadzenie

Choroba Alzheimera (AD) jest postępującym zaburzeniem neurodegeneracyjnym charakteryzującym się upadkiem poznawczym, zaburzeniem pamięci i zaburzeniami zachowania, a stanowi jedną z głównych przyczyn demencji u osób starszych. Chociaż osadzanie amyloidu-β (Aβ) patologia tau, zaburzenia synaptyczne, zapalenie ośrodkowego układu nerwowego i upośledzona homeostaza białkowa były szeroko implikowane w patogenezie AD, mechanizmy molekularne łączące toksyczność związaną z Aβ z zaburzeniem inhibitory synaptycznych białek strukturalnych pozostają niedostatecznie poznane^1,2,3,4. Dysfunkcja inhibitory synaptycznych może zakłócić równowagę pomiędzy stymulacją a hamowaniem w obwodach neuronowych, przyczyniając się tym samym do niestabilności sieci neuronowych i upośledzenia funkcji poznawczych. Jednakże zdarzenia sygnałowe wewnątrzkomórkowe, które regulują białka strukturalne synaps inhibitory podczas indukowanej Aβ patologicznych stanów przypominających AD, wymagają dalszej klaryfikacji⁵.

Gephyrin jest głównym białkiem strukturalnym synaps postsynaptycznych, który zakotwicza i stabilizuje inhibitory receptory neurotransmitterów, w tym receptory glicyny i receptory kwasu γ–aminomasłowego typu A, w synapsach postsynaptycznych⁶. Collybistin, kodowany przez ARHGEF9, jest czynnikiem wymiany nukleotydów guaninowych, który współdziała z Gephyrinem i promuje skupianie się oraz lokalizację na błonach komórkowych inhibitory komponentów synaptycznych⁷. W związku z tym, funkcjonalna interakcja między Gephyrinem a Collybistinem jest niezbędna dla organizacji, utrzymania i plastyczności inhibitory synaps. Zakłócenie tego kompleksu białkowego może upośledzić neurotransmisję inhibitory i przyczyniać się do deficytów poznawczych. Warto zauważyć, że stabilność Gephyrinu i jego skupianie się w synapsach mogą być regulowane mechanizmami zależnymi od fosforylacji. Zaobserwowano, że sygnał związany z oligomerami Aβ wpływa na kinazy takie jak kinaza syntazy glikogenu-3β (GSK-3β), które mogą promować fosforylację Gephyrinu w pozycji seryny 270 i w ten sposób wpływać na skupianie i degradację Gephyrinu. Te odkrycia sugerują, że fosforylacja Gephyrinu, regulowana przez kinazy, może reprezentować ważne łącze molekularne między patologią związaną z Aβ a dysfunkcją synaps inhibitory^8,9.

Szlak PI3K/Akt jest kluczową drogą sygnałową wewnątrzkomórkową zaangażowaną w przetrwanie neuronów, plastyczność synaptyczną, homeostazę białkową i regulację autofagii. Aktywność Akt może hamować GSK-3β poprzez fosforylację inhibitory, w ten sposób regulując białka docelowego zaangażowane w funkcjonowanie neuronów i stabilność synaps. Dysregulacja sygnalizowania PI3K/Akt/GSK-3β została zaangażowana w związane z AD uszkodzenia neuronów i może przyczyniać się zarówno do zaburzeń synaptycznych, jak i nieprawidłowej degradacji białek^10,11. Równolegle, autofagia jest istotną drogą degradacji wewnątrzkomórkowej, która usuwa uszkodzone organelle i białka nieprawidłowo sfałdowane. Dysfunkcja autofagii-lizosomalnej jest ściśle związana z akumulacją Aβ, patologią tau i uszkodzeniem neuronów w AD¹². Jednakże zmiany LC3-II/I nie mogą samodzielnie odróżnić zwiększonego powstawania autofagosomów od upośledzonej degradacji autofagii; dlatego do lepszej oceny zmian przepływu związanych z autofagią potrzebne są dodatkowe markery takie jak p62. Wszystkie te obserwacje wspierają potrzebę zbadania aktywności PI3K/Akt, regulacji Gephyrinu za pośrednictwem GSK-3β oraz markerów związanych z autofagią w ramach tej samej ramy eksperymentalnej.

Triptolid, bioaktywny ditterpen triepoksyd izolowany z Tripterygium wilfordii, ma działanie przeciwzapalne, immunomodulujące i neuroprotektywne¹³. Poprzednie badania sugerują, że triptolid może poprawiać działanie poznawcze i zachować białka związane z synapsami inhibitory w modelach przypominających AD. Niemniej jednak, mechanizmy związane z leczeniem triptolidem, aktywacją szlaku PI3K/Akt, fosforylacją Gephyrinu za pośrednictwem GSK-3β, ekspresją Collybistin i zmianami białek związanych z autofagią nie zostały w pełni określone. Czy triptolid reguluje ekspresję Gephyrinu i Collybistin w hipokampie przez mechanizm związany z PI3K/Akt/GSK-3β w modelu myszym przypominającym AD indukowanym Aβ1-42 pozostaje niejasne^14,15.

W porównaniu z przewlekłymi modelami transgenicznymi AD, takimi jak myszy APP/PS1 lub 5xFAD, oraz modelami opartymi na tauopatii, wkłucie do komory mózgu zagregowanego Aβ1-42 zapewnia stosunkowo szybkie i technicznie dostępne podejście do indukowania uszkodzenia hipokampu związanego z Aβ oraz zaburzeń poznawczych. Ten protokół jest odpowiedni, gdy celem eksperymentu jest ocena krótkoterminowej neurotoksyczności indukowanej przez A^

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny Uniwersytetu Medycznego w Hubei i zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania (nr. SYXK2019-0031.). Wszystkie procedury z udziałem zwierząt, Aβ1-42, tryptolidu, LY294002, paraformaldehydu, ksylenu, etanolu i reagentów chemiluminescencyjnych powinny być wykonywane z zastosowaniem odpowiedniego indywidualnego wyposażenia ochronnego, w tym fartucha laboratoryjnego, rękawic i ochrony oczu. Tusze zwierząt, tkanki mózgu, materiały jednorazowe zanieczyszczone Aβ, odpady paraformaldehydu, odpady ksylenu i materiały zanieczyszczone ECL powinny być zbierane osobno i usuwane zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego i utylizacji odpadów chemicznych. Analizę obrazów przeprowadzono za pomocą ImageJ. Do analizy immunohistochemicznej obrazy były konwertowane na 8-bitowe szarości lub poddawane dekonwolucji kolorowej w celu izolację barwienia DAB-dodatniego. To samo progowanie stosowano do wszystkich obrazów w ramach tego samego eksperymentu. Zmierzono dodatnio zabarwiony obszar, całkowitą powierzchnię obszaru zainteresowania i zintegrowaną gęstość. W przypadku Western blottingu intensywności pasm mierzono za pomocą narzędzia do analizy żelu po odjęciu tła. Poziom białka docelowego był normalizowany do β-aktyny, podczas gdy fosforylowane białka były normalizowane do odpowiednich poziomów całkowitego białka.

Reagents i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów, w tym nazwy produktów, producenci, numery katalogowe lub modeli oraz ogólne opisy.

Zwierzęta i grupowanie eksperymentalne
Czterdzieści osiem dorosłych myszy C57BL/6J, w tym 24 samce i 24 samice, w wieku 10-12 tygodni i o wadze 22-28 g, zostało zakupione od Ośrodka Doświadczalnego Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Hubei. Myszy były przechowywane w warunkach wolnych od patogenów specyficznych w temperaturze 22 ± 2 °C z wolnym dostępem do wodę sterylizowaną i standardową karmę dla gryzoni. Po tygodniu aklimatyzacji myszy zostały losowo przydzielone do czterech grup: grupa kontrolna, grupa modelu AD-podobnego wywołanego Aβ1-42, grupa leczona tryptolidem i grupa leczeniem skojarzonym LY294002 plus tryptolide, z 12 myszami w każdej grupie. Samiec i samica myszy były równomiernie rozłożone między grupami.

Peptyd Aβ1-42 został rozpuszczony w sterylnym fizjologicznym roztworze soli w stężeniu końcowym 10 µg/µL. Aby przygotować Aβ1-42 w warunkach indukujących agregację, roztwór inkubowano w temperaturze 37 °C przez 7 dni w obiegu wodnym, delikatnie mieszano przed użyciem i utrzymywano na lodzie podczas iniekcji. Warunki przygotowania zostały zaadaptowane z wcześniej opublikowanych procedur skupiania się na Aβ42. W niniejszym badaniu stan skupiania się dokładnie wstrzykniętego Aβ1-42 nie został niezależnie scharakteryzowany za pomocą fluorescencji tioflawiny T, SDS-PAGE/Western blotting lub mikroskopii elektronowej transmisyjnej. Dlatego termin „skupiony Aβ1-42” w niniejszym protokole odnosi się do Aβ1-42 przygotowanego w warunkach inkubacji indukujących skupienie.

Do ustanowienia modelu, myszy były znieczulone przez podanie dootrzewnowe 10% pentobarbitalu sodu w dawce 0,04 mL/10 g masy ciała. Wystarczające znieczulenie potwierdzono brakiem odbicia stóp i odruchów rogówkowych. Następnie każda mysz była fiksowana na aparacie stereotaktycznym, skóra głowy była goląco ściniana i dezynfekowana jodoforem lub 75% alkoholem. Następnie wykonano środkową nacięcie do wystawienia czaszki, a bregma została zidentyfikowana pod mikroskopem stereoskopowym. Czaszka została ustawiona tak, aby bregma i lambda były położone na tej samej płaszczyźnie poziomej.

Podwójne boczne iniekcje komorowe przeprowadzono przy użyciu następujących współrzędnych względem bregma: przednio-tylne, −0,50 mm; średnio-boczne, ±1,00 mm; i grzbietowo-brzuszne, −3,00 mm od powierzchni czaszki. Łączną objętość 2 µL skupionego roztworu Aβ1-42 powoli (2 µL/min) wstrzykiwano do każdej komory bocznej za pomocą mikrostrzykawki. Wstrzyknięcie było przeprowadzane z stałą niską prędkością, aby zmniejszyć uszkodzenie tkanek i refluks. Po wstrzyknięciu igłę pozostawiono na miejscu przez około 5 min, a następnie powoli wyciągano. Myszy kontrolne otrzymały równoważną objętość sterylnego roztworu fizjologicznego w tych samych współrzędnych i za pomocą tej samej procedury chirurgicznej. Po wstrzyknięciu nacięcie skóry głowy było zamknięte za pomocą szwów lub klipsów ranowych, a myszy były umieszczane w ogrzewanej klatce do odzysku do momentu odzyskania świadomości. Monitorowano powikłania

Wyniki

Upośledzone uczenie się i pamięć u myszy z uszkodzeniem podobnym do choroby Alzheimera wywołanym przez Aβ1-42 oraz częściowa poprawa po leczeniu triptolidem

Aby utworzyć model myszy z uszkodzeniem podobnym do choroby Alzheimera wywołanym przez Aβ1-42, skupione Aβ1-42 zostało stereotaksycznie wstrzyknięte do bocznych komór bocznych myszy C57BL/6J. Po utworzeniu modelu, myszy były leczone pojazdami, triptolidem lub triptolidem w połączeniu z inhibitorem PI3K LY294002. Następnie ocena uczenia się przestrzennego i pamięci została przeprowadzona za pomocą labiryntu wodnego Morrisa.

Podczas 6-dniowego etapu nauki miejsca, opóźnienie ucieczki zmniejszało się stopniowo we wszystkich grupach, co wskazuje, że myszy nabyły umiejętności uczenia się przestrzennego poprzez wielokrotne treningi (Rycina 1A). Jednakże myszy z uszkodzeniem podobnym do choroby Alzheimera wywołanym przez Aβ1-42 wykazywały znacznie dłuższe opóźnienia ucieczki niż myszy kontrolne, szczególnie w późniejszych dniach treningu, sugerując upośledzone uczenie się przestrzeni. Leczenie triptolidem skróciło opóźnienie ucieczki w porównaniu z grupą modelu uszkodzenia podobnego do choroby Alzheimera wywołanego przez Aβ1-42, podczas gdy współleczeni LY294002 osłabiło tę poprawę. Te wyniki wskazują, że triptolid częściowo poprawił upośledzenie uczenia się przestrzennego wywołane przez Aβ1-42, a efekt ten został osłabiony przez inhibicję PI3K.

Reprezentatywne trasy pływania dalsze wsparły te zmiany behawioralne (Rycina 1B). Myszy kontrolne wykazywały bardziej bezpośredni, ukierunkowany na cel wzór poszukiwań wokół lokalizacji platformy, podczas gdy myszy z uszkodzeniem podobnym do choroby Alzheimera wywołanym przez Aβ1-42 wykazywały rozproszoną, nieefektywną trajektorię pływania. Myszy leczone triptolidem wykazywały poprawione zachowanie poszukiwawcze, z trajektoriami bardziej skoncentrowanymi wokół obszaru docelowego. W porównaniu do tego, myszy leczone LY294002 i triptolidem wykazywały mniej efektywne poszukiwanie niż te leczone tylko triptolidem. W próbie sondażowej przeprowadzonej po usunięciu platformy, myszy z uszkodzeniem podobnym do choroby Alzheimera wywołanym przez Aβ1-42 przekroczyły oryginalne miejsce platformy mniej razy niż myszy kontrolne, co wskazuje na upośledzenie zatrzymywania pamięci przestrzennej (Rycina 1C). Leczenie triptolidem zwiększyło liczbę przejść przez platformę, podczas gdy współleczeni LY294002 zmniejszył ten efekt. Podobnie, procent czasu spędzonego w kwarcie docelowym był mniejszy u myszy z uszkodzeniem podobnym do choroby Alzheimera wywołanym przez Aβ1-42 w porównaniu z myszami kontrolnymi, wzrósł po leczeniu triptolidem i znów zmniejszył się po współleczeniu LY294002 (Rycina 1D).

Wszystkie te wyniki behawioralne pokazują, że dwustronne wstrzyknięcie do komór mózgu skupionego Aβ1-42 wywołało upośledzenie uczenia się przestrzennego i pamięci u myszy. Triptolid częściowo odwrócił te upośledzenia behawioralne, podczas gdy LY294002 osłabił efekt ochronny triptolidu, co sugeruje, że sygnalizacja PI3K/Akt może przyczyniać się do efektów behawioralnych obserwowanych w tym modelu.

Wstrzyknięcie Aβ1-42 wywołało uszkodzenie neuronów hipokampu i osadzanie Aβ, które zostało osłabione przez triptolid

Aby dalej zweryfikować utworzenie zmian patologicznych podobnych do choroby Alzheimera wywołanych przez Aβ1-42 i ocenić wpływ triptolidu na uszkodzenie hipokampu, barwienie hematoksyliną i eozyną oraz immunohistochemia Aβ zostały przeprowadzone na sekcjach mózgu z każdej grupy.

Barwienie HE wykazało, że neurony w grupie kontrolnej były gęsto i regularnie ułożone, z stosunkowo czystym ułożeniem komórek i strukturą jądra (Rycina 2A). W przeciwieństwie do tego, myszy z uszkodzeniem podobnym do choroby Alzheimera wywołanym przez Aβ1-42 wykazywały wyraźne uszkodzenie neuronów hipokampu, charakteryzujące się rozproszonym ułożeniem komórek, zmniejszoną gęstością neuronów i zwiększoną kondensacją jąder. Leczenie triptolidem częściowo poprawiło morfologię neuronów hipokampu, z bardziej zachowanym ułożeniem komórek i mniej wyraźnym spiażaniem jąder w porównaniu z grupą modelu wywołanego przez Aβ1-42. Jednakże współleczeni LY294002 osłabił efekt ochronny triptolidu, co widać na bardziej wyraźnym dezorganizacji neuronów i uszkodzeniu w porównaniu z grupą leczoną tylko triptolidem.

Następnie przeprowadzono immunohistochemia Aβ w celu oceny osadzania Aβ w hipokampie (Rycina 2B). Minimalne barwienie Aβ-dodatnie obserwowano w grupie kontrolnej, podczas gdy grupa modelu wywołanego przez Aβ1-42 wykazywała znacznie zwiększone brązowe sygnały Aβ-dodatnie. Leczenie triptolidem zmniejszyło barwienie Aβ-dodat

Dyskusja

Centralnym założeniem mechanistycznym tego badania jest to, że patologia indukowana przez Aβ1-42 tłumi sygnalizację PI3K/Akt, zmniejsza inhibitoryną fosforylację GSK-3β, promuje fosforylację Gephyrin, zmniejsza ekspresję Gephyrin i Collybistin w hipokampie, a także przyczynia się do akumulacji białek związanych z autofagią, podczas gdy triptolid częściowo przeciwdziała tym zmianom poprzez ścieżkę związaną z PI3K/Akt/GSK-3β. Badanie to pokazuje, że patologia podobna do choroby Alzheimera indukowana przez Aβ1-42 jest towarzyszona upośledzonym uczeniem się przestrzennym i pamięcią, uszkodzeniem neuronów hipokampu, zwiększoną depozycją Aβ, zmniejszoną ekspresją Gephyrin i Collybistin, zwiększoną fosforylacją Gephyrin, zmienioną sygnalizacją PI3K/Akt/GSK-3β oraz akumulacją białek związanych z autofagią. Triptolid częściowo odwrócił te zaburzenia behawioralne, histologiczne i molekularne, podczas gdy LY294002 osłabiał jego działanie. Wyniki te wspierają model, w którym triptolid chroni białka związane z inhibitorycznymi synapsami hipokampu, przynajmniej częściowo, poprzez PI3K/Akt/GSK-3β-Mediację regulacji fosforylacji Gephyrin i zmian w białkach związanych z autofagią. Należy zauważyć, że stosowany w badaniu model wkroczenia do komór mózgu Aβ1-42 przede wszystkim odzwierciedla neurotoksyczność indukowaną przez Aβ i patologię podobną do choroby Alzheimera, a nie pełny przewlekły, wieloczynnikowy rozwój ludzkiej choroby Alzheimera²¹.

Gephyrin i Collybistin są centralnymi składnikami organizacji synaps inhibitorycznych. Gephyrin zakotwicza inhibitoryczne receptory neuroprzekaźników w miejscach postsynaptycznych, podczas gdy Collybistin promuje skupianie Gephyrin i lokalizacje w błonach. Zmniejszona ekspresja tych białek może zatem zakłócić stabilność synaps inhibitorycznych i przyczyniać się do upośledzenia funkcji sieci hipokampu⁸. W badaniu tym Aβ1-42 zmniejszyło ekspresję Gephyrin i Collybistin w hipokampie, podczas gdy triptolid przywrócił oba białka. Wzrost fosforylowanego Gephyrin dostarcza prawdopodobnego mechanizmu utraty Gephyrin, ponieważ fosforylacja w Ser270 była skorelowana z rozproszeniem Gephyrin, zmniejszonym skupianiem i destabilizacją białka. Równoległe zmniejszenie ekspresji PI3K, fosforylacji Akt i inhibitorycznej fosforylacji GSK-3β sugeruje, że Aβ1-42 osłabia sygnalizację PI3K/Akt i może zwiększyć aktywność GSK-3β, co jest zgodne ze zwiększoną fosforylacją Gephyrin. Z kolei triptolid przywrócił fosforylację Akt, zwiększył inhibitoryczną fosforylację GSK-3β i zmniejszył fosforylację Gephyrin, podczas gdy LY294002 osłabiał te efekty. Wyniki te sugerują, że triptolid może zachować ekspresję Gephyrin i Collybistin poprzez PI3K/Akt/GSK-3β-związaną regulację fosforylacji Gephyrin. Jednakże, ponieważ użyto całkowitych lizatów hipokampu, wyniki te odzwierciedlają zmiany w obfitości i fosforylacji białek hipokampu, a nie bezpośrednie dowody lokalizacji synaptycznej^22,23.

Anomalie związane z autofagią mogą również przyczyniać się do zmian molekularnych obserwowanych w tym modelu. Autofagia jest ważna dla proteostazy neuronów, ale upośledzona degradacja autofagiczna w chorobie Alzheimera może prowadzić do akumulacji autofagosomów i patologicznych substratów białkowych^24,25. W obecnym badaniu, Aβ1-42 zwiększyło zarówno stosunek LC3-II/I jak i ekspresję p62, co sugeruje akumulację LC3-II związanego z autofagosomami i substratów związanych z autofagią. Triptolid zmniejszył oba markery, podczas gdy LY294002 częściowo odwrócił ten efekt, co sugeruje, że triptolid może łagodzić akumulację białek związanych z autofagią poprzez mechanizm zależny od PI3K/Akt. Wraz ze zmianami w Gephyrin, Collybistin i sygnalizacji PI3K/Akt/GSK-3β, wyniki te poszerzają zrozumienie neuroprotekcyjnych działań triptolidu poza przeciwzapalne lub ogólne działania neuroprotekcyjne, sugerując, że triptolid może również wpływać na białka strukturalne związane z synapsami inhibitorycznymi, sygnalizację kinaz i szlaki związane z proteostazą w patologii podobnej do choroby Alzheimera związanej z Aβ²⁶.

Kilka kluczowych kroków decyduje o sukcesie i powtarzalności tego protokołu. Po pierwsze, stan skupiania się Aβ1-42 powinien być starannie kontrolowany i zweryfikowany przed wkroczeniem, ponieważ przygotowanie peptydu może znacząco wpłynąć na wyniki patologiczne. Po drugie, dokładne stereotaktyczne wkroczenie do komór bocznych jest niezbędne; refluks, niewłaściwe umieszczenie igły lub nadmiernie szybkie wkroczenie mogą prowadzić do zmiennej ekspozycji na Aβ i niekonsekwentnych wyników behawioralnych lub histologicznych. Po trzecie, testy labiryntu wodnego Morrisa wymagają stabilnych wskazówek wzrokowych, jednolitej temperatury wody i monitorowania prędkości pływania, aby wykluczyć upośledzenie

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anti-Gephyrin antibody	12681	Peoteintech	Pierwotne przeciwciało do wykrywania całkowitego Gephyrin w Western blot.
Anti-phosphorylated-Gephyrin  antibody	147011	Synaptic Systems	Pierwotne przeciwciało do wykrywania fosforylowanego Gephyrin w Western blot.
Anti-Collybistin antibody	ab316963	abcam	Pierwotne przeciwciało do wykrywania Collybistin w Western blot.
Anti-PI3K antibody	27921	Peoteintech	Pierwotne przeciwciało do wykrywania PI3K w Western blot.
Anti-Akt antibody	9272	Cell Signaling Technology	Pierwotne przeciwciało do wykrywania całkowitego Akt w Western blot.
Anti-phosphorylated Akt antibody	4060	Cell Signaling Technology	Pierwotne przeciwciało do wykrywania fosforylowanego Akt w Western blot.
Anti-GSK-3β antibody	12456	Cell Signaling Technology	Pierwotne przeciwciało do wykrywania całkowitego GSK-3β w Western blot.
Anti-phosphorylated GSK-3β antibody	5558	Cell Signaling Technology	Pierwotne przeciwciało do wykrywania fosforylowanego GSK-3β w Western blot.
Anti-β actin antibody	66009	Peoteintech	Przeciwciało kontrolne do normalizacji Western blot.
Anti-LC3 antibody	11972	Cell Signaling Technology	Pierwotne przeciwciało do wykrywania LC3-I i LC3-II w Western blot.
Anti-p62 antibody	5114	Cell Signaling Technology	Pierwotne przeciwciało do wykrywania p62/SQSTM1 w Western blot.
Anti-Aβ1-42 antibody	ab150155	abcam	Pierwotne przeciwciało do wykrywania Aβ1-42.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-mouse IgG)	7076S	Cell Signaling Technology	Przeciwciało wtórne dla pierwotnych przeciwciał mysich w Western blotting.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-rabbit IgG)	7074S	Cell Signaling Technology	Przeciwciało wtórne dla pierwotnych przeciwciał króliczch w Western blotting.
Anti-Aβ antibody	GT622,	Invitrogen,	Pierwotne przeciwciało do immunohistochemii Aβ.
Aβ1-42	9001	Shanghai Duma Technology Co., Ltd.	Peptyd amyloidu-β używany do przygotowania roztworu do wstrzykiwań indukujących agregację.
triptolide	BD9097	Shanghai Bide Pharmaceutical.	Spojwiony testowy podawany dootrzewnowo.
LY294002	ab120243	abcam	Inhibitor PI3K używany dla grupy współleczonej.
paraformaldehyde	P0099	Beyotime	Środek utrwalający do perfuzji przez ucho serca i post-fiksacji tkanki.
xylene	108298	Merck	Środek do usuwania parafiny i czyszczenia tkanki.
ethanol	100983	Merck	Środek do rehydratacji i odwodnienia dla sekcji parafinowych.
propylene glycol	294004	Merck	Składnik pojazdu do przygotowania roztworów leków.
protease and phosphatase inhibitors	P1045	Beyotime	Dodatek do buforu lizującego używany do zachowania białek i stanów fosforylacji.
RIPA lysis buffer	P0013	Beyotime	Bufor lizujący do ekstrakcji całkowitych białek z tkanki hipokampu.
EDTA antigen retrieval buffer	ab93680	abcam	Bufor do ponownego uzyskania antygenu metodą termiczną do immunohistochemii.
pentobarbital sodium	P3761	Sigma	Znieczulenie używane do operacji i pobierania tkanek.
Goat serum	ZLI-9056	ZSGB-BIO	Środek blokujący do immunohistochemii.
PVDF membranes	ISEQ00010	Merck Millipore	Membran używaną do transferu w Western blot.
Morris water maze	VX80	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	Aparat behawioralny i system do rejestracji wideo do oceny uczenia przestrzennego i pamięci.
chemiluminescence imaging system	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	System do obrazowania dla chemiluminescencyjnego wykrywania sygnałów Western blot.
stereotaxic apparatus	/	Stoelting Technology Co., Ltd	Aparat używany do stereotaktycznego wstrzykiwania do komory mózgu.
BCA protein assay kit	P0006	Beyotime	Kolorymetryczny zestaw do pomiaru stężenia całkowitego białka.
microplate reader	Synergy2	Biotek	Czytnik absorpcji używany do pomiaru w badaniu BCA.
ImageJ	version 9.0.1	National Institutes of Health	Oprogramowanie do analizy obrazów w zakresie histologii, immunohistochemii i densytometrii Western blot.
GraphPad Prism	version 8.5	GraphPad Software	Oprogramowanie do analizy statystycznej i tworzenia wykresów.