Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo neuronów podwzgórza za pomocą miniaturyzowanego mikroskopu (miniscope) u swobodnie zachowujących się myszy podczas manipulacji stanem społecznym (izolacja społeczna i spotkanie społeczne). Metoda ta umożliwia obrazowanie aktywności podwzgórza w rozdzielczości pojedynczych neuronów, reprezentując potrzeby społeczne i nasycenie, umożliwiając mechanistyczne badania homeostazy społecznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In Vivo Obrazowanie wapnia mikroskopem miniaturowym w podwzgórzu w celu zrozumienia zachowań społecznych u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zachowania społeczne kręgowców są ściśle regulowane przez obwody podwzgórza. Niedawno zidentyfikowano molekularnie zdefiniowane typy neuronów podwzgórza, które kodują potrzeby społeczne w sposób homeostatyczny. Tutaj opisujemy krok po kroku protokół przeprowadzania obrazowania wapnia in vivo w przyśrodkowym jądrze przedwzgórza (MPN) za pomocą mikroskopu miniaturowego zamontowanego na głowie u wolnie zachowujących się myszy. Metoda ta umożliwia podłużne rejestrowanie dynamiki populacji neuronów podczas izolacji społecznej i ponownego zjednoczenia, co umożliwia mechanistyczne badania potrzeb społecznych i nasycenia społecznego w rozdzielczości pojedynczych neuronów. Konkretnie, dorosłe myszy otrzymują stereotaktyczne zastrzyki wirusa adenomo-asociowanego (AAV) z genetycznie zakodowanym wskaźnikiem wapnia do MPN, a następnie wszczepiane są soczewki gradientowego indeksu (GRIN) oraz podstawy mikroskopu. Po rekonwalescencji myszy przyzwyczajają się do aparatu do obrazowania z miniskopom i poddawane są zaplanowanej izolacji społecznej oraz spotkaniom, podczas których wykonywane są czynności neuronalne. Sygnały wapnia są synchronizowane z zachowaniami zwierząt do dalszej analizy. Protokół ten zapewnia kompleksowe wskazówki dotyczące obrazowania wapnia in vivo z miniskopem w podwzgórzu myszy podczas zachowań społecznych. Można go łatwo dostosować do obrazowania w innych głębokich obszarach mózgu oraz w różnych kontekstach behawioralnych. To podejście łączy aktywność neuronalną na poziomie komórkowym z zachowaniami społecznymi, poszerzając nasze zrozumienie neuronalnych podstaw złożonych zachowań u swobodnie poruszających się zwierząt.
Wprowadzenie
Zdolność do utrzymywania więzi społecznych jest podstawowa dla przetrwania zwierząt 1,2,3. Długotrwała izolacja społeczna wywołuje lęk, deficyty poznawcze i zmiany metaboliczne, podczas gdy spotkania przywracają zaangażowanie społeczne i potrzeby społeczne 4,5,6. Zaobserwowane odbicie zachowań społecznych po krótkotrwałej izolacji społecznej sugeruje obecność mechanizmu homeostatycznego7, analogicznego do regulacji głodu 8,9 lub pragnienia 10,11,12. Jednak podłoża nerwowe pośredniczące w homeostazie społecznej pozostają słabo poznane.
Najnowsze badania wykazały, że odrębne populacje neuronów podwzgórza kodują odpowiednio potrzeby społeczne i nasycenie społeczne. Obrazowanie wapnia in vivo wykazało, że populacja genetycznie zdefiniowanych neuronów glutamatergicznych w jądrze przedwzrokowym przyśrodkowego (MPN) aktywuje się podczas izolacji (neuronyizolacyjne MPN), podczas gdy inna populacja neuronów GABAergicznych aktywuje się po ponownym połączeniu (neurony MPNReunion). Aktywacja optogenetyczna neuronówizolacyjnych MPN naśladuje stan izolacji społecznej, a optogenetyczna aktywacja neuronówMPN Reunion tłumi odbicie społeczne, sugerując ich przeciwstawne role w regulowaniu potrzeb społecznych. Te populacje wzajemnie oddziałują i łączą się z obwodami nerwowymi obejmującymi cały mózg, tworząc pętlę sprzężenia zwrotnego, która dynamicznie moduluje potrzeby społeczne.
Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół mający na celu umożliwienie badaczom rejestrowania dynamiki wapnia w głębokim mózgu w rozdzielczości pojedynczych neuronów u swobodnie poruszających się myszy podczas etologicznie istotnych zachowań społecznych, takich jak izolacja społeczna i spotkanie13. Połączenie tej techniki obrazowania z etologicznie istotnymi paradygmatami społecznymi daje bezprecedensową możliwość zbadania neuronalnej reprezentacji odrębnych stanów społecznych. Uzasadnienie opracowania tej zaadaptowanej metody wynika z potrzeby wizualizacji, jak potrzeby społeczne i sytość są dynamicznie reprezentowane w głębokich strukturach mózgu, takich jak MPN. Chociaż użycie miniskopu było wcześniej opisanew punktach 14, 15, 16, jego użycie podczas nieograniczonych interakcji społecznych, szczególnie tych związanych z przejściami między izolacją a ponownym spotkaniem, wymaga specyficznych adaptacji technicznych i behawioralnych, aby utrzymać stabilność optyczną, zminimalizować artefakty ruchu oraz zapewnić naturalistyczną ekspresję zachowań.
W porównaniu z fotometrią światłowodową, podejście oparte na miniskopie oferuje rozdzielczość komórkową, umożliwiając rozróżnienie różnych typów neuronów funkcjonalnych w tym samym obszarze. Pozwala na długoterminowe rejestrowanie swobodnie oddziałujących zwierząt, co jest niezbędne do badania społecznie napędzanej dynamiki neuronalnej. Poprzednie badania z wykorzystaniem mikroendoskopii jednofotonowej koncentrowały się głównie na korze lub hipokampie grzbietowym podczas zadań przestrzennych lub sensorycznych 14,15,16. Nasz protokół rozszerza te postępy na głębsze obszary podkorowe podczas złożonych zachowań społecznych, stanowiąc wzór do badania obwodów stanów afektywnych w warunkach naturalistycznych.
Protokół jest zoptymalizowany pod kątem obszarów mózgu do głębokości ~5 mm, wykorzystując implantację soczewek GRIN oraz genetycznie kodowane wskaźniki wapnia. Kluczowe kwestie to precyzja chirurgiczna, umieszczanie soczewek, projektowanie paradygmatów behawioralnych oraz powiązana analiza danych. Metoda ta może być dostosowana do innych obszarów głębokiego mózgu i kontekstów behawioralnych. Protokół ten prowadzi użytkowników przez wszystkie kluczowe etapy: przygotowanie do operacji, podanie wirusa, implantację soczewki, projektowanie behawioralne, mocowanie mikroskopu, obrazowanie oraz analizę danych (Rysunek 1A-E). Przewidujemy, że ten przystępny, szczegółowy workflow umożliwi badanie populacji neuronalnych głębokich mózgów w szerokim zakresie zachowań naturalistycznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt na Uniwersytecie Westlake zgodnie z protokołem dotyczącym zwierząt #25-076-LD-9. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Laboratorium Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie Westlake. Cały sprzęt i materiały używane w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Operacja zastrzyku wirusa
- Podaj karprofen (5 mg/kg) podskórnie w celu leczenia przeciwbólu i umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia z 2-3% izofluranem.
UWAGA: Pomyślne wprowadzenie znieczulenia potwierdza brak odruchu zaciskania palców u stóp oraz obecność równomiernego, głębokiego oddychania. - Po 2-3 minutach lub po utracie odruchu prostowania, szybko przenieś zwierzę do instrumentu stereotaksyjnego. Zabezpiecz nos w stożku znieczulenia i utrzymuj znieczulenie z 1-1,5% izofluranem przez cały czas operacji (Rysunek 1B). Przepływ tlenu jest zazwyczaj ustawiony w przedziale od 0,8 do 1,2 L/min.
UWAGA: Monitoruj częstość oddechów zwierząt oraz inne objawy fizjologiczne. Jeśli częstość oddechu zwierzęcia wzrośnie, a u zwierząt pojawią się wąsy i inne oznaki przebudzenia, należy zwiększyć stężenie izofluranu do 2-3%. - Przymocuj siekacze myszy przez pręt siekacza instrumentu stereotaksyjnego. Dokręć zacisk na nosie, żeby naprawić głowicę.
- Ostrożnie wprowadź dwa pręty uszne do zewnętrznych kanałów słuchowych, aż będą się dobrze odpoczywać, zapewniając stabilne i sztywne ustawienie głowy (Rysunek 1B).
UWAGA: (1) Nieprawidłowe umiejscowienie, które uciska tkanki szyi, może powodować niedotyż oddechowy lub niestabilne fiksowanie. (2) Jeśli zwierzę wykazuje oznaki ciężkiego oddychania lub zmagania się podczas fiksacji, natychmiast należy zwolnić i przesunąć drążki uszne, ponieważ wskazuje to na potencjalne ucisk dróg oddechowych. (3) Upewnij się, że oba nauszniki są na tej samej wysokości. Jest to niezbędne do precyzyjnego poziomowania czaszki. - Nałóż maść okulistą na oba oczy myszy, aby zapobiec ich wysuszeniu.
- Usuń sierść na głowie za pomocą kremu do usuwania włosów. Dokładnie przetrzyj to miejsce chusteczkami z etanolem 75%, aby usunąć resztki kremu i włosów.
- Dezynfekuj odsłoniętą skórę chusteczkami z etanolem 75% i betadyną. Używając cienkich nożyczek chirurgicznych, aby wykonać środkowe cięcie strzałkowe na skórze głowy. Wycofaj skórę, aby całkowicie odsłonić czaszkę nad docelowym obszarem mózgu. Delikatnie oczyść powierzchnię czaszki wacikiem, aby usunąć okost.
UWAGA: Odsłonienie wystarczająco dużej powierzchni czaszki jest konieczne, aby zapewnić solidne kotwicze dla cementu dentystycznego, zapewniając długoterminową stabilność implantu. - Zamontuj szklaną pipetę na stereotaksowym uchwytie do pomiaru powierzchni czaszki. Pod stereomikroskopem umieść końcówkę pipety przy bregmie (przecięciu szwów strzałkowego i koronowego) i ustaw ją jako początek (X = 0, Y = 0, Z = 0, rysunek 1C).
- Przesuń końcówkę pipety na pozycję ±2 mm bocznie względem bregmy i dostosuj poziom czaszki, aż różnica wysokości między tymi dwoma punktami mieści się w ±0,03 mm.
- Następnie przesuń pipetę do lambda (przecięcie szwów strzałkowego i lambdoidalnego) i dostosuj nachylenie przed-tylne do momentu, gdy różnica wysokości między bregma a lambda mieści się w granicach ±0,03 mm (Rysunek 1C).
UWAGA: (1) Wcześniejsza ocena wizualna i korekta czaszki mogłyby znacząco usprawnić proces precyzyjnego poziomowania. (2) Suszenie powierzchni czaszki sprężonym powietrzem przed wyrównaniem poprawia widoczność szwów czaszki. - Użyj ręcznej wiertarki z głowicą 0,8 mm, aby wykonać kraniotomię docelowego obszaru mózgu (np. dla myszy C57BL6/J). Współrzędne to przód-tylny (AP) 0 mm, środkowo-boczny (ML) 0,3 mm, grzbietowo-brzuszny (DV) -4,8 mm, aby celować w obszar MPN; u myszy FVB/NJ kraniotomia wykonywana jest przy AP +0,4 mm-+0,5 mm, ML 0,3 mm i DV -4,8 mm) (Rysunek 1C).
UWAGA: W przypadku krwawienia tymczasowo zwiększyć stężenie izofluranu do 2-2,5%. Użyj sterylnej bawełnianej końcówki lub gąbki hemostatycznej, aby wchłonąć krew, a następnie natychmiast nałóż sterylną sól fizjologiczną. Po hemostazie przywróć izofluran do poziomu utrzymania (1-1,5%) i usuń nadmiar płynu. - Po kraniotomii wykonaj stereotaktyczne zastrzyki wirusa wyrażającego wskaźnik wapnia w docelowym obszarze mózgu.
- Rozcieńcz AAV-hSyn-jGCaMP7f, wirusa związanego z adeno, który służy do ekspresji genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia w neuronach oraz umożliwia obrazowanie aktywności neuronów za pomocą sygnałów wapnia, do końcowego miana około 5 × 10¹² genomów wirusa na mililitr przed podaniu.
- Najpierw napełnij szklaną pipetę olejem mineralnym, a potem roztworem wirusowym, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Ustaw pipetę na współrzędnych docelowych na powierzchni czaszki i powoli opuszczaj ją do docelowej głębokości.
- Wstrzyknij wirusa jednostronnie i powoli, w stałej dawce (np. 30 nL/min), o łącznej objętości 400nL 7, aby zapewnić infekcję wystarczającej liczby neuronów w regionie MPN. Ilość tę można dostosować do konkretnych rozmiarów obszarów mózgu oraz do obecności dodatkowych ograniczeń, takich jak system Cre-loxP.
- Po zakończeniu pozostawić pipetę na miejscu przez 10-15 minut, aby umożliwić odpowiednią dyfuzję wirusa i zminimalizować refluks wzdłuż ścieżki wstrzyknięcia, zanim powoli ją wycofaj.
UWAGA: (1) Alikwoty wirusowe o odpowiednich i stałych miaczkach są kluczowe dla skutecznej i spójnej ekspresji u zwierząt. Nadmiernie wysoki miażdżek może powodować neurotoksyczność, natomiast niewystarczający miażdżenie prowadzi do słabej ekspresji i słabego stosunku sygnału do szumu w badaniach obrazowych. (2) Powolne tempo wstrzyknięcia oraz odpowiedni czas oczekiwania przed wyciągnięciem pipety są kluczowe dla minimalizacji uszkodzeń tkanek i zapobiegania refluksu wirusa, zapewniając precyzyjną i silną ekspresję wirusa w docelowym obszarze. - Po zastrzyku wirusa zszyj skórę nad czaszką za pomocą szwów chłonnych.
- Podskórnie podaj karprofen (5 mg/kg) bezpośrednio po operacji przeciwbólowej, z dalszym monitorowaniem i dodatkowym podawaniem przez kolejne 3 dni.
- Po operacji zastrzyku wirusa trzymaj mysz indywidualnie przez co najmniej 2-3 tygodnie, aby zapewnić odpowiednią regenerację i ekspresję wirusa.
UWAGA: Implantacja soczewki GRIN (Sekcja 2) może być przeprowadzona tego samego dnia co zastrzyk wirusowy lub 2-3 tygodnie po podaniu szczepionkowego. W tym protokole opisujemy metodę dwuetapową, która pozwala badaczemu ocenić ekspresję wirusa podczas implantacji soczewki GRIN.
2. Implantacja soczewki GRIN
- Powtórz kroki 1.1-1.10, aby ponownie otworzyć kraniotomię. Zadrapuj powierzchnię czaszki skalpelem, aby lepiej uchwycić cement dentystyczny w kroku 2.8. Przy nowej kraniotomii średnica powinna być nieco większa niż soczewka GRIN (zazwyczaj ~1 mm), aby umożliwić płynne wszczepienie. Dokładnie usuń wszelkie szczątki kości po wierceniu.
- Aby zminimalizować ucisk tkanek podczas implantacji soczewki GRIN, włóż szklaną pipetę do docelowego obszaru mózgu i powoli przesuwaj pipetę w kierunku medialno-bocznym, aby stworzyć nacięcie. To mikrocięcie ma długość ~1 mm, aby stworzyć miejsce na wszczepienie soczewki GRIN (Rysunek 2A).
UWAGA: Ten krok jest kluczowy dla sukcesu całego protokołu. - Przed wszczepieniem soczewki GRIN zdezynfekuj soczewkę 75% etanolem, następnie umyj ją sterylną solą fizjologiczną i delikatnie wytrzyj chusteczką soczewki.
- Trzymaj soczewkę GRIN za uchwyt na soczewkę i mocuj miniscope na jej górze.
- Ustawij cały zespół w bregmie i ustaw wszystkie współrzędne na zero (np. X = 0, Y = 0, Z = 0). Następnie pozycjonuj go na docelowych współrzędnych X-Y powyżej kraniotomii.
- Zwilż powierzchnię czaszki sterylną solą fizjologiczną. Bardzo powoli opuszczaj soczewkę GRIN do tkanki mózgowej z prędkością około 100 μm/min, aż dotrze do celu (Rysunek 2B).
UWAGA: (1) Jeśli implantacja soczewki GRIN zostanie wykonana 2-3 tygodnie po wstrzyknięciu wizeru, podczas zakładania soczewki, włącz miniskop, aby obserwować zmiany fluorescencji w czasie rzeczywistym. W miarę zbliżania się soczewki do obszaru docelowego, ogólny sygnał fluorescencjonalny w polu widzenia staje się jaśniejszy, a tę zmianę można bezpośrednio odczytać z histogramu sygnału w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania obrazującego (Rysunek 2C, D). (2) Należy uważać, aby uniknąć krwawienia podczas implantacji, ponieważ zakrzepy znacznie pogarszają jakość sygnału. (3) Jeśli krwawienie jest nieuniknione i silne, należy wyjąć soczewkę GRIN, wyczyścić ją i ponownie wszczepić po zatrzymaniu krwawienia. - Po wszczepieniu soczewki dokładnie wysusz powierzchnię czaszki, pochłaniając resztki cieczy i dmuchając sprężonym powietrzem.
- Ostrożnie nałóż cement dentyscyjny, aby zakotwiczyć podstawę soczewki GRIN do czaszki i zbuduj pełną głowę, która zakrywa odsłoniętą czaszkę (Rysunek 2B). Uważaj, aby cement nie stykał się z otaczającymi tkankami mięśniowymi. Następnie ostrożnie poluzuj uchwyt na obiektyw i zdejmij uchwyt razem z miniskopem.
UWAGA: (1) Wymieszaj cement dentystyczny w schłodzonej płycie na lodzie, aby spowolnić proces zastygnięcia i zapewnić dłuższy czas pracy. (2) Zaleca się dodanie główki za obiektywem do trzymania myszy podczas połączenia z miniskopom. (3) Należy bardzo uważać, aby nie nakładać cementu na uchwyt na obiektyw lub miniskop. - Przygotuj dwuskładnikowy silikonowy klej, mieszając ze sobą oba płyny. Nałóż go na górną część soczewki GRIN, aby uzyskać ochronną szczelność przed kurzem i zarysowaniami podczas okresu rekonwalescencji.
- Po wszczepieniu soczewki GRIN należy trzymać mysz indywidualnie, aby uniknąć potencjalnych uszkodzeń soczewki przez towarzyszy w klatce podczas rekonwalescencji. Podawaj karprofen (5 mg/kg) podskórnie przez 3 dni po operacji przeciwbólowej.
3. Montaż płyty podstawowej
- Dwa do trzech tygodni po wszczepieniu soczewki GRIN przeprowadza się montaż płyty podstawowej. Znieczulaj i zafiksuj mysz w przyrządzie stereotaksyjnym, jak opisano powyżej.
- Usuń silikonową uszczelkę z górnej części soczewki GRIN i delikatnie wyczyść powierzchnię soczewki kawałkiem chusteczki.
- Przymocuj podstawę do miniskopu. Cały zespół mikroskopu z płytą podstawową można zamontować na ramieniu manipulatora stereotaksyjnego za pomocą uchwytu.
- Podłącz miniscope do urządzenia do akwizycji danych i włącz obrazowanie na żywo.
- Ustawić obiektyw mikroskopu i wszczepioną soczewkę GRIN, precyzyjnie regulując manipulator, aby uzyskać precyzyjne optyczne współosiowe wyrównanie między miniskopem a soczewką GRIN.
- Ustaw obiektyw mikroskopowy równolegle do górnej powierzchni soczewki GRIN i upewnij się, że ramka całej soczewki GRIN jest uwzględniona w oknie obrazowania z idealnie okrągłym wyglądem, a środek soczewki znajduje się w centrum okna obrazowania.
- Opuszczenie mikroskopu do optymalnej odległości roboczej, aby uzyskać wyraźne obrazy neuronów w celowej płaszczyźnie ogniskowej.
- Użyj cementu dentystycznego, aby przyłożyć i otoczyć płytę podstawową na istniejącej cementowej pokrywce (Rysunek 2B).
UWAGA: (1) Kluczowym krokiem jest podniesienie miniskosu o niewielką, empirycznie określoną odległość (około 50-100 μm) przed ostatecznym fiksowaniem, aby skompensować potencjalne przesunięcie płaszczyzny ogniskowej spowodowane kurczeniem się cementu podczas zastygania. (2) Należy zachować szczególną ostrożność, aby cement dentystyczny nie zetknął się z jakimikolwiek częściami mikroskopu, które mają zostać odłączone po montażu płyty podstawowej. - Po całkowitym zastygnięciu cementu dentystycznego poluzuj uchwyt, ostrożnie odłącz mikroskop od płyty podstawowej i natychmiast przykręć nakrętkę na płytę podstawową, aby chronić interfejs optyczny.
- Trzymaj mysz indywidualnie przez 3-5 dni po założeniu podstawy, a potem połącz ją z towarzyszami w klatce na co najmniej tydzień, zanim pojawi się manipulacja stanem społecznym (np. izolacja społeczna).
4. Habituacja i ustawianie parametrów obrazowania
- Przyzwyczaj wszczepione myszy do tymczasowego przytrzymywania głowy do montażu mikroskopu oraz do zestawu obrazowania 2-3 razy przed formalnymi sesjami obrazowania.
- Aby zamontować miniscope na podstawie, unieruchom głowę wszczepionych myszy, zdejmij pokrywę podstawy i zadokuj miniscope do płyty podstawowej przez interfejs magnetyczny. Następnie dokręć boczną śrubę, aby zabezpieczyć miniskop. Wykonaj obrazowanie wapniem przez 10 minut, podczas których zwierzę swobodnie porusza się w arenie nagraniowej lub klatce.
- Podczas tej sesji obrazowania wprowadzaj bodźce, takie jak delikatny dotyk i nowa mysz. Przeanalizuj dane (patrz szczegóły w Sekcji 6), aby sprawdzić, czy sygnały pojedynczych neuronów można wyodrębnić. Podczas habituacji określ optymalne ustawienia obrazowania, regulując płaszczyznę ogniskową miniskopa wzdłuż jego odległości roboczej, aby zmaksymalizować liczbę obserwowanych neuronów i ostrość obrazu.
- Ustaw moc oświetlenia na ~10% maksymalnej wartości, a wzmocnienie czujnika na ~10-20% maksymalnej wartości, aby uzyskać wyraźne sygnały bez nasycenia. Obraz w rozdzielczości przestrzennej 1280 x 800 z częstotliwością próbkowania 20 Hz. Zapisz te ustawienia dla każdego zwierzęcia i wykorzystaj je ponownie podczas kolejnych sesji obrazowania.
5. Testy społeczne behawioralne do obrazowania wapnia w mikroskopie
- Test spotkań społecznych (Rysunek 3A)
- Izoluj mysz z implantem mikroskopowym na 1, 3 lub 5 dni przed badaniem obrazowym. Wykonaj obrazowanie wapnia podczas badań wyjściowych, reunionów i ponownej izolacji.
- Punkt wyjścia: Podłącz mysz do miniskopa i nagrywaj przez 10 minut, podczas których mysz pozostaje odizolowana.
- Reunion: Dodaj byłego towarzysza z klatki do komory nagraniowej i nagrywaj przez 10 minut.
- Ponowna izolacja: Usuń towarzysza z klatki po 10-minutowym spotkaniu i rób zdjęcie przez kolejne 10 minut podczas ponownej izolacji.
- Test izolacji społecznej (rysunek 3B)
- Odizoluj mysz z implantem w miniskopie przez 6 godzin i rejestruj sygnały wapnia na początku każdej godziny przez 15 minut.
- Dodaj byłego towarzysza z klatki do komory nagrywającej i nagrywaj przez 10 minut na końcu całej sesji obrazowania, aby zidentyfikować neurony istotnie modulowane przez spotkanie społeczne (szczegóły w sekcjach 6 i 7).
UWAGA: (1) Ten konkretny harmonogram obrazowania jest stosowany w celu minimalizacji sygnałowego fotobielenia i umożliwienia monitorowania aktywności neuronalnej przez pierwsze 6 godzin izolacji społecznej. (2) Miniscope jest podłączony przez cały proces. (3) To podejście umożliwia śledzenie tego samego zespołu neuronalnego przez całą sesję obrazowania. (4) Podczas obrazowania dostarczane są jedzenie i hydrożel.
6. Wstępne przetwarzanie danych
- Importuj surowe filmy obrazowe do oprogramowania do przetwarzania danych.
- Przestrzennie i czasowo zmniejszaj próbkę oryginalnego wideo, gdy jest to konieczne, aby zmniejszyć obciążenie obliczeniowe związane z analizą danych.
UWAGA: Do tej analizy surowe dane obrazowe są rejestrowane w rozdzielczości przestrzennej 1280 x 800 przy częstotliwości 20 Hz; Przestrzennie zredukuj wideo czterokrotnie, a czasowo dwukrotnie. - Zastosuj filtr przestrzenny z odejmowaniem średniej globalnej, aby zmniejszyć szum wysokich częstotliwości i dryf tła niskiej częstotliwości.
- Korygowanie artefaktów ruchu za pomocą algorytmu korekcji ruchu w oprogramowaniu do przetwarzania danych. Wizualnie obejrzyj film z korekcją ruchu, aby upewnić się, że są stabilne neuronalne somata i minimalne pozostałości artefaktów ruchu.
- Kliknij przycisk "Identify Cells" i wybierz "CNMFe" na liście, aby wyodrębnić ślady aktywności wapnia poszczególnych neuronów za pomocą algorytmu CNMF-E17 (Constrained Non-negative Matrix Factorization for microEndoscopic data).
- Kliknij przycisk linijki w oprogramowaniu do przetwarzania danych i zmierz średnice soma (w pikselach) z reprezentatywnych neuronów. Wprowadź średni rozmiar w polu "Średnia średnica komórki (pikseli)". Następnie kliknij przycisk Apply , aby uruchomić CNMF-E.
- Dostosowuj ustawienia inicjalizacji CNMF-E, gdy wykrywalność komórek jest niewystarczająca, pojawiają się nadmierne komponenty niekomórkowe lub występuje nadmierna segmentacja.
- Sprawdź wszystkie wyodrębnione składniki i akceptuj/odrzucaj je na podstawie morfologii komórek oraz biologicznie wiarygodnej dynamiki wapnia. Wyklucz elementy o nieregularnych i kolczastych kształtach. Wyklucz ślady zdominowane przez szumy lub artefakty ruchowe.
UWAGA: (1) Rysunki 2E i 2F pokazują dwa uznane neurony z wyraźną morfologią neuronów oraz typowymi przejściowymi zjawiskami wapnia. (2) Rysunki 2G i 2H pokazują dwa odrzucone neurony z wyraźnymi wahaniami bazowymi i brakiem typowych przejściowych elementów wapnia. - Eksport śladów fluorescencji akceptowanych neuronów z oprogramowania do przetwarzania danych w celu dalszej identyfikacji neuronów modulowanych stanem społecznym (Sekcja 7).
7. Identyfikacja neuronów modulowanych stanem społecznym
- Użyj MATLAB-a lub Pythona, aby dokładniej analizować dane przetworzone.
- Dopasuj ślady aktywności wapnia akceptowanych neuronów do behawioralnych znaczników czasu.
- Znajdź punkt czasu spotkania społecznego z filmu o zachowaniu. Dla każdego neuronu aktywność podziel na okres izolacji społecznej przed zjazdem trwający 300 sekund i okres spotkania społecznego trwający 300 sekund.
- Dla każdego neuronu ilościowo określ rozkład aktywności wapnia podczas okresów izolacji i ponownego połączenia.
- Wykonaj analizę charakterystyki operacyjnej odbiorcy (ROC)18 , aby ocenić zdolność aktywności neuronalnej do rozróżniania stanów izolacji od ponownego połączenia, co daje wartość AUC obliczającą obszar pod krzywą ROC.
- Oceń istotność statystyczną za pomocą testu permutacyjnego. Dla każdego neuronu wartości aktywności wapnia są kołowo przesuwane między stanami behawioralnymi w 1 s pojemnikach czasowych przez 1 000 razy, aby uzyskać zerowy rozkład wartości AUC. Neurony z obserwowanymi wartościami AUC przekraczającymi 95. percentyl ich przetasowanej dystrybucji zerowej są uważane za istotnie modulowane przez stan społeczny.
- Klasyfikuj istotnie modulowane neurony na podstawie kierunku modulacji. Klasyfikuj neurony zahamowane przez ponowne połączenie jako Neurony Izolacyjne i aktywowane przez ponowne połączenie jako Neurony Reunion (Rysunek 4).
8. Weryfikacja po eksperymencie
- Przeprowadź myszy i wykonaj standardową histologię, aby zweryfikować ślad soczewki GRIN i ekspresję wirusa (patrz przykład obrazowania histologicznego na Rysunku 2I).
- Użyj 4% PFA, aby przywiązać całą głowicę myszy razem z implantem, a następnie usuń soczewkę GRIN, aby zobaczyć wyraźny ślad soczewki.
UWAGA: Uwzględniaj tylko dane od zwierząt z prawidłowym celowaniem.
9. Rozwiązywanie problemów i praktyczne wskazówki
- Zabezpiecz główkę z cementem dentystycznym za miniscope, aby ułatwić montaż i zdjęcie miniskopu.
UWAGA: Ramka głowowa nie powinna być zbyt długa i może być umieszczona pod lekkim kątem, aby zapobiec zakłócaniu zachowań społecznych. - Indywidualnie przetrzymywać wszczepione myszy podczas okresu rekonwalescencji po operacji przez co najmniej tydzień. Daje to myszom wystarczająco dużo czasu na regenerację i zapobiega uszkodzeniom implantu przez inne myszy.
- Ponownie połącz wszczepione myszy do ich poprzednich towarzyszy w klatce, gdy zostaną całkowicie wyzdrowiałe. Regularnie sprawdzaj i dokręcaj pokrywy. Przygotuj dodatkowe pokrywy i wymień je, gdy zostaną zgubione podczas konserwacji zwierząt.
- Sprawdź sygnały wapnia 3-4 tygodnie po wstrzyknięciu się wirusa GCaMP. Jeśli sygnały są zbyt słabe lub niewyraźne, dłuższy okres odzyskania czasem poprawia jakość sygnałów.
- Uważaj na powierzchnie soczewek po stronie obiektywu GRIN lub po stronie miniskopu. Utrzymuj soczewki czyste i wolne od zarysowań. Zakryj obiektyw, gdy go nie używasz.
- Przed obrazowaniem dostosuj długość kabla sygnałowego tak, aby zwierzę mogło dotrzeć do zakamarków sali obrazowania i na tyle krótką, by umożliwić płynne interakcje społeczne.
- Chroń kabel warstwą wytrzymałego materiału, gdy to konieczne, aby zapobiec ugryzieniu przez inne myszy podczas kontaktów społecznych. Regularnie sprawdzam kabel sygnałowy, aby sprawdzić, czy nie jest skręcony przez intensywną interakcję społeczną.
- Aby zidentyfikować ten sam zespół neuronalny na podstawie kolejnych sesji obrazowania (na przykład na Rysunku 3B), surowe filmy obrazujące można było łączyć w celu wydobycia śladów wapnia.
- Aby zsynchronizować wiele sygnałów, na przykład filmy behawioralne i sygnały wapniowe, zwykle używa się wspólnych wejść TTL oraz zsynchronizowanych latarek do wyrównania różnych plików nagrań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Identyfikacja populacji neuronalnych
Ekspresyjnie wyrażaliśmy wirusa GCaMP i wszczepiliśmy soczewkę GRIN w MPN myszy C57BL/6J. Po operacji mysz wyzdrowiała indywidualnie i była ponownie połączona ze swoimi towarzyszami klatki na co najmniej tydzień. Następnie mysz była trzymana indywidualnie przez 3 dni przed sesją obrazowania wapnia. Podczas obrazowania najpierw zarejestrowano 10-minutowy poziom izolacji, a następnie 10-minutowe spotkanie społeczne z byłym współlokatorem z klatki. Aktywność wapnia ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje zintegrowane podejście łączące obrazowanie wapnia in vivo z paradygmatami zachowań społecznych w celu oceny profilu aktywności neuronów podwzgórza. Umożliwia długoterminowe, komórkowe obrazowanie wapnia z głębokich struktur mózgu podczas naturalnych interakcji społecznych. Poniższe sekcje omawiają kluczowe kroki, znaczenie metodologiczne, ograniczenia oraz przyszły potencjał tego podejścia.
Sukces tego protokołu zależy od serii skrupulatnych i powiązanych ze sobą ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych ani konfliktu interesów. ChatGPT był wykorzystywany w procesie redakcji rękopisów, przy dokładnej i szczegółowej korektie przez wszystkich autorów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować profesor Catherine Dulac za wsparcie podczas początkowego szkolenia eksperymentów z miniskopom oraz Yang Sunowi za pomoc w przeprowadzeniu operacji. Prace te były wspierane przez początkowe fundusze Westlake University oraz fundusze NOMIS Foundation, Tan-Yang Center for Autism Research na Uniwersytecie Harvarda, nagrodę Jane Coffin Childs Medical Research Award dla D.L. oraz Charles A. King Trust Postdoctoral Fellowship dla D.L. Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Liu za komentarze dotyczące manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pA | Taitool | S0587-9 | Wektory wirusowe, chirurgia |
| Bezpieczna gąbka żelatynowa do zapuszczania | FUKANGSEN | FKS-A | Chirurgia |
| Roztwór betadyny (10% jodowanyPovidon) 500mL | HYNAUT | Q13702855HNW002 | Chirurgia |
| Kamera do wideo behawioralnego | DAHENG | MER2-160-227-U3C | Zachowanie |
| Karprofen | MCE | HY-B1227 | Chirurgia |
| Cyfrowe Instrumenty Stereotaksyjne | Napęd na tylne koła | 68803 | Chirurgia |
| Etanol (75%) | Sinopharm chemical reagent co., LD | 801769610 | Chirurgia |
| Maść do oczu | FODU | H37022025 | Chirurgia |
| Oprogramowanie do przetwarzania danych Inscopix (IDPS) | Inscopix | 1000-006551 | Analiza danych |
| Izofluran | Napęd na tylne koła | R510-22-10 | Chirurgia |
| Pakiet kleju Kwik-Sil po 2 | Światowe Precyzyjne Instrumenty | KWIK-SIL | Chirurgia |
| Mikrowiertło | Napęd na tylne koła | 78001 | Chirurgia |
| Mikropipeta MP-1000 | Napęd na tylne koła | MP-1000 | Chirurgia |
| Wielofunkcyjne rozwiązania do znieczulenia zwierzęcego | Napęd na tylne koła | TAIJI-IE | Chirurgia |
| Pompa mikrowtryskowa nanolitrów | Napęd na tylne koła | R-480 | Chirurgia |
| Miniscope nVista 3.0 | Inscopix | 1000-004323 | Obrazowanie |
| Kleszcz okulistyczny | Napęd na tylne koła | F12006-10 | Chirurgia |
| Obsługa nożyczek | Napęd na tylne koła | S14001-15 | Chirurgia |
| Zestaw implantów ProView | Inscopix | 1000-004238 | Chirurgia i obrazowanie |
| Cement żywiczny (Super-bond) | Sun Medical | Super bond C& B | Chirurgia |
| Zestaw 5 pokryw na bazę | Inscopix | 1050-004639 | Obrazowanie |
| Zestaw 5 płyt bazowych | Inscopix | 1050-004638 | Obrazowanie |
| Zestaw 5 obiektywów GRIN, średnica 0,6 mm, długość 7,3 mm | Inscopix | 1050-004626 | Chirurgia i obrazowanie |
| Mikroskop stereotaksowy | Murzider | MSD205A | Chirurgia |
| Sól fizjologiczna sterylna | QIDUKELIN | R1B25071902 | Chirurgia |
Bibliografia
- Beery, A. K. Frank Beach award winner: Neuroendocrinology of group living. Horm Behav. 107, 67-75 (2019).
- Krause, J., Ruxton, G. D. Living in groups. , Oxford University Press. (2002).
- Riters, L. V., Kelm Nelson, C. A., Spool, J. A. Why do birds flock? A role for opioids in the reinforcement of gregarious social interactions. Front Physiol. 10, 421(2019).
- Panksepp, J. B., Lahvis, G. P. Social reward among juvenile mice. Genes Brain Behav. 6 (7), 661-671 (2007).
- Matthews, G. A., Tye, K. M. Neural mechanisms of social homeostasis. Ann N Y Acad Sci. 1457 (1), 5-25 (2019).
- Lee, C. R., Chen, A., Tye, K. M. The neural circuitry of social homeostasis: Consequences of acute versus chronic social isolation. Cell. 184 (6), 1500-1516 (2021).
- Liu, D., et al. A hypothalamic circuit underlying the dynamic control of social homeostasis. Nature. 640 (8060), 1000-1010 (2025).
- Luquet, S., Perez, F. A., Hnasko, T. S., Palmiter, R. D. NPY/AgRP neurons are essential for feeding in adult mice but can be ablated in neonates. Science. 310 (5748), 683-685 (2005).
- Balthasar, N., et al. Leptin receptor signaling in POMC neurons is required for normal body weight homeostasis. Neuron. 42 (6), 983-991 (2004).
- Zimmerman, C. A., et al. Thirst neurons anticipate the homeostatic consequences of eating and drinking. Nature. 537 (7622), 680-684 (2016).
- Augustine, V., et al. Hierarchical neural architecture underlying thirst regulation. Nature. 555 (7695), 204-209 (2018).
- Allen, W. E., et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 357 (6356), 1149-1155 (2017).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), (2017).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. J Vis Exp. (162), (2020).
- Burrows, R., Ma, C. H., Sun, Y. J. Long-term imaging of identified neural populations using microprisms in freely moving and head-fixed animals. J Vis Exp. (203), (2024).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, e28728(2018).
- Britten, K. H., Shadlen, M. N., Newsome, W. T., Movshon, J. A. The analysis of visual motion: a comparison of neuronal and psychophysical performance. J Neurosci. 12 (12), 4745-4765 (1992).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
