Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie mózgu i jelit w populacjach ryb powierzchniowych i jaskiniowych Astyanax mexicanus

DOI:

10.3791/70412

⸱

24 lutego 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, UPR- Medical Sciences Campus, 2Molecular Sciences Research Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj protokół do rozcinania i ekstrakcji całych składników mózgu i jelit, morfotypów przystosowanych do powierzchni i jaskini Astyanax mexicanus. Protokół ten można dostosować do zastosowań w dalszych etapach, w tym w transkryptomice, metabolomice oraz analizie mikrobioty jelitowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ryby teleostowe są wykorzystywane do odpowiadania na szeroki zakres pytań badawczych, od rozwoju przez genetykę i neurobiologię, a ostatnio także do zrozumienia złożoności osi jelita-mózg, a nawet w szerszym kontekście osi jelita-mózg-wątroba. Meksykańska tetra, Astyanax mexicanus, jest coraz częściej wykorzystywana w ramach ewolucji porównawczej i rozwojowej ze względu na dostępność morfologicznie i fizjologicznie odrębnych morfotypów, w tym ryb powierzchniowych zamieszkujących rzeki oraz przystosowanych do jaskiń i ślepych jaskiniowych ryb przystosowanych do jaskiń. Adaptacja do siedlisk jaskiń wiąże się ze zmianami cech morfologicznych, zachowań oraz różnorodności mikrobioty jelitowej, które występują również w warunkach laboratoryjnych. To otworzyło możliwość zadawania pytań o interakcje między mikrobiomem, aktywnością metaboliczną, adaptacją neuronalną oraz złożonymi efektami behawioralnymi. Te interakcje można teraz analizować poprzez badania mapowania całego mózgu z oczyszczonymi mózgami oraz sekwencjonowanie mikrobioty jelitowej w celu wykrywania różnorodności bakterii związanej z fenotypami przystosowanymi do powierzchni i jaskiń. Jednak większość tych badań skorzystałaby na zachowaniu całych organów i tkanek w całości, starannie rozciętych i zachowanych, co umożliwia późniejsze przetwarzanie w dalszych zastosowaniach. Protokół ten opisuje krok po kroku metodę rozwarstwiania mózgu i jelit, polegającą na tym, że cały mózg i narządy jamy brzusznej są usuwane i izolowane zarówno dla morfotypów ryb powierzchniowych, jak i jaskiniowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele zwierzęce, w tym ryby kręgowce, są kluczowymi narzędziami do modelowania zjawisk biologicznych i złożonych patologii w stosunkowo prostszych, dostępnych systemach. Na przykład danio danio, Danio rerio, jest jednym z najczęściej stosowanych modeli ryb teleostowych, z wieloma metodami stosowanymi do badania ich rozwoju, genetyki, fizjologii i zachowania, co ma znaczący wpływ na nauki biomedyczne i neurobehawioralne 1,2,3,4,5,6,7,8 . Ogromną zaletą stosowania danio pręgowanego obecnie jest dostępność wielu metod badania histologii i patologii narządów i tkanek w liniach mutantów z utratą funkcji, dla których istnieją protokoły sekcji krok po kroku 3,9,10.

Jednak w ostatnich dekadach pojawia się wiele innych modeli ryb teleostowych, które nadają się do zadawania innych typów pytań, w tym tych z dziedzin biologii ewolucyjnej 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 , mechanizmy biologiczne leżące u podstaw starzeniasię 2,22, toksykologii23,24 oraz innych25,26. Przykładem jest tetra meksykańska, Astyanax mexicanus, ryba teleostowa pochodząca z północno-wschodniego Meksyku, z przodkami ryb powierzchniowych zamieszkujących rzeki oraz ponad 30 populacjami ślepych jaskiniowych ryb jaskiniowych (Rysunek 1)12.

Jaskiniowce przystosowały zestaw cech morfologicznych, w tym utratę oczu12,27, utratę pigmentacji28, rozszerzenie układów sensorycznych 17,29,30 oraz zwiększone magazynowanie tłuszczu 12,31, co pozwoliło im przetrwać w wrogich środowiskach jaskiniowych. Ryby te przystosowały także zestaw cech behawioralnych, w tym skrócenie snuo 19,20, lęk32, ławicę33 oraz agresję 13,18,19,20,29,34,35,36,37, w porównaniu do ich przodków ryb powierzchniowych. Adaptacja większości tych cech najprawdopodobniej wynikała z kombinacji zmienności genetycznej i presji środowiskowej 35,36,28, które obejmują różnice siedlisk między rzekami a jaskiniami. Coraz bardziej użyteczny model do zadawania pytań dotyczących wpływu zmienności genetycznej na adaptację cech morfologicznych i behawioralnych 16,18,19,20,35,38,39, a ostatnio także na różnorodność mikrobioty jelitowej 14,15, pytania, które mogą wymagać pobrania narządów takich jak mózg, jelita, wątroba i inne, istnieje potrzeba ustandaryzowanego protokołu do sekcji anatomii grubej, który może być stosowany przez całą społeczność. Chociaż sekcje całego mózgu i organów u A. mexicanus były już wcześniej wykonywane, brakuje kompleksowej, kompleksowej metody, która pozwoliłaby zrozumieć, jak przeprowadzać tego typu sekcje w sposób efektywny czasowo, co jest kluczowe dla wielu typów projektów, w tym tych wymagających pobierania próbek do metabolomiki40, metagenomiki41, lub obrazowanie całego narządu16,38. Naszym celem jest usunięcie bariery w rozwiązywaniu problemów w dostępie do narządów w tym modelu do postprocessingu, umożliwiając użytkownikom społeczności płynne skupienie się na badaniach.

W tym protokole przedstawiamy krok po kroku metodę rozwarstwiania mózgu i przewodu pokarmowego u dorosłych ryb powierzchniowych oraz jaskiniowców Pachón gatunku Astyanax mexicanus. Metodologia ta może być dostosowana do różnych protokołów dalszych działań, w tym tych związanych z mikrobiomem jelitowym, metabolomiką tkanek oraz oczyszczaniem mózgu do obrazowania całego mózgu na mikroskopie świetlnym. Technika ta jest również adaptowalna do jednoczesnego zastosowania na tym samym okazie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten jest realizowany zgodnie z zatwierdzonymi przez IACUC protokołami 2024-0004 i A790125 w Centrum Nauk Molekularnych oraz na kampusie nauk medycznych Uniwersytetu Portoryko.

1. Przygotowanie przed sekcją

  1. Jeśli używasz talerza Sylgard Petri (SP) do rozwarstwienia, upewnij się, że są przygotowane przed zabiegiem, mając na uwadze, że może zająć kilka dni na utrwalenie.
  2. Do przygotowania dania SP użyj Sylgard 184 i Elastomer 184 w proporcji 10:1. Wymieszaj 200 g bazy Sylgard 184 z 20 g elastomeru w jednorazowym kubku. Wlej do szalek Petriego na około jedną trzecią do połowy głębokości. Stuknij w naczynie, aby usunąć bąbelki i zakręcić. Upewnij się, że naczynia są napełnione i pozostawione na równej powierzchni. Pozostawić do utwardzenia co najmniej tydzień42.
    UWAGA: Jeśli pobierasz próbki do sekwencjonowania rRNA 16s lub metagenomiki, powstrzymaj się od używania poczek SP. Zamiast tego stosuj sterylne, jednorazowe płytki Petriego i stosuj technikę aseptyczną pod laminarnym kapturem. Jeśli stosujesz technikę aseptyczną, zaleca się czyszczenie okapu laminarnego etanolem 70%, detergentem o zagrożeniu, a najlepiej wystawienie okapu na działanie ultrafioletowej lampy C o germicydalnym świetle przez 15 minut. Należy to zrobić przed umieszczeniem zdezynfekowanych i autoklawowanych materiałów/narzędzi do laminarnego okapu.
  3. Ustaw mikroskop do sekcji z ręcznikami papierowymi po obu stronach. Jedną stronę należy wyznaczyć na magazynowanie odpadów (np. nadmiar tkanek organów), a drugą na umieszczenie sterylnych narzędzi do sekcji. Wytnij małe kawałki ręcznika papierowego, aby czyścić narzędzia między sekcjami.
  4. Przygotuj 1 PBS i trzymaj go w zimnej zawiesinie lodowej oraz pod ręką na wypadek potrzeby czyszczenia miejsc lub okazów dla lepszej widoczności. W zależności od protokołu zdecyduj się nie używać 1PBS.
    UWAGA: Zaleca się nieużywanie go, na przykład podczas pobierania próbek do sekwencjonowania metagenomowego43. Jeśli stosuje się 1 PBS w tego typu podejściu, zaleca się pobranie próbki 1PBS do sekwencjonowania, aby przesiewać możliwe zanieczyszczenie.
  5. Umieść SP (lub jednorazową, sterylizowaną szalkę Petriego) pod mikroskopem i upewnij się, że masz pod ręką wszystkie narzędzia (zestaw do sekcji, rurki mikrowirówki do pobierania tkanek na lodzie itp.).
  6. Włóż 1 rurkę PBS i oznaczoną mikrowirówkę do pobliskiego wiadra na lód. Miej w ręku plastikowy zakraplacz na 1 PBS.
  7. Zorganizuj stację eutanazji ryb w pobliżu. Przygotuj kąpiel lodową, umieszczając zawiesinę lodową w akwarium z plastikową kratką w środku, a następnie napełnij ją wodą z systemu rybnego (z ich systemu lub akwarium domowego).
    UWAGA: MS-222 może być również używany, w zależności od protokołów dalszych (przykładowe potrzeby obróbki końcowej).

2. Sekcja mózgu u dorosłych ryb powierzchniowych i jaskiniowych

  1. Uśpiaj ryby w lodowej zawiesie. Upewnij się, że nie ma ruchu, a ryba tonie na dno, bez ruchu operacyjnego. Czas zależy od rozmiaru. Większe ryby potrzebują więcej czasu, by zatrzymać ruch operkulny.
    UWAGA: Młode ryby potrzebują około 2-5 minut na zatrzymanie ruchu opłuczkowego (eutanazja), natomiast dorosłe i duże ryby mogą potrzebować około 10-15 minut. Istnieją różnice oparte na morfotypie. Niektóre populacje jaskiniowych mogą potrzebować więcej czasu niż ryb powierzchniowych na znieczulenie/eutanazję. Protokoły hodowlane i eksperymentalne zalecają walidację procedur znieczulenia i eutanazji w populacjach, ponieważ odpowiedzi mogą się różnić między morfami i populacjami11.
  2. Przełóż ryby do SP (lub jednorazowej, sterylizowanej szalki Petriego wewnątrz kaptura) i za pomocą zakraplacza wykąp w lodowatym 1x PBS (Rysunek 1).
  3. Odłącz głowę od ciała, tnąc skalpelem około 2 mm za skrzelami (Rysunek 2). To chroni część śródmózgowia i pozwala na jego manipulację po rozcięciu, bez powodowania uszkodzeń. Przenieś ciało w stronę obszaru odpadów za pomocą ręcznika papierowego, a następnie umieść je w worku na zagrożenie biologiczne w pojemniku na odpady biologiczne do utylizacji.
  4. Za pomocą cienkich kleszczy lub hemostatu dobrze chwyć tylną część głowy ryby. Mikronożycami przetnij krawędzie pyska w kierunku tyłu głowy i skrzeli (Rysunek 3).
  5. Powtarzam po drugiej stronie. Usuń żuwaczkę, a następnie dobrze wyczyść spód drugiej pary cienkich lub ultracienkich kleszczy.
    UWAGA: Podążaj za wewnętrznym konturem skrzeli.
  6. W tym momencie trzymaj mocno głowę ryby hemostatem lub przypij ją szpilką T do SP (jeśli używasz), ostrożnie przy czubku pyska.
  7. Odłącz oba oczy za pomocą ultracienkich kleszczy lub nożyczek. Włóż końcówkę w krawędź oka, a następnie delikatnie wyciągnij lub wytnij oko (rysunek 4).
    UWAGA: Nie dotyczy ryb jaskiniowych (zeskrobanie skóry z okolic oczu).
  8. Zadrap linię strzałkową na czubku głowy, która biegnie między oczami od przodu do tyłu i dzieli głowę na lewą i prawą. Następnie użyj mikronożyczek, aby płytko przeciąć linię (rysunek 5).
  9. Delikatnymi kleszczemi ostrożnie zacznij ciągnąć obie strony głowy, zwracając szczególną uwagę, by nie złamać mózgu pod spodem, który jest osadzony pod tkanką łączną. Gdy mózg stanie się widoczny, za pomocą końcówki supercienkich kleszczy odłącz mózg od czaszki (rysunek 6).
    1. Unikaj miażdżenia mózgu przez wyciąganie za pomocą kleszczy. Zamiast tego trzymaj go za tylną część mózgu lub rdzenia kręgowego, jeśli pozostałość pozostała, aby zachować integralność.
    2. Jeśli mózg nadal znajduje się po jednej stronie głowy, użyj ultracienkich kleszczy, aby ostrożnie odłączyć go od czaszki łóżka, delikatnie wkładając końcówki za mózg i delikatnie unosząc ją. Unikaj ciągnięcia przez cały czas, bo może to ją uszkodzić.
  10. Po usunięciu mózgu delikatnie czyść ultracienkimi kleszczami, eliminując tłuszcz i otaczające tkanki. Umieść w rurce mikrowirówki lub odpowiednim magazynie na potrzeby protokołu dalszego. W tym momencie zachowaj cały mózg lub zbierz jego podregiony (np. telencefalon, tektum optyczny, bulwy węchowe) (Rysunek 7).
  11. Izolacja telencefalonu: Aby wyjąć telencefalon, ściśnij u podstawy między telencefalonem a tektum wzrokowym ultra-cienkimi kleszczemi i oddziel telencefalon od reszty mózgu. Przenieś do odpowiedniej rury magazynowej.
  12. Jeśli używa się do metagenomiki, szybkie zamrażanie pobiera próbki w ciekłym azocie i przechowuje w temperaturze -80 °C. Zrób to, zanurzając rurkę mikrowirówki w ciekłym arze na 5 sekund.

Rysunek 1
Rysunek 1: Morfotypy Astyanax mexicanus . (a) Ryby powierzchniowe. (B) Pachón jaskiniowiec. Skala: 10 mm Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2
Rysunek 2: Odłączenie głowy. (A) Ryby powierzchniowe. (B) Ryba jaskiniowa Pachón Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3
Rysunek 3: Usunięcie szczęki z oderwanej głowy ryby. (A) Ryba powierzchniowa. (B) Ryba jaskiniowa Pachón Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4
Rysunek 4: Usunięcie oka z odłączonej głowy ryby. U jaskiniowców można przeprowadzić skrobanie tego obszaru, aby przerzedzić tkankę. (A) Ryby powierzchniowe. (B) Ryba jaskiniowa Pachón Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5
Rysunek 5: Strzałek przecięty górną część głowy ryby. (A) Ryba powierzchniowa. (B) Pachón jaskiniowiec. Pasek skali: 5 mm Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6
Rysunek 6: Rozdzielenie bocznych części głowy i odsłonięcie mózgu w jamie czaszki. (a) Ryby powierzchniowe. (B) Pachón jaskiniowiec. (C,D) Usunięcie mózgu z łożyska czaszki. Pasek skali: 5 mm Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 7
Rysunek 7: Anatomia mózgu regionalnego A. mexicanus . (A) Ryby powierzchniowe. (B) Pachón jaskiniowiec. Pasek skali: 5 mm Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Sekcja jelit u dorosłych ryb powierzchniowych i jaskiniowych

  1. Stosuj się do metody eutanazji opisanej powyżej.
  2. Osusz rybę chusteczką bez kłaczków, zanim położysz ją na czystym SP i przykryj zakraplaczem lodowatym 1 PBS (lub wodą systemową, w zależności od zastosowania poniżej), aby utrzymać wilgotność tkanek.
  3. Przymocuj ryby na SP (jeśli używasz) za pomocą szpilek T.
    1. Jeśli nie używasz SP, hemostat do mocnego chwytania z przodu od jamy ustnej podczas cięcia się sprawdzi. Włóż szpilkę z przodu w oczodoł (również dotyczy jaskini), upewniając się, że dotrze do SP.
    2. Z tyłu przypiąć przez ogon do płyty. Upewnij się, że ryba pozostaje nieruchoma podczas zabiegu.
      UWAGA: Jeśli wykonujesz sekcję żołądkowo-jelitową na tym samym okazie co sekcja mózgu, szybko odetnij głowę skalpelem przed rozpoczęciem sekcji i przypięciem ryby do powierzchni płytki. Wykonaj przednie ukośne cięcie za operkulum, które zachowuje górę głowy i omija jelita. Idealnie byłoby rozdzielić głowę i ciało i pozwolić dwóm doświadczonym rozbijaczom pracować na każdym dla efektywności czasu. Przedni szpilka może być umieszczona w najwyższej przedniej części ciała po dekapitacji, podczas gdy tylna sworzeń pozostaje w tym samym miejscu (Rysunek 8).
  4. Za pomocą mikronożyczek sekcyjnych przeciń skórę i mięśnie podłożne wzdłuż brzusznej linii środkowej od płetwy/odbytu odbytu w kierunku spłuczki (twardego okrycia skrzela) w półkolistym biegu wzdłuż spodu strony ryby (Rysunek 9).
  5. Usuń zapach i płetwę piersiową mikronożyczkami i cienkimi kleszczemi.
    UWAGA: Ten krok pomaga usprawnić usuwanie skóry, ale może spowolnić rozwarstwienie i być pomijany w zależności od potrzeb.
  6. Przetnij skórę i mięsień pod spodem od płetwy odbytowej, a następnie przetnij z przodu w kierunku skrzeli, wydłużając nacięcie brzuszne w razie potrzeby (Rysunek 10). To ostatecznie tworzy okno.
  7. Otwórz nacięcie za pomocą cienkich kleszczy, aby odsłonić jamę ciała. Użyj cienkich kleszczy, aby chwycić skórę i delikatnie ją unieść, by usunąć (Rysunek 11).
  8. Przetnij zarówno przednie, jak i tylne przyłączenia jelita i ostrożnie usuń wszystkie narządy wewnętrzne – usuń układ pokarmowy z organizmu i umieść go na czystym miejscu SP (lub jednorazowej, sterylizowanej szalce Petriego) (Rysunek 12 i Rysunek 13).
  9. Najpierw oddziel wątrobę od pozostałych narządów brzucha za pomocą ultracienkich kleszczy. Jeśli izolujesz wątrobę, umieść ją w rurce mikrowirówki lub zastosuj odpowiednią metodę przechowywania zgodnie z protokołem lub potrzebą. Ostrożnie rozciągnij jelita i zidentyfikuj części żołądka oraz jelita środkowego/tylnego (rysunek 14).
  10. Odłącz żołądek od jelita środkowego/tylnego.
  11. Trzymaj przednie i tylne końce jelita środkowego/tylnego cienkimi kleszczemi i delikatnie rozciągnij, aby wydłużyć je do całej długości.
  12. Zbieraj tkanki w rurce mikrowirówki i odpowiednio je przechowuj.
  13. Jeśli używa się do metagenomiki, szybkie zamrażanie pobiera próbki w ciekłym azocie i przechowuje w temperaturze -80 °C. Robi się to przez zanurzenie rurki mikrowirówki w ciekłym azocie na 5 sekund.

Rysunek 8
Rysunek 8: Umieszczenie szpilki do sekcji żołądkowo-jelitowej. (A) Ryby powierzchniowe. (B) Ryba jaskiniowa Pachón Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9
Rysunek 9: Cięcie od spodu do presekcji. (A) Ryby powierzchniowe. (B) Ryba jaskiniowa Pachón Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10
Rysunek 10: Usunięcie operkulum i utworzenie okna. (A) Ryby powierzchniowe. (B) Ryba jaskiniowa Pachón Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11
Rysunek 11: Usuwanie powierzchniowej skóry bocznej i mięśni. (A) Ryby powierzchniowe. (B) Ryba jaskiniowa Pachón Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12
Rysunek 12: Narządy in situ w jamie ciała dorosłej ryby po usunięciu mięśni i skóry. (A) Samica ryb powierzchniowych z odsłoniętą jamą brzuszną i usuniętymi jajami w celu odsłonięcia organów. (B) Samce ryb powierzchniowych z odsłoniętą jamą brzuszną i organami. (C) Samica jaskiniowca Pachón z odsłoniętą jamą brzuszną i usuniętymi jajami w celu odsłonięcia organów. (D) Samiec jaskiniowca Pachón z jamą brzuszną i organami. Czarne strzałki wskazują na obszar, w którym znajduje się pęczek pokarmowy (GA). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 13
Rysunek 13: Wiązka przewodu pokarmowego usunięta z jamy ciała ryby. (a) Ryba powierzchniowa. (B) Pachón jaskiniowiec. Skala: 10 mm Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 14
Rysunek 14: Izolowane narządy przewodu pokarmowego ryb powierzchniowych i jaskiniowych. (A) Ryby powierzchniowe. (B) Pachón jaskiniowiec. Skala: 10 mm Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z tym protokołem pobrano zawartość mózgu i jelit, a także zmierzono długość całego jelita, telencefalonu i tektum wzrokowego i porównano między morfotypami ryb powierzchniowych i jaskiniowych Pachón (Rysunek 15). Do porównań statystycznych wykorzystaliśmy testy t Welcha z niezależną próbą, z wielkością próby n = 6 ryb powierzchniowych i n = 6 ryb jaskiniowych Pachón. Ryby powierzchniowe miały znacznie większe wymiary stektum wzrokowego niż jaskiniowce pachón, zgodnie z wcześ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnące znaczenie A. mexicanus jako modelu badawczego w wielu dziedzinach, od ewolucji po biomedyczną neurobiologię i mikrobiologię, wymaga ustandaryzowanej metody sekcji i pobierania narządów. Chociaż izolowane struktury były wcześniej badane i dokumentowane, w tym tektum wzrokowy16,38, serce dorosłych11 i inne11,44, brakuje systematycznych wytycznych umożliwiających powt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma konfliktu interesów. Wszystkie procedury są zgodne z protokołem zatwierdzonym przez IACUC 2024-0004.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te są finansowane z grantu NIH 5R16EY037336-02, grantu RCMI U54 MD007600 oraz grantu NIH 1P20GM156713-01 (COBRE Portoryko Center for Microbiome Sciences).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zbiornik lęgowy danio pręgowanego o pojemności 1,0 litraTecniplasthttps://shop.tecniplastusa.com/products/1-0-liter-zebrafish-breeding-tankPrzygotować zawiesinę lodową eutanazji. Zbiornik jest do połowy wypełniany lodem, a następnie na wierzchu kładzie się perforowany zbiornik wewnętrzny. Następnie jest napełniany wodą aż na górę.
Lodowa misa poliuretanowa 4LUSA ScientificPozycja #2328-7242
Worki na odpady biologiczneFisherbrand14-828-244
Calbiochem OmniPur PBS 10x Koncentrat cieczy, klasa biologii molekularnej, sterylnyMilliporeSigma65074L
Mikroskop rozcinający Olympus SZ51Olympus OLSZ51NPS-LED/R
Kleszcze do rozcinania tkanekFisherbrand08-953G
Szpilki do sekcji, opakowanie 100Narzędzia do nauk domowychhttps://www.homesciencetools.com/product/dissection-pins-100-pack/?srsltid=AfmBOoofk8r6_hd4nx_7bjjP2
GzkNBlnOJ3vUKor5
rFCJvVxPN9xRlpc
Kleszcze, delikatne, bardzo cienkie, ostre końcówki;MOPECAB132
Kleszcze, chusteczka, delikatny, bardzo cienki czubekMOPECAB047
Hemostat, 12,5 cm, prostyInstrumenty World Precisionhttps://wpiinc.com/products/var-15920-halsted-mosquito-hemostatic-forceps
Kleszcze jubilerskie, Dumont nr 5MilliporeSigmahttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f6521
Kimwipes EX-LKimberly-Clark34155
Ciekły azotZapewniane przez instytucję
Noyes Micro Knives, 12 cmInstrumenty World Precision500228
Ręczniki papieroweZapewniane przez instytucję
Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką, 95 mm, 15 mm, okrągłeFisherbrandFB0875714G
Ostrza skalpela, #22, 10 opakNarzędzia do nauk domowychhttps://www.homesciencetools.com/product/scalpel-blades-22-10-pack/
Uchwyt skalpela #4Surtexhttps://surtex-instruments.com/product/scalpel-handle-no-4/
Nożyczki, Rozwarstwienie tęczówkiMOPECAA146
Nożyczki, Superfine MicroMOPECAA152
Standardowe jednorazowe pipety transferoweThermo Scientific13-711-9D
Sterylna mikrowirówka Eppendorfa 1,5 & mikro; Rurki LEppendorf05-402-25
Sylgard 184Nauki o mikroskopii elektronowej24236-10
Termo-FlaskLab-Line Instruments Inc.2119
Ultra Cienkie NożyczkiNEWMED InstrumentsNM-DI-206023
Woda odpowiednia do elektroforezy, PCRSigma-AldrichW4502-1L

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds. J Vis Exp. (139), e58366(2018).
  2. Örling, J., Kosonen, K., Villman, J., Reichard, M., Paatero, I. Impaired fin regeneration and angiogenesis in aged zebrafish and turquoise killifish. Biol Open. 12 (4), bio059622(2023).
  3. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Dev Methods Protoc. 1082, 197-214 (2014).
  4. Barbosa, A., et al. Western Blotting Assay for egr-1 Immediate Early Gene in Brain Tissue of Zebrafish Applied to Neuroethological Study. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  5. Corradi, L., Zaupa, M., Sawamiphak, S., Filosa, A. Using perk immunostaining to quantify neuronal activity induced by stress in zebrafish larvae. STAR Protoc. 3 (4), 101731(2022).
  6. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  7. Leigh, S. C., Nguyen-Phuc, B. -Q., German, D. P. The effects of protein and fiber content on gut structure and function in zebrafish (danio rerio). J Comp Physiol B. 188 (2), 237-253 (2018).
  8. Sassen, W. A., et al. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Dev Biol. 430 (1), 18-31 (2017).
  9. Jie, J., et al. Adult zebrafish intestine dissection: a technique to analyze compound absorption. J Vis Exp. (10), e20199(2023).
  10. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), e1717(2010).
  11. Baumann, D. P., Ingalls, A. Mexican Tetra (astyanax mexicanus): Biology, Husbandry, and Experimental Protocols. Laboratory Fish in Biomedical Research. , Academic Press. (2022).
  12. Gross, J. B., Meyer, B., Perkins, M. The rise of Astyanax cavefish. Dev Dyn. 244 (9), 1031-1038 (2015).
  13. Carlson, B. M., Gross, J. B. Characterization and comparison of activity profiles exhibited by the cave and surface morphotypes of the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 208, 114-129 (2018).
  14. Riddle, M., et al. Evolution of the Mexican cavefish gut microbiome. Curr Biol. 23, 01307(2023).
  15. Riddle, M. R., et al. Host evolution shapes gut microbiome composition in Astyanax mexicanus. Ecol Evol. 14 (4), e11192(2024).
  16. Jaggard, J. B., et al. Cavefish brain atlases reveal functional and anatomical convergence across independently evolved populations. Sci Adv. 6 (38), eaba3126(2020).
  17. Rodríguez-Morales, R. Sensing in the dark: constructive evolution of the lateral line system in blind populations of Astyanax mexicanus. Ecol Evol. 14 (4), e11286(2024).
  18. Rodriguez-Morales, R., et al. Convergence on reduced aggression through shared behavioral traits in multiple populations of Astyanax mexicanus. BMC Ecol Evol. 22 (1), 116(2022).
  19. Duboué, E. R., Borowsky, R. L., Keene, A. C. β-adrenergic signaling regulates evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Brain Behav Evol. 80 (4), 233-243 (2012).
  20. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biol. 13, 15(2015).
  21. Forberg, J. Temperature effects on the development of the axial skeleton and body shape in Astyanax mexicanus (teleostei: characidae) [Master's Thesis]. , College of Science and Health Theses and Dissertations. https://via.library.depaul.edu/csh_etd/514 (2022).
  22. Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
  23. Blackwell, B. R., et al. Effects of metformin and its metabolite guanylurea on fathead minnow (Pimephales promelas) reproduction. Environ Toxicol Chem. 41 (11), 2708-2720 (2022).
  24. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquat Toxicol. 78 (1), 91-102 (2006).
  25. Butler, J. M., Whitlow, S. M., Roberts, D. A., Maruska, K. P. Neural and behavioural correlates of repeated social defeat. Sci Rep. 8 (1), 6818(2018).
  26. Norton, W. H. J., Gutiérrez, H. C. The three-spined stickleback as a model for behavioural neuroscience. PLoS ONE. 14 (3), e0213320(2019).
  27. Espinasa, L., Jeffery, W. R. Conservation of retinal circadian rhythms during cavefish eye degeneration. Evol Dev. 8 (1), (2006).
  28. Jeffery, W., Ma, L., Parkhurst, A., Bilandzija, H. Pigment Regression and Albinism in Astyanax Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Academic Press, Elsevier. (2015).
  29. Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). J Exp Biol. 217 (Pt 6), 886-895 (2014).
  30. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line-dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Dev Biol. 441 (2), 328-337 (2018).
  31. Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Dev Biol. 441 (2), 297-304 (2018).
  32. Chin, J. S. R., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Dev Biol. 441 (2), 319-327 (2018).
  33. Kowalko, J. E., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Curr Biol. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  34. Espinasa, L., et al. Divergent evolutionary pathways for aggression and territoriality in Astyanax cavefish. Subterr Biol. 43, 169-183 (2022).
  35. Kowalko, J. Utilizing the blind cavefish Astyanax mexicanus to understand the genetic basis of behavioral evolution. J Exp Biol. 223 (Suppl_1), jeb208835(2020).
  36. Sekulovski, B., Miller, N. Mechanisms of social behaviour in the anti-social blind cavefish (Astyanax mexicanus). Proc Biol Sci. 292 (2043), 20250052(2025).
  37. Chin, J. S. R., et al. Analysis of stress responses in Astyanax larvae reveals heterogeneity among different populations. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 334 (7-8), 486-496 (2020).
  38. Kozol, R. A., et al. A brain-wide analysis maps structural evolution to distinct anatomical module. eLife. 12, e80777(2023).
  39. Ra, K., et al. Evolution of a central dopamine circuit underlies adaptation of light-evoked sensorimotor response in the blind cavefish, Astyanax mexicanus. bioRxiv. , (2024).
  40. Medley, J. K., et al. The metabolome of Mexican cavefish shows a convergent signature highlighting sugar, antioxidant, and ageing-related metabolites. eLife. 11, e74539(2022).
  41. Yen, S., Johnson, J. S. Metagenomics: a path to understanding the gut microbiome. Mamm Genome. 32 (4), 282-296 (2021).
  42. Marder, E. Marder lab website - Sylgard dishes. , https://sites.google.com/brandeis.edu/marder-lab/experimental-resources/sylgard-dishes (2026).
  43. Hallmaier-Wacker, L. K., Lueert, S., Roos, C., Knauf, S. The impact of storage buffer, DNA extraction method, and polymerase on microbial analysis. Sci Rep. 8, 6292(2018).
  44. Riddle, M. R., et al. Evolution of gastrointestinal tract morphology and plasticity in cave-adapted Mexican tetra, Astyanax mexicanus. bioRxiv. , (2020).
  45. Garduño-Sánchez, M., et al. Phylogeographic relationships and morphological evolution between cave and surface Astyanax mexicanus populations (de Filippi 1853) (actinopterygii, characidae). Mol Ecol. 32 (20), 5626-5644 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja m zguo jelitowo m zgowamikrobiota jelitowaadaptacja neuronalnamapowanie ca ego m zguewolucja por wnawcza
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły