Artykuł metodologiczny

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

DOI:

10.3791/70414

⸱

3 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for BioNanoengineering, Houston Methodist Research Institute, 2School of Medicine and Health Sciences, Tecnologico de Monterrey, 3Department of Applied Science and Technology, Politecnico di Torino, 4Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Houston Methodist Hospital, 6Department of Radiation Oncology, Houston Methodist Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysepki trzustkowe są niezbędne zarówno do klinicznego przeszczepiania wysepek, jak i badań przedklinicznych mających na celu zrozumienie mechanizmów i postępu cukrzycy. Jednak postęp w tych dziedzinach często ogranicza dostępność wysokiej jakości wysepek, ponieważ nowe strategie terapeutyczne wymagają większych, czystszych i bardziej ustandaryzowanych preparatów. W tym artykule przedstawiono wysokoprzepustowy, ustandaryzowany protokół dotyczący pobierania chirurgicznego, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysewek trzustkowych z poziomu gęstości szczurów Lewisa. Metoda łączy perfuzję trzustki wewnątrzprzewoźowej z określoną mieszanką enzymów, wspólnym trawieniem wielu trzustek oraz separacją opartą na gęstości, aby zmaksymalizować wydajność przy jednoczesnym minimalizowaniu fragmentacji i eliminacji konieczności rutynowego pobierania ręcznego. Wydajność wysepek jest ilościowa za pomocą dwóch komplementarnych podejść: tradycyjnej metody liczenia opartej na aliquotach, powszechnie stosowanej w warunkach klinicznych, oraz półautomatycznej metody obrazowania opartej na całkowitym przygotowaniu. W reprezentatywnej izolacji z 12 trzustek ręczne liczenie dało około 3 300 ekwiwalentów wysepek (IEQ) oraz 2 700 wysepek absolutnych na trzustkę (~39 600 łącznie IEQ), z rozkładem wielkości 62% (50-100 μm), 17% (100-150 μm), 10% (150-200 μm), 5% (200-250 μm) oraz 6% (>250 μm). Dla porównania, analiza automatyzacji całego przygotowania wykazała 16 350 łącznych IEQ (1 362 IEQ/trzustka), co podkreśla wrodzoną zmienność w ilościowości opartej na aliquotach. Preparaty miały czystość 98% dzięki barwieniu dithizonowym, a żywotność wysepek utrzymywano na poziomie 98% in vitro w dniach 3 i 7 po izolacji. Funkcjonalna ocena za pomocą statycznej wydzieliny insuliny stymulowanej glukozą wykazała 10-krotny wzrost uwalniania insuliny po 1-godzinnej stymulacji z 16,7 mM glukozy. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia powtarzalne i efektywne podejście do generowania preparatów wysepek o wysokiej czystości, funkcjonalnie nienaruszonych, które można użyć natychmiast bez konieczności dalszego czyszczenia. Wysepki zachowują solidną funkcję w hodowli do siedmiu dni, co umożliwia elastyczność przy dużych testach in vitro oraz przeszczepach in vivo .

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczep wysepek trzustkowych stanowi realną strategię przywrócenia endogennej produkcji insuliny u osób z cukrzycą typu 1 (T1D)1. Poza T1D, biologia wysepek jest coraz bardziej istotna dla cukrzycy typu 2 (T2D), schorzenia charakteryzującego się postępującą dysfunkcją i utratą β-komórek, a także dla pacjentów poddawanych częściowej lub całkowitej pankreatektomii z powodu przewlekłego zapalenia trzustki, guzów trzustki lub urazów urazowych. W tych kontekstach dostęp do wysokiej jakości wysepek jest niezbędny dla rozwoju terapii komórkowych, modelowania niewydolności β komórek, badania interakcji immunnych między wyspami a stromalami oraz opracowywania nowych metod regeneracyjnych2. W związku z tym solidne i powtarzalne procedury izolacji wysepek są kluczowe dla wspierania zarówno badań mechanistycznych, jak i rozwoju translacyjnego w szerokim zakresie zaburzeń endokrynologicznych trzustki.

Chociaż wysepki stanowią mniej niż 2% masy trzustki, odgrywają one nieproporcjonalnie istotną rolę w homeostazie glukozy. Ich wrodzona podatność na hipoksję, nadmierne trawienie enzymatyczne, stres oksydacyjny i ścinanie mechaniczne czyni je szczególnie wrażliwymi na urazy związane z izolacją 3,4,5. Nawet subtelne odchylenia w temperaturze, natlenieniu czy obsłudze tkanek mogą utrudnić sprzężenie bodziec-wydzielina β komórek lub wywołać apoptozę, ze względu na ograniczone mechanizmy obronne antyoksydacyjne i wysokie zapotrzebowanie metaboliczne 6,7. W związku z tym większość konwencjonalnych protokołów kładzie nacisk na szybkie użycie w dalszej fazie pobierania, zazwyczaj w ciągu 24-48 godzin od pobrania, zarówno w warunkach klinicznych, jak i eksperymentalnych 8,9,10,11,12. Chociaż ten model "natychmiastowego użycia" minimalizuje pogorszenie jakości, ogranicza elastyczność eksperymentalną, utrudnia badania podłużne i komplikuje wysiłki mające na celu zgromadzenie wystarczającej liczby wysepek do dużych testów in vitro lub eksperymentów in vivo transplantacji.

Wśród modeli gryzoni szczury Lewisa są szeroko wykorzystywane do badań nad wysepkami ze względu na ich genetyczne tło sprzyrodcze, stabilny profil odpornościowy oraz powtarzalne cechy fizjologiczne14. Różnice zależne od odkształcenia w wydajności, responsywności i odporności wysepek są dobrze udokumentowane. De Groot i in. wykazali, że wystraski szczurów Lewisa wykazują lepszą wydzielanie insuliny pobudzanej glukozą w porównaniu z innymi szczepami, podkreślając ich przydatność do badań funkcjonalnych, metabolicznych i transplantacyjnych15. Dodatkowe badania potwierdziły ich wiarygodność w badaniach immunologicznych i allo-/ksenotransplantacyjnych 14,15,16. Jednak w różnych laboratoriach zmienność wydajności, czystości i funkcji wysepek pozostaje istotną barierą. Duża część tej zmienności wynika z niespójności w mieszance enzymów, technikach perfuzji wewnątrzwodowej, obsłudze trzustki, czasie trawienia oraz strategii oczyszczania17.

Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy powtarzalny, krok po kroku protokół pobierania chirurgicznego, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych z szczurów Lewisa w gradiencie gęstości. Ten workflow jest zoptymalizowany, aby maksymalizować plonę, zminimalizować fragmentację i zachować funkcjonalną opłacalność. Co ważne, ustanawia jasne punkty odniesienia, w tym odpowiedniki wysepek (IEQ), żywotność w czasie, czystość oraz wydzielanie insuliny stymulowane glukozą, które pozwalają badaczom niezawodnie rozróżnić udane od nieoptymalnych izolacji 18,19,20. Poprzez poprawę zarówno wydajności, jak i długości życia, protokół zwiększa elastyczność eksperymentów i może zmniejszyć liczbę potrzebnych zwierząt dawców, wspierając bardziej etyczne i skalowalne projektowanie eksperymentów.

W odróżnieniu od wielu tradycyjnych metod, obecna metoda pokazuje, że wysepki szczurów Lewisa można utrzymywać w hodowli do 7 dni przy zachowaniu żywotności i funkcji, co zwiększa ich zastosowanie w długotrwałych badaniach in vitro . Protokół dodatkowo zawiera uproszczeniową, połączoną strategię przetwarzania zdolną do obsługi do 30 trzustek w jednej partii, umożliwiając równomierne trawienie i redukcję zmienności między próbkami. Przy czystości endokrynnej sięgającej 98%, procedura eliminuje potrzebę ręcznego zbierania i zmniejsza ryzyko skażenia mikroorganizmów. W porównaniu z metodami trawienia jednoetapowego lub masowego, które często prowadzą do powstania nieczystych lub mechanicznie uszkodzonych preparatów13, ten wysokoprzepustowy przepływ niezawodnie zapewnia dużą liczbę czystych, przeszczepowych wysetek odpowiednich do testów in vitro , profilowania metabolicznego oraz badań in vivo .

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Houston Methodist Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, protokół #IS00007362) i przeprowadzone zgodnie z National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals oraz Animal Welfare Act.
UWAGA: Materiały i instrumenty używane w całym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie przed zbiorem i dzień izolacji

  1. Przygotuj następujące roztwory w warunkach aseptycznych wewnątrz szafki bioasepcyjnej (patrz Tabela 1) i przechowuj wszystkie roztwory w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
    Roztwór do płukania penicylinowo-streptomycynowej (Pen-Strep).
    Środek do prania.
    Bufor chłodzący.
    Media kultury wysepek.
    Bufor Krebsa.
  2. Sterylizuj narzędzia i sprzęt za pomocą autoklawu.
    1. Pakiet chirurgiczny do pobierania trzustki z autoklawu: zasłony chirurgiczne, gazy, kleszcze z tkanki szczurzej, płaskie kleszcze, cienko zakrzywione, jedna nożyczka do skóry, nożyczki do mikrorozcinania, dwa małe hemostaty i jeden zakrzywiony hemostat.
      UWAGA: Autoklaw dwa pakiety chirurgiczne do pobierania trzustki, jeśli będą dwaj operatorzy chirurgiczni.
    2. Pakiet chirurgiczny do czyszczenia trzustki w autoklawie: cienko zakrzywione kleszcze i nożyczki do mikrorozcinania.
    3. Autoklaw jedną arkusz folii aluminiowej o wymiarach 30 cm x 30 cm.
    4. Zlewki autoklawu 1-6 600 mL i 1 L, w zależności od liczby trzustek do przetworzenia (patrz Tabela 2).
    5. Autoklaw, jedno sito 500 μm.
    6. Autoklaw dwie igły kręgosłupa po 14 G, na wypadek zatkania niestrawionej tkanki trzustki.
    7. Autoklaw jedną tubkę strzykawki na każdą potrzebną 50 ml strzykawki (patrz Tabela 3).
  3. Przygotuj kąpiel wodną do trawienia.
    1. Napełnij kąpiel wodną wyposażoną w orbitalny shaker autoklawową ultraczystą wodą, aż będzie 3/4 cala powyżej poziomu platformy.
    2. Dodaj 3 mL roztworu przeciwdrobnoustrojowego i trzymaj pokrywkę zamkniętą, aby zminimalizować zanieczyszczenie.

2. Przygotowania w dniu żniw i izolacji

  1. Przygotuj strzykawki gradientowe.
    1. Usuń roztwory gradientu wysepek o stężeniu 1,108 g/cm³, 1,096 g/cm³ oraz 1,069 g/cm³ przygotowanych i wykorzystanych w kolejnych etapach oraz kroku "Oczyszczenie wysepek" 5,2, z magazynowania 4 °C, i pozwól im wyrównać się do temperatury pokojowej (około 1 godziny).
      UWAGA: Wymagana objętość gradientu będzie się różnić w zależności od liczby trzustek do obróbki; odwołaj się do Tabeli 3 , aby zapewnić odpowiednie rozmrożone objętości wybranych gradientów.
    2. Wstępnie załaduj i oznacz strzykawki o pojemności 50 mL z gradientami 1,096 g/cm³ i 1,069 g/cm³.
      1. Energicznie mieszaj rozwiązania gradientu gęstości o gęstości 1,069 i 1,096 g/cm³.
      2. Załaduj odpowiednie objętości, w zależności od tabeli 3, do strzykawek 50 mL wyposażonych w rurki chirurgiczne i igłę 16 G.
      3. Po napełnieniu zakręć igły, aby zachować bezpłodność, i odłóż strzykawki na dalsze użycie w kroku "Oczyszczanie wysp" 5.5.
    3. Zachowaj gradient 1,108 g/cm 3 w temperaturze pokojowej do późniejszego użycia.
  2. Przygotuj enzym Working Disocation Media (WDM), załaduj do strzykawek do perfuzji i do zlewek autoklawow.
    1. Pracuj w warunkach sterylnych w szafce bioasekuracyjnej i utrzymuj wszystkie roztwory na lodzie.
    2. Rozmraź alikwoty kolagenazy, termolizyny i DNazy I w lodzie.
    3. Rozcieńcz odczynniki enzymów w sterylnej zlewce o pojemności 1 L za pomocą WDM, aby uzyskać następujące końcowe stężenia: kolagenaza 0,15 mg/mL, termolizyna 5 μg/mL oraz DNaza I 0,1 mg/mL (Tabela 2).
    4. Delikatnie mieszaj WDM, wykonując ruch wirujący 10 razy. Nie mieszaj pipetą; Zachowaj aktywność enzymów poprzez delikatne mieszanie.
    5. Jeden po drugim wkładaj 10 mL roztworu enzymu WDM do każdej strzykawki 10 mL za pomocą igły 16 g do szybkiego napełniania, a następnie zamień na zakapkowaną igłę o wymiarach 25 G x 1/2" cala do późniejszego przelewu trzustki.
    6. Owij strzykawki z załadowaną folią aluminiową i umieść na lodzie do czasu użycia.
    7. Nadmiar WDM należy równomiernie wydać do sterylnych zlewek 600 mL, aby przechowywać zebrane trzustki zgodnie z Tabelą 2. Każdą zlewkę przykryj sterylną folią aluminiową i trzymaj na lodzie (Tabela 2).
  3. Przygotuj miejsce pracy hodowli komórkowych.
    1. Włącz orbitalny shaker do kąpieli wodnej, ustaw na 130 obr./min i 37 °C. Pozostaw taki podczas pobierania trzustki.
    2. Umieść te przedmioty pod światłem UV w szafce bezpieczeństwa biologicznego na 1 godzinę w celu dalszej sterylizacji.
      Sterylne sito 500 μm.
      Sterylna zlewka 1 L.
      Pompa strzykawkowa.
    3. Upewnij się, że inkubator hodowli komórkowej jest ustawiony na 25 °C, 5%CO2.
    4. Ustaw wirówkę na 4 °C, z przyspieszeniem i zwolnieniem na poziomie 9.
  4. Zbierz materiały do pobrania i udaj się na salę operacyjną.
    1. Wyznaczony środek do czyszczenia trzustki:
      1. Zbierz jedno duże wiadro na lód, aby pomieścić wymaganą liczbę zlewek WDM o pojemności 600 mL oraz roztwór do płukania trzustki (patrz Tabela 1 i Tabela 2).
      2. Zbierz 1 sterylną miskę Petriego na każde 6 trzustek do przetworzenia.
      3. Zbierz 1 sterylne nożyczki do mikro-sekcji i 2 małe, zakrzywione, delikatne kleszcze.
    2. Wyznaczony zbieracz trzustki:
      1. Zbierz sterylny zestaw chirurgiczny.
      2. Zbierzcie sterylne rękawiczki chirurgiczne.
      3. Zbierz tackę na lód z wstępnie naładowanymi strzykawkami WDM 10 mL zamkniętymi w autoklawowanej folii aluminiowej.
  5. Na sali operacyjnej przygotuj stację pobierania trzustki.
    1. Włącz sterylizator szklanych kulek, aby sterylizować narzędzia chirurgiczne, zanurzając je na 1 minutę między każdym zwierzęciem. Instrumenty mogą być szybko chłodzone przez zanurzenie w sterylnym 1x PBS.
    2. Pod kątem widzenia mikroskopu umieść chłonną podkładkę na wyciek krwi lub roztwór enzymu WDM.
    3. Ustaw mikroskop na całkowite powiększenie 6,3x między soczewką oczniczą a obiektywem.
    4. Otwórz opakowanie chirurgiczne i załóż sterylne rękawice chirurgiczne za pomocą techniki aseptycznej.
    5. Przystąpić do chirurgicznego pobierania brań.
  6. Na sali operacyjnej przygotuj stanowisko czyszczenia trzustki.
    1. Wlej tyle roztworu Pen-Strep, aby wypełnić połowę 100 mm szalki Petriego (około 6 mL), zanurzyć odizolowane trzustki i umieścić na lodzie.
    2. Otwórz opakowanie chirurgiczne i załóż sterylne rękawice chirurgiczne za pomocą techniki aseptycznej.
  7. Na sali operacyjnej przygotuj komorę eutanazyjną.
    1. Umieść tacki z zbiornikami do pustej, czystej i ponownie zamykalnej klatki dla szczurów.
    2. Napełnij tacki do połowy izofluranem.
    3. Umieść perforowaną tacę na zbiornikach, aby zapobiec rozlaniu się, gdy szczury są umieszczane w środku.
    4. Zamknij górę komory pokrywą klatki.
  8. Przejdź do pobierania trzustki.

3. Zbieranie trzustki

  1. Wkładaj szczury pojedynczo do komory eutanazji na tacy na szybkie przedawkowanie izofluranu.
    UWAGA: Czas eutanazji potrzebny szczurowi będzie się różnić, zwłaszcza gdy izofluran odparowuje.
  2. Potwierdź brak pulsu i oddychania u każdego szczura.
  3. Potwierdź eutanazję metodą wtórną, która nie zakłóca jamy brzusznej (np. nakłucie serca).
    UWAGA: Inne podstawowe metody eutanazji są akceptowalne; Jednak preferowane jest przedawkowanie izofluranu, ponieważ szybka eutanazja minimalizuje hipoksję wysepek.
  4. Spryskaj sierść każdego szczura na brzuchu 70% etanolem, aby sklejać i zapobiec luźnym włosom na polu chirurgicznym.
  5. Ułóż uśpionego szczura na plecach pod mikroskopem z głową oddaloną od operatora. Upewnij się, że górna jama brzuszna znajduje się pod kątem mikroskopu.

Rysunek 1
Rysunek 1: Ekspozycja chirurgiczna i śródprzewodowa perfuzja trzustki szczura. Ilustracja kluczowych etapów ekspozycji trzustki i perfuzji przez zwieracz Oddiego. (A) Uśpiony szczur Lewisa z otwartą jamą brzuszną. (Aa) Umieszczenie klamry w przewodzie żółciowym i żyłie wątrobowej. (B) Powiększony widok dwunastnicy pokazujący hemostaty oznaczające obszar zwieracza Oddiego. (Bb) Igła perfuzji umieszczona w głównym przewodzie trzustkowym. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

  1. Pobieranie trzustki (rola zbieracza trzustki):
    1. Wykonaj nacięcie w kształcie litery V, używając nożyczek skórnych, zaczynając od styki łonowej w kierunku każdej bocznej klatki piersiowej, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej (patrz Rysunek 1A).
    2. Przesuń jelito cienkie i grube na lewą stronę zwierzęcia, używając płaskich kleszczy, aby oczyścić "przestrzeń roboczą" jamy brzusznej.
    3. Rozwiń dwunastnicę za pomocą płaskich kleszczy i zakrzywionych hemostatów. Upewnij się, że wspólny przewód żółciowy i żyła wrotna wątroby znajdują się w polu widzenia mikroskopu.
    4. Cofnij głowę wątroby i zaciskaj wspólny przewód żółciowy oraz żyłę wątrobową za pomocą zakrzywionych hemostatów. Zacisk 1-2 mm od wątroby (patrz Rysunek 1Aa).
      UWAGA: Kroki 3.6.1-3.6.4 i 3.6.8 można wykonać poprzez bezpośrednią wizualizację. Do wszystkich innych kroków używaj mikroskopu, aby zapewnić delikatną manipulację tkanką.
    5. Pod kątem mikroskopu, używając płaskich kleszczy i płaskich hemostatów, delikatnie mobilizuj zawartość dwunastnicy, aby oczyścić zwieracz Oddiego.
      UWAGA: Upewnij się, że zawartość dwunastnicy jest przesunięta z miejsca zamierzonego wkłucia igły.
    6. Wyizoluj obszar otaczający zwieracz Oddiego, delikatnie zaciskając dwunastnicę płaskimi hemostatami około 5 mm od każdej strony zwieracza. Zapewnij minimalne uciskanie, aby zachować integralność tkanek (patrz Rysunek 1B).
    7. Używając sterylnej strzykawki WDM, ostrożnie włóż igłę przez ścianę dwunastnicy, przeprowadź ją przez zwieracz Oddiego i wejdź do głównego przewodu trzustkowego w celu perfuzji (patrz Rysunek 1Bb).
      1. Gdy igła przechodzi przez zwieracz Oddiego, utrzymując stałe ciśnienie, przekręć 7-10 mL WDM do trzustki z tempem około 500 μL/s, aż trzustka stanie się całkowicie rozdęta.
        UWAGA: Upewnij się, że faza jest uniesiona, a igła równoległa do przewodu trzustkowego, aby zminimalizować uraz. Rozpocznij wstrzykiwanie natychmiast po założeniu. To pomoże rozszerzyć zwieracz i przewod, ułatwiając przesuwanie igły. Trzustka uważana jest za całkowicie rozdętą, gdy ogon trzustki, położony blisko śledziony, staje się widocznie przełęczony.
    8. Wyciąć trzustkę, delikatnie uwalniając ją od otaczających struktur w następującej kolejności: śledziona, żołądek, jelito grube, dwunastnica i krezka.
      UWAGA: Stosuj tępe sekcje, aby zminimalizować uszkodzenia tkanek. Postępuj kolejno, aby zachować orientację anatomiczną i zmniejszyć napięcie na połączeniach naczyniowych i przewodowych.
      1. Usuń oba płaskie hemostaty z dwunastnicy.
      2. Użyj płaskich kleszczy, aby zacisnąć więzadło splenopankreastyczne (łączące trzustkę i śledzionę) i delikatnie naciągać.
      3. Za pomocą cienkich, zakrzywionych wycinków ostrożnie uruchom i oddziel trzustkę od sąsiednich przystawów śledziony.
      4. Odłącz trzustkę od żołądka, podnosząc tkankę trzustkową za pomocą cienkich, zakrzywionych kleszczy i delikatnie kontratrciągując płaskimi kleszczami.
      5. Następnie, używając kleszczy płaskich, zastosuj mocne napięcie, aby usunąć jelito grube z trzustki.
      6. Unieś jelito cienkie za pomocą płaskich kleszczy i rozdzielić krezkę od trzustki za pomocą cienkich, zakrzywionych kleszczy.
      7. Delikatnie podnieś przeparłą trzustkę płaskimi kleszczemi i użyj drobnych nożyczek do cięcia, aby odciąć pozostałe przyczepy do tkanki łącznej.
    9. Natychmiast przełóż wyciętą trzustkę do szalki Petriego z lodowatym roztworem do płukania i natychmiast przystąpi do pobrania kolejnej trzustki, gdy środek czyszczący trzustkę rozpocznie jej czyszczenie.
  2. Oczyść trzustkę (rola czyszcząca):

Rysunek 2
Rysunek 2: Czyszczenie przeperfuzowanej trzustki szczura. Sekwencyjna wizualizacja trzustki przed i po usunięciu nieistotnej tkanki. (A) Przekroczona trzustka bezpośrednio po rozwarstwieniu, z widoczną sąsiednią tkanką tłuszczową, węzłami chłonnymi i strukturami łącznymi. (B) Perfuzowana trzustka z głównymi punktami anatomicznymi oznaczonymi. (C) Oczyszczona trzustka po usunięciu nadmiaru tkanek, ukazując ostateczny wygląd przed trawieniem. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

  1. Użyj cienkich, zakrzywionych kleszczy i drobnych nożyczek do rozcinania, aby ostrożnie odciąć węzły chłonne, tkankę tłuszczową, krezki oraz duże naczynia z przekroczonej trzustki, jeśli są obecne (patrz Rysunek 2).
  2. Przenieś oczyszczoną trzustkę do sterylnej zlewki 600 mL zawierającej 25 ml zimnego WDM. Przykryj zlewkę sterylną folią aluminiową, aby zachować czystość między transferem z miejsca pracy chirurgicznego do miejsca pracy do hodowli komórek.
    1. Wymieniaj płyn do płukania w szalce Petriego co 6 trzustek, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
    2. Zarejestruj moment, w którym pierwsza trzustka zostaje umieszczona w lodzie. To będzie używane do dokumentowania czasu zimnej niedokrwienia.
  1. Gdy wszystkie trzustki zostaną zdobyte i oczyszczone, szybko przejdź do fazy trawienia w miejscu pracy hodowli komórkowych.

4. Trawienie trzustki

  1. Zatrzymaj obroty orbitalnych shakerów i zabezpiecz zakrytą zlewkę zawierającą trzustki w wyznaczonych uchwytach kąpieli wodnej.
  2. Szybko ponownie uruchom orbitalny shaker ustawiony na 130 obr./min i rozpocznij 10-minutowy timer na czas trawienia (patrz rysunek 3A).
    UWAGA: Zanotuj ten punkt jako koniec okresu zimnej niedokrwienności. Zapisz każdą wysepkę z odpowiadającym jej całkowitym czasem zimnej niedokrwi w dokumentacji laboratoryjnej.
  3. Po 5 minutach ręcznie kręć zlewką zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie przeciwnie, aby ułatwić dysocjację tkanek.
  4. Po 8 minutach wyjmij roztwór hartujący z chłodniczy i przenieś go do szafy bezpieczeństwa biologicznego do natychmiastowego użycia (patrz Tabela 1).
  5. Po 10 minutach szybko przenieś i zanurz zlewki w lodzie, aby spowolnić aktywność enzymów (patrz Rysunek 3B).
    UWAGA: Od tego momentu obsługuj wszystkie tkanki, komórki i roztwory na lodzie, aby zachować je do kroku 4.20 przy użyciu gradientów gęstości w temperaturze pokojowej.
  6. Przenieś zewnętrzną część zlewki i tackę do szafki zabezpieczeń biologicznych.
  7. Dodaj bufor hartujący w stosunku 1:1 do roztworu w zlewce, aby zatrzymać trawienie (około 75-100 mL na zlewkę).
  8. Delikatnie i wielokrotnie aspiruj i wydalaj zawiesinę tkankową, używając strzykawki 50 mL wyposażonej w igłę rdzeniową 14 G, aby rozdzielić duże fragmenty tkanek (patrz Rysunek 3C).
  9. Przenieś zawieszenie do stożkowych rur o pojemności 200 mL.
  10. Przepłucz zlewkę 5 mL medium do mycia i przelewaj do stożkowej rurki o pojemności 200 mL zawierającej trawienie wysepki, aby zebrać pozostałe trawienie.
  11. Wirówka trawi się w 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dla bezpieczeństwa należy stosować odpowiednie adaptery i poduszki do butelek do wirówki.
  12. Ostrożnie przelej supernatant i ponownie zawiesij granulat w 100 mL medium do mycia, używając tej samej igły rdzeniowej 14 g co wcześniej.
  13. Przefiltruj zawiesinę przez sterylne sito o temperaturze 500 μm, umieszczone nad sterylnym zlewem 600 mL, aby usunąć duże, niestrawione tkanki.
    UWAGA: Jeśli perfuzja i czyszczenie trzustki były przeprowadzane optymalnie, na sicie nie pozostałaby minimalna ilość tkanki tłuszczowej i żadna nieprzepuszczona trzustka.
  14. Przepłukaj sito 10 ml środka do mycia, aby odzyskać uwięzioną tkankę.
  15. Przelej filtrat do nowych stożkowych rurek o pojemności 200 mL.
  16. Wirówka w 200 × g przez 5 minut w 4 °C.
  17. Przelej supernatant i ponownie zawiesij granulek w medium do mycia o pojemności 100 mL, używając pipety serologicznej o pojemności 10 mL.
    UWAGA: Zabezpiecz minimalną utratę komórek, wstępnie zwilżając końcówki pipety buforem zawierającym FBS przed ekspozycją na wysepki.
  18. Wirować w 600 × g przez 5 minut w 4 °C.
  19. Ostrożnie zasysaj supernatant, aby uzyskać suchy pellet.
  20. Ustaw temperaturę wirówki na 22 °C, przygotowując się do separacji gradientowej.
    UWAGA: Można to przyspieszyć, pracując wirówkę w 2000 x g przez 15 minut w 22 °C, bez pobierania próbek.

5. Oczyszczanie wysepek

  1. Sprawdź Tabelę 3 , aby określić liczbę potrzebnych 50 mL stożkowych lamp.
    UWAGA: Należy odnieść się do Tabeli 3 , aby równomiernie rozłożyć całkowitą objętość pelletu, zapewniając, że około 2-3 mL trawienia granulatu jest podzielone na każdą rurkę gradientową. Jeśli później zauważymy słabe rozdzielenie pasm wysepek, użyj dodatkowych rur gradientowych, aby zwiększyć rozdzielczość separacji.
  2. Wstępnie zwilż 10 mL serologiczną końcówkę pipety roztworem gradientu gęstości 1,108 g/cm³, aby zapobiec przyleganiu wysewek do wewnętrznej powierzchni końcówki.
  3. Każdą granulkę tkankową ponownie zawiesz w 15 mL roztworu gradientowego o pojemności 1,108 g/cm³ na każde 2 mL objętości granulatu, używając wcześniej zwilżonej pipety serologicznej o pojemności 10 mL. Pomimo całkowitej objętości przekraczającej 10 mL, mniejsza szerokość pipety umożliwia bardziej kontrolowane mieszanie i efektywną dysocjację granulek. Delikatnie mieszać, aż ujednolic.
  4. Ostrożnie podawaj 15 mL zawiesiny ogniwa na dno każdej stożkowej rurki o pojemności 50 mL, unikając kontaktu ze ściankami rurki, aby zapewnić czysty poziom gradientu.
  5. Korzystając z wstępnie załadowanych strzykawek gradientowych, nakładaj kolejno 10 mL gradientu 1,096 g/cm³, a następnie 10 mL gradientu 1,069 g/cm³.
  6. Każdy gradient podawaj w tempie 5 mL/min za pomocą pompki strzykawkowej, ustawiając końcówkę igły 16 G przy wewnętrznej ścianie rurki, aby zapobiec mieszaniu gradientów.
  7. Wiruj rurki w 700 × g przez 15 minut w 22 °C, z przyspieszeniem wirówki ustawionym na 3 i hamowaniem na 0, aby zapobiec mieszaniu gradientowemu.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę wydłużony czas zwalniania, cały cykl wirowania trwa około 45 minut. Należy uważnie monitorować czas, ponieważ wysepki muszą być zbierane szybko, aby zapobiec mieszaniu się gradientów i potencjalnemu uszkodzeniu komórek. W razie potrzeby przygotuj rury przeciwwagi według wagi, a nie objętości, aby uwzględnić różnice gęstości. Po wyjęciu rurek zresetuj wirówkę do 4 °C, a przyspieszenie i zwolnienie do 9 na kolejne etapy.
  8. Po wirowaniu zidentyfikuj warstwę wysepek znajdującą się na styku warstw gradientowych o wymiarach 1,069-1,096 g/cm³ a 1,096-1,108 g/cm³ (patrz Rysunek 3D).
  9. Ostrożnie aspiruj i wyrzuć wszelkie tkanki zebrane na wierzchniej warstwie, używając pipety Pasteura wstępnie zwilżonej środkiem do mycia.
  10. Zwilż kolejną pipetę Pasteura, pobierz warstwę wysepki i przelej ją do wcześniej schłodzonej stożkowej rurki o pojemności 200 mL zawierającej 5 mL medium do płukania.
  11. Zwiększ objętość stożkowej rurki o pojemności 200 mL do 200 mL z medium do mycia.
  12. Wirówka na 600 × g przez 5 minut i przelewa supernatant.
  13. Ponownie zawiesij granulek w 30 mL medium do mycia za pomocą wstępnie zwilżonej serologicznej końcówki serologicznej 10 mL.
  14. Przenieś zawiesinę do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mL za pomocą wstępnie zwilżonej 10 mL końcówki serologicznej dla lepszego osadzenia wysepek.
  15. Przepłukaj tę samą stożkową tubkę o pojemności 200 mL 20 mL medium do mycia i przelej do stożkowej rurki 50 mL zawierającej pozostałe wysepki.
  16. Wiruj 50 mL stożkowy z wysepkami i medium do mycia w dawce 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  17. Przelej supernatant i ponownie zawiesij pellet wysepek w 50 mL podłoża hodowlanego wysepek (patrz Tabela 1).
    UWAGA: Usuń 100 μL aliquotów podczas tego etapu, jeśli liczysz wysepki metodą ręcznej ilościowej.
  18. Równomiernie nakładaj wysepki na naczynia Petriego, które nie są objęte hodowlą tkankową, używając jednej płyty na każde pięć przetworzonych trzustek szczura Lewisa.
    1. Oblicz całkowitą objętość medium wysewkowego według wzoru (liczba trzustek ÷ 5 × 10 mL).
    2. Ponownie zawiesij pellet wysewki w połowie obliczonej objętości medium, a następnie równomiernie rozłóż zawieszenie na ustaloną liczbę płyt.
    3. Przepłukaj stożkową rurkę 50 mL zawierającą resztkowe wysewki pozostałą połową obliczonego medium i pipetuj tę rurkę na tych samych płytach, aby uzyskać ostateczną objętość 10 mL na miskę (patrz Rysunek 3E).
  19. Inkubuj przez noc w temperaturze 25 °C w 5% CO₂. Co 24 godziny dodaj 3 mL podłoża do kultury wysepek na bok każdej szalki Petriego, a następnie delikatnie mieszaj, aby uzupełnić podłoże.
  20. Przejdź do liczenia wysepek (krok 6).

Rysunek 3
Rysunek 3: trawienie trzustki i oczyszczanie izolowanych wysepek. Reprezentatywne obrazy kolejnych etapów od trawienia trzustki w zbiorach do oczyszczania wysepek. (A) Zebrane przetłuszczone trzustki przed trawieniem enzymatycznym. (B) Fragmentowane trzustki ulegają trawieniu enzymatycznemu. (C) Jednolita zawieszka tkankowa, pomechaniczna. (D) Rurki gradientowe gęstości przed wirowaniem (po lewej) i po wirowaniu (po prawej), z widocznym pasmem wysepek na granicy gradientu zaznaczonym kółkiem. (E) Obraz jasnego pola wysepek dnia 0 bezpośrednio po zebraniu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

6. Liczenie wysepek

  1. Zbieraj ręczną ilościową ilościową wysewkę.
    1. W kroku 5.16 wyjmij trzy alikwoty 100 μL z zawieszenia wysepek za pomocą pipety 200 μL i standardowych końcówek 200 μL.
      UWAGA: Upewnij się, że wysepki są równomiernie zawieszone w ośrodku poprzez mieszanie pipet, gdy pobierane są aliquoty do pomiaru.
    2. Przenieś każdą aliquotę do własnej 2 mm × siatkowej szalki Petriego, zawierającej 1 mL 1× PBS.
    3. Licz wysepki pod mikroskopem odwróconym, katalogując je według średnicy za pomocą wkładki do okularu na retikule.
      UWAGA: Nie wszystkie wysepki będą okrągłe; Przestrzegaj poziomych lub pionowych pomiarów podczas liczenia.
    4. Oblicz łączną liczbę ekwiwalentów wysepek o długości 150 μm, korzystając ze standaryzowanej tabeli konwersji (patrz Tabela 4).
      UWAGA: Porównaj IEQ każdej próbki. Jeśli IEQ aliquotów różni się o więcej niż 30%, należy stosować średnią najbardziej podobnych aliquotów.

7. Środki bezpieczeństwa

  1. Wszystkie zabiegi chirurgiczne i związane z tkankami wykonuj w warunkach aseptycznych wewnątrz szafki zabezpieczeń biologicznych, jeśli jest to stosowne. Używaj środków ochrony osobistej (PPE), w tym gogli ochronnych, fartuchów laboratoryjnych, rękawiczek i masek chirurgicznych, podczas obsługi odczynników i tkanek.
  2. Wykonuj pobieranie trzustki w warunkach sterylnych, z odpowiednimi narzędziami chirurgicznymi i OOP. Należy stosować izofluran i inne środki znieczulające zgodnie z wytycznymi instytucji, aby zapobiec narażeniu na wdech.
  3. Utylizacja tkanek zwierzęcych, ostrych przedmiotów i odpadów biologicznych zgodnie z procedurami instytucjonalnego bezpieczeństwa biologicznego. Utrzymuj odczynniki enzymatyczne i materiały biologiczne na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej, aby zachować aktywność i żywotność.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższe wyniki reprezentują typową izolację wysepek wykonaną opisaną metodą, z dwunastoma trzustkami szczura Lewisa przetwarzanymi równolegle.

Wydajność i rozkład wielkości

Ręczne liczenie aliquotów i konwersja IEQ

Z mieszanej zawiesiny wysepek uzyskano dwa niezależne aliquoty o pojemności 100 μL, jak opisano w sekcji "Liczenie wysepek", krok 6.1, i liczone według pojemników o średnicy (50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm, 250-300 μm). Liczenia zostały przeliczone na odpowiedniki wysepek (IEQ; odniesienie 150 μm) za pomocą standardowych tabel równoważności i ekstrapolowane do całkowitej objętości zawieszenia (patrz Rysunek 4A). W całej izolacji testowej (n = 12) wydajność wynosiła 3330 IEQ na trzustkę z medianą średnicy wysepek w pojemniku 50-100 μm. Powtórzenie alikwotów uzgodniło się z 18,8% na pojemnik (współczynnik zmienności), co wskazuje na umiarkowaną zmienność, ale oczekiwaną przy użyciu ręcznych metod liczenia. W ciągu poprzednich 14 izolacji wysepek metoda ta dała średnio 1353 (SD 607) IEQ na trzustkę.

Automatyczna ilościfikacja całej płyty

Aby sprawdzić ręczne IEQ, zdjęcia w jasnym polu były wykonywane w D1 za pomocą mikroskopu i zszywane, aby uzyskać kompozyty całokomórkowe (4× obiektywu; ekspozycja 1/100 s). Automatyczne rozmiarowanie i kwantyfikacja obiektów wykonywano przy użyciu Fiji i kodowania z predefiniowanym progiem rozmiaru 50-600 μm. Obrazy były najpierw wstępnie przetwarzane, aby zmniejszyć zmienność tła i poprawić jednolitość kontrastu. Struktury wysepek zostały zidentyfikowane na podstawie różnic intensywności względem otaczających tkanek, co generowało maski obiektów binarnych. Przylegające lub częściowo stykające się wysepki zostały oddzielone, aby uniknąć niedoszacowania liczby obiektów. Obiekty spoza określonego zakresu rozmiarów zostały wykluczone w celu usunięcia zanieczyszczeń i tkanki niebędącej wyspami. Dla każdego zachowanego obiektu wyodrębniano parametry morfometryczne, w tym powierzchnię oraz średnice osi x i y. Wysepki były następnie segregowane według średnicy, a IEQ obliczano przez mnożenie liczby wysepek w każdym pojemniku przez odpowiadający im współczynnik konwersji. Automatyczne rozmiarowanie dało łącznie 98 832 obiekty, o średnich średnicach osi x i y odpowiednio 117 μm i 116 μm, oraz szacunkowo 16 350 IEQ, co silnie koreluje z ręcznym IEQ mierzonym na D0 (Spearman r = 0,937, p = 0,0048; patrz rysunek 4A-C).

Zrzucanie komórek wysepek

Obrazy całej płyty zostały wykonane 2 godziny po oczyszczeniu i ponownie w dniu 1 (D1), stosując tę samą metodologię w "Automatycznej kwantyfikacji całej płyty" do oceny wczesnej stabilizacji wysepek ("zrzucania"). Liczba obiektów zmieniła się o 0,9%, a IEQ o -6,11% z 2 h do D1 (patrz Rysunek 4D). Porównanie średnic wysepek między D0 a D1 wykazało statystycznie istotny spadek mediany o 2 μm (test rangi znakowej Wilcoxona, p = 0,0136, n = 2820). Jednak niewielka skala tej zmiany raczej nie będzie miała znaczenia biologicznego ani klinicznego.

Rysunek 4
Rysunek 4: Ilościowa ocena rozkładu wielkości wysepek, korelacji i wczesnego wypadania wysepek. Graficzne podsumowanie pomiarów wysepek uzyskanych za pomocą analiz ręcznych i automatycznych. (A) Rozkład wielkości wysepek dzień 0 (D0) oparty na ręcznej ilościowości na ustandaryzowanych pojemnikach wielkości wysepek równoważnych IEQ. (B) Rozkład wielkości wysepek w dniu 1 (D1) określony przez zautomatyzowane pomiary obrazowe w tych samych standaryzowanych pojemnikach rozmiarów IEQ. (C) Korelacja liczebności między ręczną ilością D0 a automatyczną ilościową D1 w pojemnikach wielkości IEQ. (D) Wykres pudełkowy rozkładu średnic wysepek między D0 a D1 do automatycznych pomiarów tej samej płyty. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Czystość (zawartość endokrynna vs. egzokryna)

Barwienie Dithizone (DTZ)

Na D1 aliquot wysepek (n = 451) był barwiony DTZ przez 30 sekund w temperaturze pokojowej i natychmiast obrazowany za pomocą mikroskopii jasnego pola (4× obiektywnie; ekspozycja 1/20 s). Na Fidżi piksele tła zostały usunięte tak, aby pozostały obszar pikseli odpowiadał całkowitej powierzchni wysepek. DTZ-ujemne obszary tkanki egzokrynologicznej, rozpoznawane przez ciemniejszy kontrast kolorów, były ręcznie wybierane za pomocą narzędzia lasso, a obszar każdego interesującego obszaru był automatycznie rejestrowany w pikselach. Czystość endokrynologiczna została obliczona jako procent pikseli DTZ-dodatnich względem całkowitej liczby pikseli wysepek, co daje czystość 98,56 ± 0,38% (Rysunek 5A).

Opłacalność i wydajność funkcjonalna

Wydzielanie insuliny stymulowane glukozą (GSIS)

W każdym punkcie czasowym (D1, D3, D7) ręcznie wybierano 15 wysew o dopasowanym rozmiarze, które umieszczano w pojedynczych dołkach z płytą 24-dołową, przygotowanymi w formie czterokrotnej. Wysepki były inkubowane w temperaturze 37 °C 5%CO2 w buforze Krebsa według protokołu niskiej-wysokiej i niskiej glukozy: najpierw przy niskiej glukozie (2,8 mM, 60 min), następnie przy wysokiej glukozie (16,7 mM, 60 min, patrz Tabela 1). Frakcje ścieków pobierano na koniec każdego okresu inkubacji, a stężenia insuliny określano za pomocą testu ELISA insuliny u szczurów. Indeksy stymulacji obliczono jako stosunek wydzielania insuliny podczas warunków wysokiego do niskiego poziomu glukozy. Indeksy stymulacji wynosiły 9,37, 8,34 i 6,7 odpowiednio w dniach 1, 3 i 7, bez istotnych różnic (Rysunek 5B).

Barwienie żywe/martwe

W D1, D3 i D7 15 wysepków zostało ręcznie wybranych i barwionych zestawem Live/Dead zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko wysepki były inkubowane w roztworze barwienia Live/Dead przez 30 minut w temperaturze 25 °C, a następnie obrazowane pod stałymi ustawieniami mikroskopu, aby zapewnić porównywalność w punktach czasowych (obiektyw 4X; ekspozycja 1/30 s, filtry Texas Red i GFP). Żywotność była ilościowo określana za pomocą skryptu Pythona wykorzystującego obraz scikit do segmentacji wysepek i pomiaru fluorescencji. Wysepki zidentyfikowano przez połączenie zielonego i czerwonego kanału fluorescencji, zastosowanie metody progowania Li do wygenerowania maski binarnej oraz segmentację zlewni do oddzielenia stykających się wysepek. Obiekty były filtrowane według powierzchni, aby wykluczyć szczątki i artefakty. Dla każdej wysepki obliczano żywotność jako procent żywej zintegrowanej gęstości (zielone piksele) w stosunku do całkowitej gęstości zintegrowanej (zielone plus czerwone piksele). Wyniki wykazały żywotność 68 ± 9% przy D1, 98,2 ± 0,6% przy D3 oraz 100% przy D7. Próbka kontrolna z dodatnim wynikiem poddana 70% etanolu przez 10 minut wykazała żywotność 2,7 ± 7,2% (patrz Rysunek 5C-F).

Rysunek 5
Rysunek 5: Ocena czystości wysepek, żywotności i funkcjonalnej responsywności. Reprezentatywne obrazy i ilościowe podsumowania charakterystyk izolowanych wysepek w czasie. (A) Reprezentatywne zdjęcie 10× jasnego pola wysepek zabarwionych dithizonem (DTZ), pokazujące czerwone wysepki dokrewne i nieprzebarwione tkanki egzokryniczne. (B) Wartości wydzielania insuliny stymulowanej glukozą (GSIS) z indeksem stymulacji wysokiego poziomu glukozy/niskiego poziomu glukozy (HG/LG) dla dni 1, 3 i 7. (C-E) Obrazy na żywo/martwe z fluorescencją wysepek w Dniu 1 (C), Dniu 3 (D) i Dniu 7 (E). (F) Obraz na żywo/martwe fluorescencyjne wysew o dodatniej kontroli poddawanej etanolowi. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

(A) Medie do prania
SkładnikOstateczna koncentracjaIlość (mL)
RPMI 1640-500 mL
Serum bydlęce płodowe10%50 mL
Angina mięciowa (10 000 U/mL)1%5,5 mL
HEPES25 mM12,5 mL z 1M magazynów
L-glutamina2 mM5 mL z magazynu 200 mM
(b) Media kultury wysepek
SkładnikOstateczna koncentracjaIlość (mL lub g)
RPMI 1640, brak glukozy-500 mL
Serum bydlęce płodowe10%50 mL
Angina mięciowa (10 000 U/mL)1%5,5 mL
HEPES20 mM11 mL z 1M zapasów
Pirowęglan sodu1 mM5,5 mL z 100 mM magazynu
Glukoza5,5 mM2,75 mL z akwarium 200 g/L
(c) Roztwór płukania penicylinowo-streptomycynowej
SkładnikOstateczna koncentracjaIlość (mL lub g)
Roztwór soli fizjologicznej, 0,9%-500 mL
Penicylinowa streptomycyna (10 000 U/mL)2%10 mL
(D) Bufor chłodzący
SkładnikOstateczna koncentracjaIlość (mL lub g)
HBSS-500 mL
Serum bydlęce płodowe20%100 mL
HEPES (1 M)2.50%2,5 mL
(E) Krebs Buffer
SkładnikOstateczna koncentracjaIlość (mL lub g)
dH2O-975 mL
NaCl115 mM6,72 g
NaHCO324 mM2,02 g
KCl5 mM0,3728 g
HEPES (1 M)25 mM25 mL
MgCl21 mM0,0952 g
BSA0.10%1 g
CaCl22,5 mM0,2775 g

Tabela 1: Lista rozwiązań. Szczegóły składu i przygotowania wszystkich roztworów stosowanych w całym protokole izolacji i oczyszczania wysepek. Każda podsekcja zawiera składniki, końcowe stężenia, wolumeny przygotowawcze oraz numery katalogowe. (A) Medium do mycia używanego do płukania i mycia tkanek podczas trawienia i oczyszczania. (B) Medium do hodowli wysepek, wykorzystywane do utrzymania i żywotności wysepek po izolacji. (C)Roztwór płukania penicylina i streptomycyny, używany do sterylizacji i płukania pobranych trzustek. (D) Bufor Hartujący, używany do zakończenia trawienia enzymatycznego i zachowania żywotności komórek. (E) Bufor Krebsa, stosowany podczas testów wydzielania insuliny stymulowanej glukozą (GSIS).

Liczba trzustekKolagenaza (15,38 mg/mL)Termolizyna (1 mg/mL)DNAse (100 mg/mL)Bufor roboczyZlewki 600 mL do użyciaWolum/Zlewka
304,5 mL2,25 mL450 μL450 mL525 mL
243,6 mL1,8 mL360 μL360 mL425 mL
203 mL1,5 mL300 μL300 mL325 mL
162,4 mL1,2 mL240 μL240 mL225 mL
121,8 mL0,9 mL180 μL180 mL225 mL
101,5 mL0,75 mL150 μL150 mL225 mL
Ostateczna konc.0,15 mg/mL5 mg/mL0,1 mg/mL

Tabela 2: Roztwór enzymów trawiennych według ilości trzustki. Objętości kolagenazy, termolizyny i DNazy I wymagane do przygotowania Roboczego Medium Dysocjacyjnego (WDM) dla różnej liczby trzustek szczurów. Końcowe stężenia każdego enzymu są wymienione na dole tabeli.

Liczba trzustekNumer 50 mL lampObjętość/strzykawkaLiczba 1,096 strzykawekLiczba 1.068 strzykawek
3010 lamp50 mL22
248 lamp40 mL22
206 lamp30 mL22
164 rurki40 mL11
124 rurki40 mL11
102 lampy20 mL11

Tabela 3: Obciążenie gradientowe według ilości trzustki. Liczba 50 mL stożkowych rurek oraz odpowiadające im objętości gradientu wymagane do oczyszczenia wysepek, w zależności od liczby przetworzonych trzustek.

Zakres średnicy wysepek (μm)Liczba cząstek wysetek (AI)Współczynnik konwersji IEQIEQ na zakres
50-100a* 0.167a * 0,167
101-150b* 0.648b * 0,648
151-200c* 1.685c * 1,685
201-250d* 3.500d * 3.500
251-300e* 6.315e * 6.315
301-350f* 10.352f * 10,352
> 350g* 15.833g * 15,833

Tabela 4: Konwersja równoważności wysepek. Konwersja zakresów średnic wysepek na ustandaryzowane odpowiedniki wysepek (IEQ). Tabela przedstawia obserwowane pojemniki średnicy wysepek, liczbę cząstek wysew na obszar, odpowiadający współczynnik konwersji IEQ dla każdego zakresu rozmiarów oraz wynikający z tego wkład IEQ na obszar.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten określa wysokoprzepustowe podejście do izolacji i oczyszczania wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa. Sukces metody zależy od kilku kluczowych kroków, które wspólnie zachowują integralność i funkcjonalność wysepek. Wśród nich są precyzyjne i pełne śródprzewodowe perfuzja trzustki, staranne oczyszczenie przetrawionej trzustki oraz dokładny czas trawienia enzymatycznego. Stała perfuzja całych narządów jest kluczowa dla osiągnięcia równomiernej rozciągniętej trzustki i równomiernego rozmieszczenia mieszanki kolagenazy, termolizyny i DNazy, która odpowiednio trawi macierz zewnątrzkomórkową, zwiększa penetrację enzymów i zmniejsza lepkość pośredniczoną przez DNA21,22. Niedoskonałość może prowadzić do niepełnego trawienia tkanek i utraty znacznej części wysp, ponieważ niedostrawiona tkanka jest filtrowana przez sito. Podobnie, niewystarczające usuwanie tkanki tłuszczowej lub naczyniowej przed trawieniem może wprowadzić niedokrewne zanieczyszczenia obniżające czystość. Wreszcie, przedłużone trawienie prowadzi do desegregacji wysepek z powodu nadmiernego uszkodzenia macierzy zewnątrzkomórkowej, podczas gdy nieoptymalne trawienie prowadzi do niestrawionej tkanki odpornej na mechaniczne trawienie za pomocą igły rdzeniowej. Te kroki stanowią najczęstsze pułapki techniczne i powinny być uważnie monitorowane podczas szkoleń i optymalizacji.

Chociaż metoda ta została zaprojektowana specjalnie dla szczurów Lewisa, prawdopodobnie można ją dostosować do innych szczepów lub gatunków poprzez drobną reoptymalizację czasu trawienia i stosunku enzymów 23,24,25,26. Niektóre laboratoria mogą zdecydować się na korektę proporcji kolagenazy, termolizyny i DNazy I w ośrodku dysocjacji roboczej (WDM), aby zoptymalizować wydajność dla specyficznych cech partii enzymów lub tkanek. Aby to zrobić, laboratoria mogą dokładnie stosować krok po kroku przewodnik producenta dotyczący optymalizacji enzymów i tkanek, a w każdym przypadku unikać dodawania składników takich jak 0,1 M EDTA, cysteina, merkaptoetanol, inhibitory proteazy, surowica lub albumina, ponieważ mogą one hamować kolagenazę, termolizynę oraz aktywność enzymu DNazy 127. Chociaż nie opublikowano jednoznacznego czasu pracy mieszaniny enzymów przed dysocjacją, wcześniejsze dane pokazują, że długotrwałe chłodne zachowanie trzustki negatywnie wpływa na wydajność i funkcjonowanie wysepek28. Empirycznie stwierdziliśmy, że w naszym protokole udane izolacje były konsekwentnie osiągane, gdy całkowity czas zimnej niedokrwienia, definiowany jako odstęp między umieszczeniem pierwszej trzustki w lodzie do czyszczenia a przeniesieniem jej do kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, był utrzymywany poniżej 1,5 godziny. Dalsza optymalizacja tego parametru może być uzasadniona w zależności od zastosowania użytkownika końcowego.

Pomimo swojej odporności, protokół ten ma kilka praktycznych i technicznych ograniczeń. Po pierwsze, mieszanka enzymów (kolagenaza, termolizyna i DNaza I) oraz gradienty gęstości są niezbędne do efektywnej dysocjacji tkanek i izolacji wysepek, a jednocześnie wiążą się ze znacznymi kosztami. Nasz wybór kombinacji enzymów był podyktowany cechami strukturalnymi macierzy zewnątrzkomórkowej trzustki oraz potrzebą zrównoważenia skutecznej dysocjacji tkanek z zachowaniem integralności wysepek. Każdy składnik enzymatyczny pełni inną rolę: kolagenaza celuje w kolageny włókniste i błony podstawnej, aby uwalniać wysepki; termolizyna, neutralna proteaza, rozszczepia białka macierzy niekolagenowe oraz cząsteczki adhezji komórek, zmniejszając wymaganą ekspozycję na kolagenazę; oraz DNaza I minimalizuje lepkość wywołaną przez DNA uwalniane z komórek lizowanych 29,30,31. Chociaż tańsze formuły enzymów trawiennych są dostępne komercyjnie, ich czystość jest zmienna i może wpłynąć na wydajność enzymatyczną13,23. Ponieważ kolagenaza jest izolowana z hodowli bakteryjnych, dodatkowe kroki oczyszczania zmniejszają zanieczyszczenie endotoksynami, ale znacznie zwiększają koszt13,23.

Dla kolagenazy zalecamy preparaty o aktywności około 2 000 do 4 000 jednostek Wünscha na butelkę, co wspiera efektywną dysocjację przy umiarkowanym dawkowaniu i zapobiega długotrwałemu trawieniu. Warto zauważyć, że mieszanka powinna zawierać zrównoważony stosunek kolagenazy klasy I do klasy II, odpowiadający frakcji kolagenazy II do całkowitej ilości kolagenazy na poziomie około 0,3-0,5. Ten stosunek zapewnia silną aktywność kolagenolityczną, jednocześnie ograniczając nadmierną degradację niekolagenowej macierzy zewnątrzkomórkowej. Dodatkowo, mieszanina kolagenaz powinna być uzupełniona umiarkowanym poziomem aktywności neutralnej proteazy (około 150 000-250 000 jednostek) oraz DNazą, z powodów już wspomnianych.

Z punktu widzenia kontroli jakości każda partia powinna zawierać dokumentację niskiego obciążenia endotoksynami (≤50 EU/mg białka), wysokiej czystości enzymów (≥85% według HPLC) oraz potwierdzonej aktywności między partiami, ponieważ czystość i skład enzymów mogą się znacznie różnić w zależności od producenta. Wreszcie, różnice w składzie lotu mogą wpływać na spójność trawienia i plon wysepek, co wymaga wykonania wewnętrznej weryfikacji specyficznej dla partii. Taką walidację można osiągnąć poprzez stosowanie standaryzowanych warunków trawienia opisanych w tym protokole, a następnie ocenę wydajności trawienia i morfologii wysepek. Wskaźniki nieoptymalnej wydajności enzymu to niepełna dysocjacja tkanek, wysepki o nieregularnych lub chropowatych brzegach lub konieczność nadmiernego ścinania mechanicznego do uzyskania separacji, w takim przypadku może być konieczne miareczkowanie czasu trawienia.

Podobne rozważania dotyczą gradientów gęstości. Wybraliśmy gradient na bazie polisachozy, niejonowy, wysoce hydrofilowy kopolimer sacharozowo-epichlorohydryny, który tworzy stabilne gradienty do 1,2 g/mL i ma długą historię izolacji wysepek32,33. Jodiksanol jest dobrze zweryfikowaną alternatywą, a badania na ludzkich wysepkach pokazują, że gradienty oparte na jodiksanolu mogą poprawić ich regenerację przy jednoczesnym zachowaniu żywotności i funkcjonowania 34,35,36,37. Jednak dane dotyczące gryzoni są niejednoznaczne; niektóre badania wykazały lepsze wyniki przy użyciu joduksanlu, a inne wykazały lepszą żywotność i funkcjonowanie przy gradientach polisachorozowych32,35. Co istotne, zaleca się stosowanie komercyjnie produkowanych, kontrolowanych jakościowo rozwiązań gradientowych, aby zwiększyć powtarzalność w różnych laboratoriach. Gradienty oparte na polisacharozie są powszechnie dostępne przy optymalnych gęstościach do izolacji wysepek, podczas gdy gradienty jodiksanolu są zazwyczaj przygotowywane przez rozcieńczenie wewnętrzne, co wprowadza dodatkową zmienność. Drugim ograniczeniem jest to, że pobieranie chirurgiczne wymaga wysokiego poziomu biegłości technicznej, szczególnie przy perfuzji wewnątrzprzewodowej przez zwieracz Oddiego oraz szybkim wycięciu trzustki. Nawet niewielkie opóźnienia lub nieułożenie mogą prowadzić do uszkodzenia tkanek, wycieku, nierównomiernego przelewu lub przedłużającej się gorącej niedokrwienia, co może obniżyć wydajność i żywotność wysepek. Aby złagodzić to ograniczenie, protokół zawiera szczegółowe opisy proceduralne oraz oryginalne materiały graficzne z kolorowymi punktami orientacyjnymi w sposób anatomiczny, ułatwiający zrozumienie. Nowym operatorom zaleca się oswojenie się z techniką perfuzji przed przeprowadzeniem pełnej izolacji, a przed podjęciem się żywych poborów zaleca się ćwiczenie na tusach.

Po trzecie, dla maksymalnej efektywności protokół ten wymaga skoordynowanej pracy zespołowej. Podczas pobierania trzustki i trawienia enzymatycznego zazwyczaj potrzebnych jest trzech przeszkolonych operatorów: jeden wykonuje sterylne operacje, jeden oczyszcza trzustkę w warunkach sterylnych oraz jeden krąży i usypia zwierzęta w warunkach niesterylnych. Po strawieniu kolejne etapy oczyszczania mogą być zazwyczaj wykonywane przez mniej operatorów po osiągnięciu biegłości. Chociaż ta koordynacja stanowi początkowe wymagania logistyczne, umożliwia izolację wielu wysepek od wielu zwierząt w stosunkowo krótkim czasie, poprawiając ogólną przepustowość w porównaniu do mniej skoordynowanych przepływów. Chociaż protokół ten jest technicznie wymagający i zasobochłonny, te ograniczenia są wspólne dla wszystkich metod izolacji wysepek. Poprzez nacisk na standaryzowane warunki trawienia, ustrukturyzowane szkolenia i skoordynowane wykonanie, to wysokoprzepustowe podejście może skrócić czas i pracę na izolację oraz przynieść spójne, powtarzalne rezultaty, gdy jest wykonywane przez wykwalifikowany zespół.

W porównaniu z konwencjonalnymi protokołami izolacji wysepek gryzoni, ta metoda oferuje znaczące korzyści w zakresie przepustowości, powtarzalności i spójności. Tradycyjne trawienie pojedynczym narządem w dużej mierze opiera się na ręcznym pickingu i często daje zmienną czystość13. Dla porównania, nasz protokół wykorzystuje trawienie połączone i oczyszczanie gradientów gęstości, co znacznie skraca czas przygotowania i zmienność między próbkami, jednocześnie zachowując wysoką żywotność wysetek i funkcjonalną responsywność. Wyizolowane wysepki zostały kompleksowo scharakteryzowane pod kątem morfologii (barwienie dithizone), żywotności (test żywy/martwy) oraz funkcji (wydzielanie insuliny stymulowane glukozą), co potwierdza odporność metody. Łącznie ten ustandaryzowany przepływ pracy umożliwia generowanie obfitych, czystych i funkcjonalnych preparatów wysepek odpowiednich do zastosowań w dalszej fazie, w tym do enkapsulacji, przeszczepów oraz modelowania mikrofizjologicznego 38,39,40. Co istotne, wysepki szczurów Lewisa wyizolowane tą techniką odwróciły cukrzycę w modelach przedklinicznych, co podkreśla translacyjną istotność tego powtarzalnego i skalowalnego podejścia41.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.G. jest współzałożycielem i głównym doradcą naukowym firmy Continuity Biosciences, LLC. A.G., J.P-M. oraz C.Y.X.C. są wynalazcami własności intelektualnej licencjonowanymi przez continuity Biosciences, LLC. Wszyscy inni autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało wsparte przez National Institutes of Health (NIH) R01DK133610-01 (A.G., N.K.) oraz NIH NIDDK R01DK132104 (A.G.), Breakthrough T1D-2021-1078-S-B (AG) oraz-2022-1224-S-B (A.G., N.K.), a także Fundację Vivian L. Smith.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
21 G x 2 cale. BD PrecisionGlide NeedleBD305129
500 & mikro; m Mosiężna rama i 304 sito ze stali nierdzewnej, średnica 3" x głębokość 1" (sito numer 35)McMaster-Carr34735K525
Air-Tite Sterile Strzykawki, zamek LuerFisher Scientific14-817-178
Biogel PI UltraTouch MMö Inlycke42665
nożyczki bonn; Prosto; ostre punkty; Długość łopaty 15 mm; Całkowita długość 3 1/2"RobozRS-5840
Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERILFisher ScientificNC9956482
Seria Cell-IQ 5,8 stóp sześciennych Inkubator Laboratoryjny CO2PHCBIMCO-170AICUVHL-PA
Corning 100 mm Not TC-treated Culture DishCorning430591
Serum bydła płodowego Corninga, 500 mL, zwykłe, testowane przez USDA (inaktywowane termicznie)Corning35011CV
Gradient wysepek Corning 1,069 (gęstość 1,069 g/cm3)Corning99-815-CISWymaga specjalnej prośby od firmy
Gradient wysepki Corning 1,096 (gęstość 1,096 g/cm3)Corning99-691-CISWymaga specjalnej prośby od firmy
Gradient wysepki Corning 1,108 (gęstość 1,108 g/cm3)Corning99-692-CISWymaga specjalnej prośby od firmy
Podkładki Covidien TendersorbFisher Scientific22-225-102
DNaza I Grade IIRoche10104159001
Falcon  Stożkowe rurki wirówkowe o wysokiej klarowności 50 mLFisher Scientific14-432-22
Folia aluminiowa Fisherbrand, rolka o standardowym rozstawieFisher Scientific01-213-100
Fisherbrand  Gąbki z gazy nietkanejFisher Scientific22-028-559
Szkło wielorazowego użytku, ciężkie zlewki Fisherbrand o niskim kształcieFisher ScientificFB101600
Mikromikroskop fluorescencyjny  BZ-X810KeyenceBZ-X810
Roztwór glukozyGibcoA2494001
Uchwyt na mikroigły HalseyNarzędzia Nauki Ścisłej12500-12
HBSS, wapń, magnez, bez fenolu czerwonegoGibco14025092
HEPES (1 M)Gibco15630080
Hemostatyczne kleszcze Classic Crile długość 5,5 calaMcKesson1231217
Kleszcze Hudsona (Ewald)RobozRS-5238
Igła hipodermiczna, monojektowa o długości 1-1/2 cala, 16 gauge, zwykła ściana bez zabezpieczeniaMcKesson43481
L-glutamina (200 mM)Gibco25030081
Liberase T-Flex, Stopień BadawczyRoche5989132001
Zestaw żywotności żywych/martwych / cytotoksyczności, dla komórek ssakówInvitrogen  L3224
Pakiet oprogramowania MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
NE-4000 Dwukanałowa programowalna pompa strzykawkowaPompa strzykawkowaNE-4000-US
IGŁA, HIPOSTR DYSPONACJA 27GX1/2" (100/BX) EXLINTMcKesson408877
Hodowla komórek/szalki PetriegoTermonaukowe174926
Olympus CKX41 Mikroskop Kontrastu Fazowego OdwróconegoOlympusCKX41-B
PBS, pH 7,4Gibco10010023
Penicylina Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140122
RPMI 1640Gibco11875093
RPMI 1640, bez glukozyGibco11879020
Pirowinian sodu (100 mM)Gibco11360070
Pirowęglan sodu (100 mM zapasu)Gibco11360070
Sorval ST 16RTermonaukowe75004381
Igła do strzykawki ze stali nierdzewnej 304Milipore SigmaZ117013-1EA
CHIRURGICZNA ZASŁONA, JEDNORAZOWA, 36 In X 100 JARDÓWCovetrus10408
Nożyczki chirurgiczne - ToughCutNarzędzia Nauki Ścisłej14054-13
Kleszcze do opatrunku na kciuk 4,5" ząbkowate, delikatne końcówki 1,3 mmRobozRS-8120
Termo Scientific Nunc 200mL Rurka WirówkiTermonaukowe14-962-17
Adaptery i poduszki do butelek do wirówek Thermo Scientific NuncTermonaukowe12-565-283B
TSDUB15 15L Dubnoff do wstrząsającej kąpieli wodnejFisher Scientific300610298
TX-400 4 x 400 mL Obrotowy wirnik kubełowyTermonaukowe75003181
Tygon S-50-HLTygonAAXoooo3
Ultra Sensitive Rat Insulin ELISAChemia krystaliczna90060

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grattoni, A., et al. Harnessing cellular therapeutics for type 1 diabetes mellitus: progress, challenges, and the road ahead. Nat Rev Endocrinol. 21 (1), 14-30 (2025).
  2. Páez-Mayorga, J., et al. Emerging strategies for β cell transplantation to treat type 1 diabetes mellitus. Cell Transplant. 31, 963689721004(2022).
  3. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets and its relevance to β-cell function. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (7), 2334-2339 (2006).
  4. Brissova, M., et al. Pancreatic islet microvasculature and blood flow. J Clin Invest. 124 (4), 1871-1883 (2014).
  5. Jiang, F. X., Morahan, G. Pancreatic islet architecture and function. Cell Death Discov. 10, 170(2024).
  6. Sato, Y., et al. Hypoxia induces β-cell apoptosis and functional suppression in isolated islets. PLoS One. 9 (12), e114868(2014).
  7. Tiedge, M., Lortz, S., Drinkgern, J., Lenzen, S. Relation between antioxidant enzyme gene expression and antioxidative defense status of insulin-producing cells. Diabetes. 46 (11), 1733-1742 (1997).
  8. Ichii, H., et al. Shipment of human islets for transplantation. Am J Transplant. 7 (4), 1010-1020 (2007).
  9. Carobbio, S., et al. Rapid GSIS kinetics in freshly isolated mouse islets. Diabetologia. 47 (9), 1652-1662 (2004).
  10. Zawalich, W. S., Zawalich, K. C., Kelley, G. G. Immediate perifusion of fresh rat and mouse islets. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (2), E444-E450 (2008).
  11. Wassmer, C. H., et al. Clinical use of freshly isolated islets transplanted within 48 h. Transplant Proc. 53 (6), 1907-1912 (2021).
  12. Tai, D. S., et al. Immediate autotransplantation of islets following total pancreatectomy. JAMA Surg. 150 (5), 472-479 (2015).
  13. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  14. Emamaullee, J. A., et al. Lewis rats in transplantation studies. Diabetes. 65 (5), 1350-1359 (2016).
  15. de Groot, M., et al. Rat islet isolation yield and function are donor strain dependent. Lab Anim. 38 (2), 200-206 (2004).
  16. Moazenchi, A. M., et al. Strain variability in islet yield and isolation. Islets. 2 (5), 283-289 (2010).
  17. Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. Isolation variability limits reproducibility in rat islet studies. PLoS One. 14 (5), e0216136(2019).
  18. Stehno-Bittel, L. The flaws and future of islet volume measurements. Cell Transplant. 27 (4), 571-578 (2018).
  19. Kissler, H. J., et al. Validation of methodologies for quantifying isolated human islets. Cell Transplant. 18 (6), 611-620 (2009).
  20. Papas, K. K., et al. Islet assessment for transplantation. Cell Transplant. 18 (6), 519-528 (2009).
  21. Dono, K., et al. Low temperature collagenase digestion for islet isolation from 48-hour cold-preserved rat pancreas. Transplantation. 57 (1), 22-26 (1994).
  22. Shapiro, A. M. J., et al. High yield of rodent islets with intraductal collagenase distension and warm incubation. Cell Transplant. 5 (6), 631-638 (1996).
  23. Corbin, K. L., Hughes, J. W., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment revisited. Biol Proced Online. 23, 10(2021).
  24. de Haan, B. J., et al. Factors influencing isolation of functional pancreatic rat islets. Pancreas. 29 (1), e15-e22 (2004).
  25. Kenyon, N. S., et al. Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in baboons treated with humanized anti-CD154. Diabetes. 48 (7), 1473-1481 (1999).
  26. Kenyon, N. S., et al. Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in rhesus monkeys treated with humanized anti-CD154. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (14), 8132-8137 (1999).
  27. Liberase T-Flex Research Grade - Method Sheet. eLabDoc. , Roche Diagnostics GmbH. (2025).
  28. Miyazaki, Y., et al. Strategy towards tailored donor tissue-specific pancreatic islet isolation. PLoS One. 14 (5), e0216136(2019).
  29. Cross, S. E., et al. Key matrix proteins within the pancreatic islet basement membrane are differentially digested during human islet isolation. Am J Transplant. 17 (2), 451-461 (2017).
  30. O'Gorman, D., Kin, T., Pawlick, R., Imes, S., Senior, P. A., Shapiro, A. J. Clinical islet isolation outcomes with a highly purified neutral protease for pancreas dissociation. Islets. 5 (3), 111-115 (2013).
  31. Wang, W., et al. Adjustment of digestion enzyme composition improves islet isolation outcome from marginal grade human donor pancreata. Cell Tissue Bank. 8, 187-194 (2007).
  32. McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran. Islets. 3 (4), 144-149 (2011).
  33. Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. Automated method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes. 37 (4), 413-420 (1988).
  34. BenchChem Technical Support Team. An in-depth technical guide to cell separation using iodixanol. BenchChem. , (2026).
  35. Dellê, H., Saito, M. H., Yoshimoto, P. M., Noronha, I. L. The use of iodixanol for the purification of rat pancreatic islets. Transplant Proc. 39 (2), 467-469 (2007).
  36. Noguchi, H., et al. Iodixanol-controlled density gradient during islet purification improves recovery rate in human islet isolation. Transplantation. 87 (11), 1629-1635 (2009).
  37. Min, T., et al. Superiority of Visipaque (iodixanol)-controlled density gradient over Ficoll-400 in adult porcine islet purification. Transplant Proc. 42 (5), 1825-1829 (2010).
  38. Paez-Mayorga, J., et al. Neovascularized implantable cell homing encapsulation platform with tunable local immunosuppressant delivery for allogeneic cell transplantation. Biomaterials. 257, 120232(2020).
  39. Paez-Mayorga, J., et al. Implantable niche with local immunosuppression for islet allotransplantation achieves type 1 diabetes reversal in rats. Nat Commun. 13, 7951(2022).
  40. Piemonti, L., et al. Islet transplantation. Endotext. , (2022).
  41. Patel, S. N., et al. The foundation for engineering a pancreatic islet niche. Front Endocrinol. 13, 881525(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie wysepekwysepki szczura rasy Lewistransplantacja wysepekywotno wysepekbarwienie dytyzonemstymulowana glukoz sekrecja insulinyfunkcja kom rek beta

Powiązane artykuły