Artykuł badawczy

Porównanie wyników analizy DNA plemników przy użyciu różnych strategii wyznaczania progów w cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/70417

⸱

10 lipca 2026

 ,  ,  , 
1Department of Reproductive Center, The Affiliated Huai'an No. 1 People's Hospital of Nanjing Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie poligonalne (PGG) i krzyżowe (CFG) są metodami cytometrii przepływowej do wykrywania integralności DNA plemników. PGG mierzy indeks fragmentacji DNA (DFI) i wysoki indeks barwienia DNA (HDS). CFG raportuje poważny DFI, łagodny DFI oraz ogólny DFI. Niniejsze badanie ma na celu porównanie wyników i korelacji między nimi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Integralność DNA plemników jest kluczowym czynnikiem zapewniającym skuteczne zapłodnienie, rozwój zarodka i trwającą ciążę. Ocena struktury chromatyny plemników (SCSA) przy użyciu cytometrii przepływowej po denaturacji DNA i barwieniu akrydyną pomarańczową jest uważana za metodę standardową oceny DNA plemników. W literaturze opisano dwie strategie bramek dla oceny na podstawie cytometrii przepływowej indeksu fragmentacji DNA plemników (DFI): bramki wielokątne (PGG) i bramki krzyżowe (CFG). Celem niniejszego badania było porównanie relacji wyników testu między PGG a CFG oraz analiza ich korelacji z parametrami podstawowej analizy nasienia. Dane uzyskane niezależnie za pomocą dwóch metod zostały porównane za pomocą analizy statystycznej, w tym wykresów Bland-Altman i analizy regresji. Łącznie 121 mężczyzn-pacjentów z otoczenia zewnętrznego poddawanych ocenie płodności w naszym szpitalnym centrum reprodukcyjnym zostało wybranych metodą całkowicie losowego pobierania prób. DFI plemników i powiązane wskaźniki wykryto za pomocą cytometrii przepływowej, odpowiednio za pomocą PGG i CFG. Wyniki wykazały, że wartości DFI uzyskane z dwóch metod wykazały dobrą zgodność. Współczynniki korelacji między DFIp z metody PGG a DFIm, DFIs i DFIc z metody CFG wynosiły odpowiednio 0,6497, 0,9404 i 0,9667 (wszystkie p < 0,01). Wysoki wskaźnik barwienia DNA (HDS) wykazywał niewielką ujemną korelację z DFIs (r = -0,3042, p < 0,05). Odsetek progresywnie ruchomych plemników był ujemnie skorelowany z DFIp, DFIs i DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574, odpowiednio, wszystkie p < 0,05). Nie zaobserwowano istotnej korelacji między HDS a objętością nasienia, stężeniem plemników, całkowitą liczbą plemników lub PR (%). Te ustalenia wskazują, że DFIs są ściślej związane z płodnością mężczyzn, co sugeruje, że metoda CFG, która zapewnia ten parametr, może być bardziej odpowiednia do oceny klinicznej uszkodzenia DNA plemników.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Integralność DNA plemników odnosi się do integralności i stabilności funkcjonalnej struktury molekularnej DNA w jądrze plemnika. W szczególności charakteryzuje się normalną konformacją chromatiny, nietkniętymi sekwencjami zasad bez uszkodzeń lub uszkodzeń oksydacyjnych oraz zdolnością do dokładnego przekazywania informacji genetycznych potomstwu. Podczas spermatogenezy, gdy wzrośnie stres oksydacyjny1, przebudowa chromatiny jest nieprawidłowa2, lub plemnik jest narażony na działanie toksyn środowiskowych3, integralność DNA plemników zostanie uszkodzona, co prowadzi do niedopasowania zasad, utraty, modyfikacji, dodatku DNA i przekrzyżowania, pojedynczych i podwójnych pęknięć itp. Co więcej, uszkodzony DNA plemników może upośledzić płodność męską i niekorzystnie wpływać na wyniki ciąży w asystowanych technologiach rozrodu (ART)4, a także zwiększać ryzyko nawracających poronień5. W 2021 roku Europejskie Stowarzyszenie Urologiczne (EAU) zaleciło włączenie testowania DFI do systemu oceny płodności męskiej6.

Obecnie integralność DNA plemników jest głównie oceniane poprzez wykrywanie indeksu fragmentacji DNA plemników (DFI). Analiza struktury chromatiny plemników (SCSA) za pomocą cytometrii przepływowej jest podstawową metodą oceny DFI7. W literaturze opisano dwie metody bramek cytometrii przepływowej do wykrywania DFI plemników. Jedna z nich to metoda bramek wielokątnych (PGG), która może jednocześnie raportować dwa kluczowe wskaźniki, takie jak DFI plemników i HDS8. PGG to klasyczna metoda SCSA charakteryzująca się mniejszym współczynnikiem zmienności wykrywania i lepszą powtarzalnością9. Jednak nie może ona odróżnić ciężkości uszkodzeń DNA. Drugi typ to metoda bramek krzyżowych (CFG), która może raportować ciężki marker uszkodzenia DNA plemników (DFIs), łagodny marker uszkodzenia DNA plemników (DFIm) oraz całkowity DFI metody bramek krzyżowych (DFIc). DFIc jest równy sumie DFIs i DFIm. W porównaniu z obecnymi technologiami oceny integralności DNA plemników, metoda CFG może odzwierciedlić ciężkość uszkodzeń DNA plemników10.

Aby określić, która metoda jest bardziej odpowiednia do oceny jakości plemników, w niniejszym badaniu zastosowano zarówno metodę PGG, jak i metodę CFG do pomiaru DFI i powiązanych parametrów w plemnikach. Porównano korelacje między wynikami tych dwóch metod a konwencjonalnymi parametrami analizy nasienia. Według naszej wiedzy, jest to pierwsze badanie analizujące korelacje wyników wykrywania między dwoma metodologiami, PGG i CFG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Medycznej Szpitala Ludowego w Huai'an przy Uniwersytecie Medycznym w Nanjing (Numer zgody: KY-2024-181-01). Pisemną zgodę uzyskało się od pacjentów, których próbki zostały wykorzystane w tym badaniu. Ogólny schemat przepływu przedstawiono na Rysunku 1. Szczegóły reagentów i sprzętu użytych w badaniu są opisane w Tabeli Materiałów.

Ustawienia CFG dla cytometru przepływowego
Po traktowaniu kwasem, chromatyna jądrowa plemnika z uszkodzonym DNA pokazuje pojedynczą strukturę DNA, podczas gdy chromatyna jądrowa plemnika z nieuszkodzonym DNA zachowuje swoją nienaruszoną strukturę podwójnej helisy. Fluorescencyjny barwnik akrydyna pomarańczowa (AO) wiąże się z pojedynczą strukturą DNA i emituje czerwoną fluorescencję po wzbudzeniu przez laser 488 nm. Gdy jest związany z podwójną strukturą DNA, emituje zieloną fluorescencję po wzbudzeniu przez laser 488 nm. Na podstawie liczby czerwono- i zielono-fluorescencyjnych sygnałów uchwyconych przez cytometr przepływowy, oblicza się stosunek czerwonej fluorescency do sumy czerwonej i zielonej fluorescency, co reprezentuje DFI plemników.

Ustawienia CFG zostały zaimplementowane zgodnie z przeglądem dostarczonym przez Yang i wsp.10. Cytometr przepływowy powinien być skonfigurowany przy użyciu najniższej zielonej fluorescency i najwyższej czerwonej fluorescency zmierzonej w AO-barwionych normalnych plemnikach jako referencji granicznych (Rysunek 2). Poniżej znajduje się lista cech komórkowych każdego kwadranta w CFG:
Kwadrant Q1 wskazuje na normalne plemniki. Stwierdzono, że DNA plemników jest nienaruszone, a ilość związanego AO jest minimalna, co powoduje zieloną fluorescencję.
Plemniki w kwardranie Q2 mają częściowo sfragowane DNA i wyglądają pomarańczowo pod mikroskopem fluorescencyjnym. Takie DNA może być naprawialne, te plemniki są klasyfikowane jako mające łagodne sfragowane DNA (DFIm)10.
Kwadrant Q3 jest definiowany jako niespecyficzna fluorescencję, która przeszła subtrakcje.
Plemniki w kwardranie Q4 mają sfragowane DNA i wyglądają czerwono pod mikroskopem fluorescencyjnym, co wskazuje na ciężkie sfragowane DNA (DFIs).

Proponuje się, że plemniki w kwardranach Q2 i Q4 zawierają sfragowane DNA, a ich suma jest definiowana jako DFIc.

Ustawienia PGG dla cytometru przepływowego
Wieloboczne bramy dla analizy cytometrycznej zostały ustanowione zgodnie z metodą opisana przez Evensona i wsp.8. Jak pokazano na Rysunku 3, cechy komórkowe związane z każdą bramą są następujące:
P3 wskazuje na procent komórek z denaturowanym DNA.
P4 reprezentuje plemniki o wysokiej barwności DNA (HDS). Ta grupa plemników nie przeszła normalnej wymiany histonów na protamini.
Dominują populacje komórek znajdujące się poza bramami P3 i P4, składające się z normalnych plemników, które wykazują zmniejszoną czerwoną fluorescencję i przeważnie emitują zieloną fluorescencję.

Pobieranie i analiza próbek nasienia
Wszystkie 121 próbek nasienia pochodziło od mężczyzn, którzy odwiedzili Centrum Rozrodcze Pierwszego Szpitala Huai'an przy Uniwersytecie Medycznym w Nanjing. Próbki nasienia były pobieranie poprzez masturbację po okresie powstrzymania się od seksu w dniach 2-7. Analiza rutynowa nasienia była przeprowadzana ściśle zgodnie z wymaganiami Podręcznika Laboratorium WHO ds. Badania i Przetwarzania Nasienia Ludzkiego11,12. Analizy koncentracji plemników i ich ruchliwości przeprowadzano za pomocą komputerowego systemu analizy plemników (CASA). Każda próbka była analizowana dwukrotnie. Wyniki były podawane jako średnia tylko wtedy, gdy różnica między dwoma wynikami znajdowała się w przedziale ufności 95%; w przeciwnym wypadku przeprowadzano ponowne pobieranie próbek i analizę.

Analiza DFI
Oblicz wymaganą objętość próbki nasienia tak, aby końcowe stężenie plemników w reagentzie A z zestawu cytometrii przepływowej wynosiło 2-3 x 106/mL. Metoda obliczeń: Zakładając, że stężenie plemników w oryginalnej próbce nasienia wynosi M x 106/mL, wymagana objętość nasienia (µL) = 150/M. Dodaj obliczoną objętość nasienia do tuby cytometru przepływowego, a następnie dodaj 50 µL reagentu A i delikatnie wymieszaj. Dodaj 100 µL reagentu B, delikatnie wymieszaj i inkubatorz przez 30 s w temperaturze pokojowej. Natychmiast dodaj 300 µL reagentu C i delikatnie wymieszaj. Wykryj próbkę przy użyciu CFG i PGG w cytometrze przepływowym i przeanalizuj co najmniej 5000 plemników.

Analiza statystyczna
Dane były poddawane analizie statystycznej za pomocą GraphPad Prism 6.0. Zostały sporządzone wykresy Bland-Altmana w celu oceny poziomu zgodności pomiędzy PGG i CFG poprzez obliczenie średniej i

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wśród 121 uczestników badania (średnia wieku: 32,5 ± 4,9 lat; zakres: 26–44 lata), u 28 zdiagnozowano asthenozoospermię, a u 4 oligozoospermię. Dane demograficzne początkowe i parametry analizy nasienia są podsumowane w Tabeli 1.

Jak pokazano na Rysunku 4, wykres Blanda-Altmana wykazał, że wyniki DFI plemników uzyskane metodą PGG i CFG wykazywały doskonałą zgodność (r = 0,9667, p = 0,0000). Tylko dwie próbki wykazywały różnice większe niż +10%, a ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

6. wydanie podręcznika laboratorium WHO do badania i przetwarzania ludzkiego spermy12 zaleca cztery metody oceny integralności DNA plemników: terminalna deoksynukleotydylotransferaza (dUTP) nick end labelling (TUNEL), testy elektroforezy żelowej pojedynczych komórek (Comet), SCSA i test dypersji chromatyny plemników (SCD). Spośród nich, SCSA zostało szeroko przyjęte w laboratoriach andrologicznych ze względu na zastosowanie cytometrii przepływowej do analizy, która oferuje wysoką wydajność, efekty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System komputerowej analizy plemnikówBeijing Suijia Software Co., LtdSA-II 
Cytometr przepływowy Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., LtdCyto E6
Zestaw cytometrii przepływowejShenzhen BRED Biotechnology Co., LTD
Komora licząca MakleraSefi Medical Instruments
Zestaw integralności DNA jądra plemnikaShenzhen BRED Biotechnology Co., LTD-

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vaughan, D. A., Tirado, E., Garcia, D., Datta, V., Sakkas, D. DNA fragmentation of sperm: a radical examination of the contribution of oxidative stress and age in 16 945 semen samples. Hum Reprod. 35 (10), 2188-2196 (2020).
  2. Štiavnická, M., et al. H3K4me2 accompanies chromatin immaturity in human spermatozoa: an epigenetic marker for sperm quality assessment. Syst Biol Reprod Med. 66 (1), 3-11 (2020).
  3. Jeng, H. A., et al. Mixture analysis on associations between semen quality and sperm DNA integrity and occupational exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Arch Environ Occup H. 78 (1), 14-27 (2023).
  4. Li, F., Duan, X., Li, M., Ma, X. Sperm DNA fragmentation index affect pregnancy outcomes and offspring safety in assisted reproductive technology. Sci Rep. 14 (1), 356(2024).
  5. Zhu, X. B., et al. Sperm DNA fragmentation in Chinese couples with unexplained recurrent pregnancy loss. Asian J Androl. 22 (3), 296-301 (2020).
  6. Minhas, S., et al. European Association of Urology Guidelines on Male Sexual and Reproductive Health: 2021 Update on Male Infertility. Eur Urol. 80 (5), 603-620 (2021).
  7. Agarwal, A., et al. Technical Aspects and Clinical Limitations of Sperm DNA Fragmentation Testing in Male Infertility: A Global Survey, Current Guidelines, and Expert Recommendations. World J Mens Health. 42 (1), 202-215 (2023).
  8. Evenson, D., Jost, L. Sperm chromatin structure assay is useful for fertility assessment. Meth Cell Sci. 22 (2-3), 169-189 (2000).
  9. B, V. L., et al. Sperm chromatin structure assay versus sperm chromatin dispersion kits: Technical repeatability and choice of assisted reproductive technology procedure. Clin Exp Reprod Med. 47 (4), 277-283 (2020).
  10. Yang, F., et al. Establishment and evaluation of a flow cytometry technique reflecting the severity of human sperm DNA damage. Zhonghua Nan Ke Xue. 26 (11), 989-995 (2020).
  11. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , 5th ed., World Health Organization. Geneva. (2010).
  12. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , 6th ed., World Health Organization. Geneva. (2021).
  13. Evenson, D. P. The Sperm Chromatin Structure Assay(SCSA) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility. Anim Reprod Sci. 169 (6), 56-75 (2016).
  14. Lin, M. H., et al. Sperm chromatin structure assay parameters are not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection, but might be related to spontaneous abortion rates. Fertil Steril. 90 (2), 352-359 (2007).
  15. Virro, M. R., Larson-Cook, K. L., Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril. 81 (5), 1289-1295 (2004).
  16. Mohammadi, Z., Tavalaee, M., Gharagozloo, P., Drevet, J. R., Nasr-Esfahani, M. H. Could high DNA stainability (HDS) be a valuable indicator of sperm nuclear integrity. Basic Clin Androl. 30, 12(2020).
  17. Shen, L., et al. High sperm DNA stainability might not be an accurate predictive indicator of male fertility and assisted reproductive technology outcomes. Front Endocrinol (Lausanne). 16, 1510114(2025).
  18. Lu, J. C. High DNA stainability (HDS) should not be recommended as a marker for the detection of sperm DNA damage. Andrologia. 54 (7), e14442(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MedycynaNumer 233Numer 233W tym miesi cu w JoVENumer

Powiązane artykuły