Pomiar wypływu obiektu i zgodności ocznej u oczu myszy ex vivo za pomocą systemu pompy strzykawkowej

Podsumowanie

Integracja metod analitycznych z ugruntowanych metod perfuzji kontrolowanej ciśnieniem zoptymalizowała prosty, niskokosztowy system pompy strzykawkowej do oceny możliwości wypływu i zgodności oczu u myszy.

Streszczenie

Utrzymanie ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) na odpowiednim i stabilnym poziomie jest niezbędne dla zdrowia oka. Właściwości biomechaniczne siatki trawebkowej (TM), kanału Schlemma (SC) oraz całej skorupy rogówkowej odgrywają kluczową rolę w homeostazie IOP. Funkcja wypływu (C) jest kluczowym parametrem oceny skuteczności TM i SC w drenżowaniu wodnego humoru, podczas gdy zgodność oczu (φ) odzwierciedla elastyczność skorówki i przejściowy odpływ przez TM i SC. Wcześniej opracowano prosty, opłacalny system pompy strzykawkowej do oceny C. Jednak stosowanie prostej regresji liniowej do analizy danych in vivo ma ograniczenia w charakteryzowaniu funkcji TM i SC. W tym badaniu system strzykawka-pompa został zoptymalizowany poprzez zastosowanie metod analitycznych opracowanych dla ustalonych systemów perfuzji oczu z kontrolowanym ciśnieniem. Zmierzone wartości C i φ w oczach ex vivo porównano z wcześniej opublikowanymi wartościami układu perfuzyjnego i były zgodne z tymi zgłoszonymi zakresami. Podsumowując, ten prosty, niedrogi system pompy strzykawkowej ułatwia ocenę właściwości biomechanicznych TM i SC.

Wprowadzenie

Utrzymanie odpowiedniego i stabilnego poziomu ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) jest niezbędne dla zdrowia oczu¹. Utrzymujące się podwyższenie IOP jest głównym czynnikiem ryzyka jaskry ^2,3. Długoterminowe wahania IOP przez miesiące lub lata również przyczyniają się do utraty wzroku ^4,5. Najnowsze badania wykazały inną formę fluktuacji IOP, czyli przejściowe wahania spowodowane codziennymi aktywnościami, które mogą również przyspieszać postęp jaskry ^6,7. Na przykład 46-letni mężczyzna z 20-letnią historią pocierań powiek oraz 52-letni mężczyzna, który przez 10 lat pocierał oczy, obaj wykazali przyspieszone uszkodzenia dysku wzrokowego ^8,9. Wyniki te podkreślają znaczenie terminowych, odpowiednich reakcji na zmiany w IOP, aby zminimalizować ryzyko utraty wzroku.

IOP jest regulowany przez równowagę między produkcją wody (AH) a jej drenażem¹⁰. AH wychodzi z oka głównie przez konwencjonalne i uveoscleralne ścieżki¹¹. Zarówno u oczu normalnego, jak i jaskrowego, konwencjonalny szlak obejmujący siateczkę trawebkową (TM) oraz kanał Schlemma (SC) jest głównym źródłem oporu wypływowego, który wpływa na homeostazę IOP 12,13,14. Dlatego właściwości biomechaniczne TM i SC są niezbędne, aby oko mogło dostosować się do zmian w IOP 15,16,17.

Najnowsze postępy technologiczne umożliwiły dokładniejszą ocenę odpływu AH. Opracowano inwazyjne podejścia, takie jak perfuzja oparta na grawitacji oraz system pompy strzykawkowej, aby obliczyć funkcję wypływu (C), co wskazuje, jak TM i SC regulują ustalony odpływ 18,19,20,21,22,23,24. Metody nieinwazyjne, takie jak tonografia²⁵ i fluorofotometria²⁶, były stosowane klinicznie do określania C u pacjentów z jaskrą. Jednak większość podejść nie jest w stanie ocenić funkcji TM i SC w szczególności. Na przykład w systemie strzykawkowo-pompy dane o przepływie i ciśnieniu w stanie stacjonarnym są dostosowywane za pomocą prostej regresji liniowej, a nachylenie interpretuje się jako zależne od ciśnienia C. Jednak obliczony C u żywych myszy nie jest w stanie dokładnie odzwierciedlić zdolności wypływu AH przez konwencjonalny szlak, ponieważ jest pod wpływem wydzielania AH, odpływu naczyniowego i ciśnienia żylnego w nabłonku, jak opisano w równaniu Goldmanna.

Aby rozwiązać to ograniczenie, Millar i in. obliczyli napływ AH, konwencjonalny i uveoscleralny odpływ w tym samym oku myszy, stosując wiele pomiarów przepływu stałego na podstawie założenia braku napływu AH, braku ciśnienia żylnego w kostce episkleralnej oraz niezmienionego odpływu uveoscleralnego po eutanazji²². W 2016 roku Sherwood i in. poinformowali, że wypływ uveoscleralny wynosi 0 w oczach ex vivo przy 0 mmHg, a następnie odnieśli się do tego samego pytania, wprowadzając model potęgowy wykorzystujący iPerfusion (system perfuzji kontrolowany pod ciśnieniem, dalej zwany systemem perfuzyjnym)²⁷. Postępy metodologiczne wyjaśniły odrębne role TM i SC, poszerzając zrozumienie ich funkcji fizjologicznych w utrzymaniu ustalonego wypływu AH.

Ponadto przejściowa odpowiedź TM i SC na wahania IOP jest niezbędna dla utrzymania homeostazy IOP. Aby śledzić ten ruch, Xin i in. opracowali fazowo czułą optyczną tomografię koherencyjną (OCT), która umożliwia obserwację w skali czasowej²⁸ sekund. Trójwymiarowa szeregowa skaningowa mikroskopia elektronowa z blokową ścianą może badać ten ruch na poziomie ultrastrukturalnym²⁹. Jednak metody oparte na obrazach szacują jedynie właściwości biomechaniczne TM i SC i nie dają rzeczywistych wartości przejściowego drenażu AH. W 2019 roku, po opracowaniu iPerfusion, Sherwood i in. obliczyli zgodność oczu (φ) jako kluczowy wskaźnik zarówno elastyczności rogówkowo-twardowaczki, jak i przejściowej odpowiedzi TM i SC³⁰. Ten postęp stanowi ilościowy parametr do oceny przejściowych zachowań TM i SC w odpowiedzi na wahania IOP.

Na podstawie tych postępów w ocenie funkcji TM i SC, badanie to ulepszyło system strzykawka-pompa, wprowadzając model potęgowy do obliczeń C oraz integrując nowe metody obliczania φ. Pomiary te porównano z opublikowanymi danymi uzyskanymi przy użyciu systemu perfuzji, aby ocenić, czy zoptymalizowany system strzykawka-pompa nadaje się do oceny możliwości wypływu i zgodności ocznej u oczu myszy ex vivo .

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych oraz wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Qingdao (QDU-AEC-2022069).

1. Selekcja i obsługa zwierząt

1. Użyj 5-miesięcznych myszy z 50% C57BL/6 i 50% BALB/c tłem genetycznym. Nie uwzględniaj płci w projektowaniu eksperymentalnym.
2. Utrzymuj myszy w cyklu światła–ciemność 12 godzin na 12 godzin w temperaturze 23 ± 2 °C i wilgotności 50 ± 5%.

2. Pomiar IOP

1. Znieczulaj myszy przy użyciu izofluranu 2,5% z 80% (vol/vol) tlenu w szczelnej komorze przez 3,5 minuty.
   UWAGA: Izofluran to lotny środek znieczulający. Przeprowadz znieczulenie w dobrze wentylowanym miejscu lub w odpowiednim systemie zabezpieczającym (containment).
2. Przenieś myszy na platformę operacyjną. Utrzymuj znieczulenie w masce przez kolejne 30 sekund.
3. Wszystkie pomiary wykonuj między 9:00 a 12:00. Zanotuj trzy pomiary na oko. Oblicz średnią wartość dla każdego punktu danych.

3. Konfiguracja systemu (Rysunek 1)

1. Podłącz strzykawkę 100 μL do pompy strzykawkowej.
2. Podłącz strzykawkę do czujnika ciśnienia przepływowego.
3. Podłącz czujnik do systemu akwizycji danych.
   UWAGA: Upewnij się, że czujnik ciśnienia i uchwyt na oko są ustawione na tej samej wysokości, aby uniknąć artefaktów ciśnienia.
4. Napełnij system 1× soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza.
5. Umieść oko w uchwytie z okrągłym wgłębieniem (średnica 4–6 mm). Upewnij się, że oko jest stabilne podczas kanilowacji. Ustaw czujnik ciśnienia i uchwyt na oko na tej samej wysokości.
   UWAGA: Nieprawidłowe ustawienie może powodować błędy pomiaru ciśnienia. Plik projektowy STL dla spersonalizowanego uchwytu na oko jest udostępniony jako Plik Uzupełniający 1.

4. Działanie oprogramowania

1. Kalibracja czujnika ciśnienia
   1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych. Załaduj plik konfiguracji kalibracji. Wybierz funkcję kalibracji .
   2. Podłącz system do zbiornika wodnego na dwóch określonych wysokościach.
   3. Pomiary wejściowe i rzeczywiste ciśnienia przy użyciu konwersji:
      1 cm H₂O = 0,735 mmHg
2. Układ pompy
   1. Otwórz ustawienia modułu. Załaduj plik konfiguracyjny regulatora.
   2. Wybierz urządzenie pompy. Wprowadź maksymalny przepływ i średnicę strzykawki.
3. Rejestracja danych
   1. Zacznij nagrywać.
   2. Zatrzymaj nagrywanie po każdym kroku nacisku.
   3. Wprowadź następną wartość ciśnienia.
   4. Zrestartuj nagrywanie.

5. Przygotowanie igły

1. Wyciągnij szklaną mikropipetę zgodnie z ustalonym protokołem⁸.
2. Zmielić grot do średnicy wewnętrznej 80–100 μm. Wypolerować końcówkę igły.
   UWAGA: Ostrożnie obchodz się ze szklanymi igłami, aby uniknąć kontuzji.
3. Zamontuj igłę na mikromanipulatorze. Podłącz igłę do przetwornika ciśnienia.
4. Napełnij igłę PBS.
5. Ustaw końcówkę igły na tej samej wysokości co czujnik ciśnienia.
6. Pomiar rezystancji
   1. Zastosuj ciśnienie 1 mmHg. Zapisz przepływ.
   2. Oblicz opór igieł:
      
   3. Używaj igieł o oporze od 0,01 do 0,5 mmHg/(μL/min).

6. Infrastruktura systemowa i zgodność

1. Pomiar obiektu
   1. Przeniknij system PBS. Uszczelnij system za pomocą zaworu trójdrożnego.
   2. Stosuj kroki nacisku 6, 8, 10, 12, 14 i 16 mmHg.
   3. Nagrywaj P i Q przez 10 minut na każdym kroku. Oblicz średnie wartości z ostatnich 5 minut.
   4. Wykonaj regresję liniową. Interpretuj zbocze jako obiekt systemowy.
2. Walidacja
   1. Powtórz pomiary 3 razy.
   2. Potwierdź, że funkcja systemu jest mniejsza niż 0,2 nL/min/mmHg.
3. Pomiar zgodności
   1. Wprowadź do systemu silikonową rurkę o średnicy 35 cm.
   2. Mierz zgodność z rurkami teflonowym i bez.
   3. Oblicz zmianę objętości metodą^{dyskretnej objętości 14}.
   4. Określ zgodność systemu jako 4 nL/mmHg.
4. Kontrola czułości
   1. Potwierdź, że wykrywalna zgodność systemu przekracza 9,9 nL/mmHg.

7. Enukleacja

1. Uśpiaj myszy z użyciem_CO2 z przepływem 0,7 L/min przez 3 minuty.
   UWAGA: Eutanazja CO₂ musi być zgodna z wytycznymi instytucjonalnymi, aby zapewnić humanitarne efekty końcowe.
2. Rozcinaj mięśnie pozagałkowe i nerwy wzrokowe za pomocą sterylnych narzędzi. Enukleuj gałki oczne.
3. Natychmiast zamontuj jedno oko w uchwytie w temperaturze 35,5 °C.
4. Przeciwległe oko przechowywać w temperaturze 4 °C.
5. Zmierz oba oczy tym samym systemem.

8. Kanulacja

1. Wkładanie igły
   1. Wkłuj igłę przez środkową rogówkę pod kątem 45°.
   2. Przesuń igłę na głębokość 0,3–0,5 mm do przedniej komory.
2. Walidacja
   1. Ustabilizuj system. Potwierdź wahania ciśnienia ≤ 0,4 mmHg przez ostatnie 5 minut.

9. Oczne_{C r}

1. Stabilizuj oko na 8 mmHg przez 30 minut.
2. Stosuj kroki nacisku 6, 8, 10, 12, 14 i 16 mmHg.
3. Zastosuj ostatni krok przy 8 mmHg.
4. Zbieranie danych
   1. Ustaw maksymalny przepływ na 4 μL/min.
   2. Nagrywaj P i Q przez 10 minut na każdym kroku.
5. Analiza
   1. Narysuj krzywe P–T i Q–T. Oblicz wartości średnie z ostatnich 5 minut.
   2. Dopasuj dane do modelu potęgowego²⁷:
      
6. Zdefiniuj C_r (po odejmowaniu obiektu systemowego) jako obiekt wypływu ocznego.
7. Ustaw P_r = 8 mmHg.
8. Zdefiniuj β jako współczynnik nieliniowy.

10. Oczy Φ_r

1. Analizuj krzywe P–T i Q–T podczas przyrostów ciśnienia. Zidentyfikuj wzrost przepływu do _maksimum Q i późniejsze spowolnienie.
2. Oblicz zmianę objętości między t_p a t_max metodą dyskretnej objętości³⁰.
3. Dopasuj dane do zmodyfikowanego równania Friedenwalda³⁰:
   
4. Ustaw P_r = 13 mmHg. Zdefiniuj Φ_r (po odejmowaniu zgodności systemu) jako zgodność oczu Φ_r,oko oraz γ jako parametr materiałowy.

Wyniki

Wydajność zoptymalizowanego systemu pompy strzykawkowej oceniono poprzez porównanie C i φ u 5-miesięcznych myszy z wcześniej opublikowanymi wartościami z badań perfuzji oczu kontrolowanej pod ciśnieniem. Normalność zbiorów danych na Rysunku 2F oceniono za pomocą testu Shapiro–Wilk, a porównania statystyczne przeprowadzono za pomocą dwustronnego parowanego testu Student's t.

Jak pokazano na Rysunku 2A–C, IOP, _...

Dyskusja

Badanie to przedstawia zoptymalizowany system pompy strzykawkowej do szacowania możliwości wypływu i podatności oczu u myszy, dając wartości zgodne z tymi zgłaszanymi przy użyciu systemów perfuzji oczu kontrolowanej ciśnieniowo. Obecne podejście poprawia dokładność pomiarów za pomocą strzykawki, zachowując jednocześnie prosty i przystępny system eksperymentalny. To połączenie udoskonalenia metodologicznego i dostępności może ułatwić szersze wdrożenie w laboratoriach, gdzie bardziej zaawansowane systemy nie są łatwo dostę...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik	1&razy; Bufor PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023
Izofluran	Shenzhen Rewoode Life Sciences Co., Ltd., Chiny	R640
Materiał	100 μ Strzykawka L High Precision	Hamilton	1710
Szkło borokrzemowe	Sutter, Novato, CA	BF100-50-10
Jednorazowa sterylna strzykawka	Fenglin Medical Devices Co., Ltd. Jiangxi, Chiny	10 ml
Czujnik ciśnienia	IcuMedical	PX26-015G
Rurka silikonowa	Runze Fluid Co., Ltd, Nankin, Chiny i nbsp;	Nie ma
Przezroczysta rurka PTFE	Runze Fluid Co., Ltd, Nankin, Chiny i nbsp;	Nie ma
Wyposażenie	Płonący/brązowy wyciągacz pipety	Sutter, Novato, CA	P-97
Mikromanipulator ręczny	Światowe Precyzyjne Przyrządy (WPI)	M3301
Metalowa kąpiel	Biologia bobrów, Suzhou, Chiny	2016C
MicroForge	Laboratorium Instrumentów Naukowych Narishige w Tokio, Japonia	MF830
Młynek mikropipety	MPInstrument Co., Ltd., Wuhan, Chiny	KDG-02
PZMIII Stereo Zoom Mikroskop Lornetkowy	Światowe Precyzyjne Przyrządy (WPI)	PZMIII
Pompa strzykawkowa	Światowe Precyzyjne Przyrządy (WPI)	AL-1000