Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnętrznych wzbogaconych w egzosomy z komórek ssaków zakażonych wirusem dengi typu 2

Summary

Tutaj opisujemy izolację pęcherzyków zewnętrznych wzbogaconych w egzosomy z supernatantu komórek zakażonych wirusem dengi typu 2, po czym następuje charakterystyka integralności pęcherzyków i rozkładu rozmiaru oraz ocena braku wykrywalnego wirusa zakaźnego za pomocą testu płytkowego w określonych warunkach eksperymentalnych.

Abstract

Wzbogacone egzosomami EV to pęcherzyki uwalniane z różnych typów komórek do płynów zewnątrzkomórkowych, takich jak osocze, mocz, ślina, pożywki hodowlane komórkowe oraz inne płyny ustrojowe. Ich średnice wahają się od 30 nm do 150 nm. Są one powiązane z różnymi procesami komórkowymi, w tym komunikacją komórkową i modulacją odporności podczas infekcji. Na podstawie tych efektów zostały wykorzystane do badania patogenezy kilku wirusów. Izolacja wzbogaconych w egzosomy EV od supernatantów komórek zakażonych wirusem jest wyzwaniem przy użyciu obecnych technik oczyszczania. Wynika to głównie z pokrywania się rozmiarów między niektórymi wirusami a EV wzbogaconymi egzosomami. Tutaj naszym celem jest oczyszczenie EV wzbogaconych w egzosomy z supernatantu hodowli komórkowej zakażonego Dengą typu 2. Wzbogacone o egzosomy EV izolowano za pomocą komercyjnego zestawu izolacyjnego egzosomów. Dla izolowanych EV wzbogaconych o egzosomy w tym protokole nie wykryto żadnego wirusa zakaźnego za pomocą testu płytkowego w testowanych warunkach. Oczyszczone EV wzbogacone egzosomami charakteryzowano za pomocą western blottingu do tetraspaninów, analizy śledzenia nanocząstek oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej do potwierdzenia rozmiaru. Wykazaliśmy, że nasze EV wzbogacone w egzosomy są nienaruszone i mieszczą się w normalnym zakresie średnicy egzosomów 30-150 nm. Ogólnie rzecz biorąc, nasz protokół zapewnia niedrogą metodę oczyszczania EV wzbogaconych egzosomami z supernatantu hodowli komórkowej zakażonego wirusem, który może być stosowany do dalszych testów funkcjonalnych.

Introduction

Wzbogacone egzosomami EV to nanowielkości pęcherzyki uwalniane przez każdą komórkę organizmu. Są to podtypy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzenia endocytowego. Wzbogacone o egzosomy EV zostały po raz pierwszy odkryte w podłożu hodowli retikulocytów¹. W ciągu ostatnich kilku dekad EV wzbogacone o egzosomy zostały oczyszczone z kilku płynów ustrojowych, w tym krwi, moczu, śliny, mleka matki, płynów nasiennych oraz płynów owodniowych 2,3,4,5. Ich średnica waha się od 30 nm do 150 nm⁶. Ich uwalnianie do komory zewnątrzkomórkowej następuje poprzez fuzję ciał wielopęcherkowych (MVB) z błoną plazmatyczną komórki. W kontekście infekcji i odpowiedzi immunologicznej, EV wzbogacone w egzosomy są znane z wywoływania specyficznej odpowiedzi u komórek ssaków. Takie reakcje obejmują uwalnianie cytokin lub zmiany podatności na infekcję ^7,8,9.

Zawartość EV wzbogaconych w egzosomy zależy od kilku czynników, przede wszystkim typu i stanu komórki, która je produkuje.^10,11. Dodatkowo, ich treść decyduje także o tym, jaki mają wpływ na naiwne komórki odbiorców. Obecnie stosuje się kilka metod izolowania EV wzbogaconych w egzosomy z płynów biologicznych. Do powszechnych metod należą różnicowa ultrawirówka, wytrącanie, wychwytywanie immunoaffinity, chromatografia wykluczająca wielkość, izolacja magnetyczna oraz izolacja mikrofluidyczna.

Różnicowa ultrawirowanie jest uważane za jedną z najczęściej stosowanych technik^{12, 13, 14}. Metoda oczyszczania ultrawirówki jest kosztowna i wymaga znacznej biegłości technicznej. Ta metoda prowadzi również do znacznej utraty EV z powodu wielu etapów ultrawirowania. Wreszcie, powstałe EV wzbogacone egzosomami nie są wolne od aktywnych cząstek wirusowych ze względu na ich podobne właściwości fenotypowe. To utrudniało oczyszczanie EV wzbogaconych egzosomami z supernatantu komórek zakażonych wirusem. Dlatego ważne jest opracowanie zoptymalizowanego protokołu, który skutecznie obniży poziom wirusa dengi (DENV) do poziomów niewykrywalnych w roztworze EV wzbogaconym o egzosomy, ponieważ wirusy mają podobne rozmiary i gęstości co egzosomy^15,16.

W porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi technikami, protokół ten oferuje kilka zalet, w tym skrócony czas oczyszczania, uzależnienie od niedrogiego i szeroko dostępnego sprzętu laboratoryjnego oraz możliwość izolowania EV wzbogaconych egzosomami bez wykrywalnego żywego zakażenia wirusowego. Dodatkowo, chociaż metody takie jak wirowanie gradientowe gęstości czy izolacja magnetyczna mogą oferować zalety, takie jak zwiększona wydajność i wyższa czystość, wymagają one początkowego etapu ultrawirowania. Celem tego artykułu jest przedstawienie metody izolowania EV wzbogaconych egzosomami od zakażonych supernatantów bez wykrywalnego wirusa zakaźnego za pomocą testu płytkowego w testowanych warunkach.

Protocol

1. Przygotowanie nośników wolnych od egzosomów

1. Do podstawy odbiornika należy podłączyć filtr 0,1 μm, wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC).
2. Aseptycznie wlej na filtr surowicę płodową (FBS) inaktywowaną termicznie i podłącz ją do pompy próżniowej wewnątrz BSC.
3. Powtórz krok 1.2 z przepływem jeszcze dwa razy.
4. Przygotuj kompletne podłoże zawierające 10% potrójnie filtrowanego FBS, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 1% L-glutaminy.
   UWAGA: Metoda potrójnej filtracji stosuje się, aby uniknąć potrzeby używania instrumentów takich jak ultrawirówka.

2. Zakażenie komórkami ssaków wirusem dengi

1. Hodować komórki Vero przez noc w kolbie T75 cm 2 w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C z 5%_CO2.
2. Następnego dnia sprawdź, czy komórka jest zbiegła między 70% a 80% i zainfekuj komórki 0,1 multiplicity of infection (MOI) DENV-2 w 5 mL kompletnego podłoża i inkubuj w 37 °C z 5% CO₂ przez 2 godziny.
3. Po 2 godzinach usuń supernatant i przemyj kolbę 3 razy sterylną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).
4. Dodaj 50 mL kompletnego medium do kolby i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%_CO2 przez 4 dni (tuż przed obserwowaniem efektów cytopatycznych).

3. Oczyszczanie egzosomów oparte na zestawach

1. Przełóż pożywkę komórkową z kolby do stożkowej rurki o pojemności 50 mL i wiruj w 200 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
2. Przełóż medium do nowej stożkowej rurki. Dodaj 125 μL odczynnika wydzielającego EV, a następnie 600 μL żywicy. Zrób wir przez 10 sekund i pozwól mu stać przez 10 minut w BSC w temperaturze pokojowej.
3. Wiruj przez kolejne 10 sekund i wiruj w około 450 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Przelej do BSC, odrzuć supernatant i nałóż 600 μL bufora resuspension do pelletu.
4. Wiruj przez 10 sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
5. Wiruj przez kolejne 10 sekund i wiruj w około 25 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
6. Przelej supernatant do kolumny Filter Spin i wiruj w około 4 500 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Zbierz przepływ zawierający nienaruszone EV wzbogacone egzosomami i przechowuj je w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do użycia.
7. Potwierdź, że wzbogacony egzosomem EV jest wolny od żywego wirusa, wykonując badanie płytki¹⁷.
8. Scharakteryzuj wzbogacony egzosomem EV za pomocą mikroskopii elektronowej do analizy rozmiaru oraz śledzenia nanocząstek dla rozkładu rozmiaru i stężenia¹⁸.

4. Charakterystyka EV wzbogaconego w egzosomy za pomocą western blota

1. Określ stężenie białka wzbogaconego w egzosomy EV za pomocą testów takich jak BCA.
2. Wymieszaj równe ilości roztworu EV wzbogaconego w egzosomy i bufora RIPA i dodaj 4x bufor ładowania LDS (4:1).
3. Oddziel białka EV wzbogacone egzosomami za pomocą żelu Bis-Tris o stężeniu 4-12%.
4. Przenieś białka do błony nitrocelulozowej.
5. Blokuj przez 1 godzinę, używając mleka beztłuszczowego 5% rozpuszczonego w 1 łyżce buforu Tween w temperaturze pokojowej.
6. Rozcieńcz przeciwciała podstawowe za pomocą 5% beztłuszczowego mleka suchego do rozcieńczenia 1:1 1000 i badaj błonę pod kątem białek egzosomów, takich jak CD63 i CD9, w temperaturze 4 °C przez noc.
7. Usuń pierwotne przeciwciało i myj 5 x 5 minut z 1x buforem TBS-Tween na buźce kołyszowej.
8. Rozcieńcz przeciwciało wtórne (anty Rabbit IgG HRP) mlekiem suchym bez tłuszczu do rozcieńczenia 1:5 000 i inkubuj błonę tym roztworem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
9. Usuń przeciwciało wtórne i myj 5 minut z 1 buforem TBS-Tween na buźce kołysowej.
10. Rozwijaj membranę za pomocą odczynnika wykrywającego ECL i wykrywaj sygnały białek za pomocą urządzenia do obrazowania chemiluminescencyjnego.

5. Charakterystyka EV wzbogaconych w egzosomy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

1. Dodaj 5 μL próbek egzosomów do miedzianych siatek o średnicy 200 siatki z formwarem i powłoką węglową oraz pozwól wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.
2. Pomaluj kratkę 1% wodnym octanem uranilu przez 60 sekund i susz na powietrzu.
3. Uchwyć obraz za pomocą TEM przy napięciu 80 kV¹⁸.

Results

Przeanalizowaliśmy izolowany EV wzbogacony w egzosom, opisany w protokole, za pomocą testu płytkowego, aby sprawdzić, czy możemy wykryć aktywne cząstki DENV-2 w mieszance. Jak pokazano na Rysunku 1, w warunkach testowanych nie wykryto blaszek w porównaniu z kontrolą pozytywną. Wyniki te wskazują, że wirus zakaźny znajdował się poniżej progu wykrywalności testu płytkowego. Test płytkowy wykonano w biologicznych potrójnych i technicznych duplikatach. Stężenie b...

Discussion

Najnowsze osiągnięcia w badaniach nad chorobami zakaźnymi wykazały, że EV wzbogacone egzosomami, uwalniane z komórek zakażonych wirusem naiwnych, odgrywają kluczową rolę w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza ^7,8,9. Wzbogacone egzosomami EV mogą albo wzmacniać obronę immunologiczną, promując odpowiednią odpowiedź przeciwwirusową, albo odwrotnie ułatwiać unikanie wirusa odpornościowego poprzez tłumienie mechanizmów o...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przeciwciała powiązane z IgG-HRP przeciwko królikom	Sygnalizacja komórkowa	7074S	Przeciwciało wtórne
CD63	Sygnalizacja komórkowa	52090 LATA	Przeciwciało pierwotne
CD9	Sygnalizacja komórkowa	13174 S	Przeciwciało pierwotne
Zestaw do oczyszczania egzosomów do hodowli komórkowej	Norgen	60600	Zestaw do oczyszczania egzosomów
Wirus dengi 2	ATCC	VR-1584	Wirus
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073	Media kulturowe
EMEM	ATCC	30-2003	Media kulturowe
FEI Talos F200X Transmisyjny Mikroskop Elektronowy	Thermofisher Scientific
Płodowe Eerum Bydło	Neuromika	FBS002	Dodatek medialny
Analizator śledzenia nanocząstek	Particle Metrix
Komórki Vero	ATCC	CCL-81	Linia komórkowa ssaków