Method Article

Protokół dotyczący dysocjacji pojedynczych komórek, sekwencjonowania RNA oraz izolacji komórek i fibroblastów mioepitelowych z starzejących się gruczołów łzowych i ślinowych

DOI:

10.3791/70441

⸱

April 24th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę dysocjacji starzejących się gruczołów łzowych myszy w celu uzyskania żywotnych pojedynczych komórek do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Sekwencyjne trawienie enzymatyczne i delikatne traktowanie zachowują integralność komórek, dając wysokiej jakości zawiesiny odpowiednie do izolacji specyficznej dla typu komórki oraz analizy transkryptomicznej zmian związanych ze starzeniem się w populacjach gruczołów łzowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Starzenie się gruczołu łzowego (LG) wiąże się ze zmniejszoną wydzielaniem łez i przewlekłym stanem zapalnym, co przyczynia się do choroby suchego oka. Zmiany LG związane z wiekiem obejmują infiltrację komórek odpornościowych, uszkodzenia komórek, gromadzenie lipidów w komórkach acinkowych, osadzanie macierzy zewnątrzkomórkowej oraz rozszerzenie przewodów. Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) stanowi skuteczne podejście do profilowania heterogeniczności komórkowej i zmian transkrypcyjnych podczas starzenia się; jednak generowanie żywotnych zawiesin pojedynczych komórek z starzejącej się tkanki LG jest technicznie trudne ze względu na zwiększoną fibrozę, kruchość komórkową i nagromadzenie lipidów. Badanie przedstawia zoptymalizowany, powtarzalny protokół efektywnej dysocjacji starzejących się mysich LG oraz izolacji wielu typów komórek, odpowiedni do dalszej analizy scRNA-seq. Co ważne, protokół ten ma zastosowanie także do młodych gruczołów łzowych, spojówek i innych tkanek zewnętrznych. Workflow wykorzystuje strategię dysocjacji enzymatycznej krok po kroku, wykorzystując kolagenazę IV, dyspazę II i DNazę I do początkowego trawienia tkanek, następnie Accutazę do dysocjacji pozostałych klastrów komórkowych oraz końcowe leczenie DNazą I w celu uzyskania czystej zawiesiny pojedynczej komórki. Aby zminimalizować uszkodzenia komórek, całe wyroby plastyczne są wstępnie pokrywane PBS zawierającym albuminę surowicy bydlęcej, a przetwarzanie tkanek odbywa się w kontrolowanych warunkach temperatury i mieszania. Liza czerwonych krwinek i sekwencyjna filtracja przez kilka sitek dodatkowo poprawiają czystość komórek. Izolacja specyficzna dla typu komórki jest osiągana za pomocą linii myszy reportera połączonych z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS). Korzystając z myszy Acta2 GFP i PdgfraEGFP, z powodzeniem wyizolowaliśmy odpowiednio komórki mioepitelowe i fibroblasty, po immunobarwieniu przeciwciałem EpCAM. FACS umożliwił rozdzielenie populacji mioepithelium EpCAM⁺/αSMA⁺, podczas gdy komórki EGFP⁺ mysówPdgfra EGFPreprezentowały populację fibroblastów. Protokół ten zapewnia wysokiej jakości, żywotne zawiesiny jednokomórkowe z postarzanych LG i może być łatwo adaptowany do innych tkanek włóknistych lub starzejących się egzokrinnymi wymagającymi delikatnej dysocjacji i ukierunkowanej izolacji komórek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gruczoł łzowy (LG) to gruczoł tubuloacinarny z zewnątrz dołnych odpowiedzialny za wydzielanie warstwy wodnej filmu łzowego. Przez całe życie powierzchnia rogówki i LG są narażone na infekcje bakteryjne i wirusowe, które mogą prowadzić do systemowych utrat komórek nabłonkowych, indukcji przewlekłych reakcji zapalnych, infiltracji komórek odpornościowych do LG oraz brakiem regeneracji. Starzenie się wiąże ze wzrostem częstości przewlekłych chorób zapalnych1. Wśród nich choroba suchego oka (DED) jest jedną z dziesięciu najczęstszych przyczyn upośledzenia wzroku na świecie i stanowi główny czynnik zmniejszający niezależność, mobilność oraz codzienne funkcjonowanie u osób starszych2. Główną przyczyną DED jest dysfunkcja LG3.

Wraz z wiekiem mysz i ludzki LG przechodzą wyraźne zmiany strukturalne i funkcjonalne, w tym zanik komórek acnatowych, rozszerzenie przewodów, infiltrację komórek odpornościowych, włóknienie oraz osadzanie lipidów 4,5,6,7. Te zmiany zwyrodnieniowe towarzyszą również przewlekłemu zapaleniu LG oraz włóknieniu tkanek 3,5,8,9. Pomimo wyraźnego związku między starzeniem a patologią LG, molekularne i komórkowe mechanizmy napędzające te zmiany pozostają słabo poznane.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek umożliwia kompleksowe profilowanie populacji komórkowych i ich zmian transkrypcyjnych w wieku10 lat. Takie podejście pozwala na bezstronną identyfikację różnych typów i stanów komórek w gruczole łzowym, ujawniając, jak starzenie się wpływa na profile ekspresji genów, infiltrację komórek odpornościowych oraz interakcje nadomkowo-mezenchymalne.

Obecnie dostępnych jest wiele metod dysocjacji tkanek, w tym metoda dysocjacjimechanicznej 11 oraz protokoły polegające na gorącym trawieniu enzymatycznym w temperaturze 37 °C z enzymami takimi jak kolagenaza, dezaza czy trypsyna12. Opisano różne strategie dysocjacji dla szerokiego zakresu tkanek, w tym wątroby, płuc, nerek, serc oraz wielu typów guzów13, 14, 15. Jednak przygotowanie żywotnych zawiesin jednokomórkowych ze starzejącej się tkanki gruczołów łzowych pozostaje technicznie trudne ze względu na zwiększoną fibrozę i kruchość komórkową. Ponadto, jak już wcześniej informowaliśmy, odzyskiwanie delikatnych komórek acjarowych może być wyzwaniem, ponieważ zmiany przepuszczalności błony związane z dysocjacją mogą zwiększać uwalnianie otoczonego RNA z tych dużych, wydzielniczych komórek, przyczyniając się do powstawania sygnału tła w kolejnych zbiorach danych pojedynczych komórek16. Chociaż kilka badań wykazało atlasy scRNA-seq starzejących się gruczołów łzowych, jakość tych zbiorów danych była ograniczona przez metody dysocjacji suboptymalnej, co skutkowało niższą wydajnością komórek nabłonkowych niż populacji stromalnych. Przedstawiamy tutaj szczegółowy, zoptymalizowany protokół efektywnej dysocjacji starzejącej się myszy LG oraz izolacji odrębnych populacji komórek do dalszych analiz scRNA-seq oraz RNA-seq (Rysunek 1). To podejście stanowi potężne narzędzie do badania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw związanych z wiekiem dysfunkcji gruczołów łzowych.

Protokół umożliwia generowanie wysokiej jakości, żywotnych zawiesin pojedynczych komórek z starzejących się gruczołów łzowych, zapewniając wiarygodną podstawę do kompleksowych analiz transkryptomicznych. Umożliwia szczegółową identyfikację i molekularną charakterystykę różnorodnych populacji komórek, w tym komórek mioepithelalnych, fibroblastów oraz innych typów komórek nabłonkowych i stromalnych, które ulegają zmianom związanym z wiekiem. Zoptymalizowany sposób pracy zachowuje integralność komórek i minimalizuje artefakty transkrypcyjne wywołane stresem, zapewniając dokładną reprezentację stanów komórkowych in vivo. Ponadto metodologia ta jest szeroko stosowalna i może być dostosowana do innych gruczołów egzokrinnych lub tkanek fibrotycznych, gdzie delikatna dysocjacja tkanek i precyzyjna izolacja różnych populacji komórek są kluczowe dla dalszych badań pojedynczych komórek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) w Instytucie Badawczym Scripps (protokół nr 08-0123; zatwierdzony 29 sierpnia 2023). Opieka nad zwierzętami w Instytucie Badawczym Scripps posiada akredytację Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALAC). Myszy były utrzymywane w standardowym cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności, z dodatkowym podawaniem jedzenia i wody. Do eksperymentów wykorzystywano transgeniczne linie myszy PdgfraEGFP i Acta2GFP . Szczegółowe informacje o liniach myszy znajdują się w sekcji "Tabela materiałów".

1. Ogólne rozważania

  1. Przestrzegaj Uniwersalnych Środków OstrożnościNIH 17 przy obsłudze materiałów biologicznie niebezpiecznych i tkanek zwierzęcych. Wykonuj całą pracę ze zwierzętami zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IACUC oraz wyznaczonymi poziomami bezpieczeństwa biologicznego zwierząt.
  2. Przestrzegaj standardowych praktyk bezpieczeństwa laboratoryjnego, unikając pipetowania ust, minimalizując użycie ostrych przedmiotów, używając szafki bezpieczeństwa biologicznego do procedur wytwarzających aerozole, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, utylizując ostre przedmioty w pojemnikach odpornych na przebicie oraz odpowiednio oznakując i dekontaminując wszystkie odpady biologicznie niebezpieczne przed ich utylizacją.
  3. Rutynowo odkażaj powierzchnie robocze i sprzęt za pomocą odpowiednich środków dezynfekujących, np. wybielacza 10%.
  4. Wszystkie etapy wirowania wykonuj w temperaturze 4 °C w schłodzonej i chłodzonej wirówce, aby zachować żywotność komórek i zminimalizować stres wywołany temperaturą.
  5. Optymalizuj ustawienia cytometru przepływowego i sortera komórek dla konkretnej konfiguracji instrumentu oraz dostosowuj parametry dla każdego sprzężenia przeciwciało-fluorofor, używając odpowiednich próbek kontrolnych. Używaj tego samego cytometru i instrumentu sortującego z stałymi, zoptymalizowanymi ustawieniami przez cały cykl eksperymentalny, aby zminimalizować zmienność.
  6. Przygotuj wybrane rozwiązania nawet jeden dzień wcześniej i odpowiednio przechowuj do czasu użycia. Przygotuj wszystkie roztwory w warunkach sterylnych w szafce bioasekuracji.
  7. Trzymaj roztwory zawierająceCa 2+/Mg 2+ oddzielnie od buforów zawierających EDTA, aby zapobiec chelatacji podczas etapów enzymatycznych. Wszystkie odczynniki potrzebne do tej procedury są przedstawione w Tabeli Materiałów.

2. Plastik

  1. W warunkach sterylnych przed powlekaniem należy nakładać miski, rurki i strzykawki z 1x PBS + 1% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Aspiruj i utrzymuj wszystko sterylne do użycia.
  2. Końcówki pipet przed nałożeniem warstwy. Aspiruj i wydajuj 1x PBS + 1% BSA trzy razy każdą końcówką, aby pokryć wewnętrzną powierzchnię. Włóż powlekane końcówki z powrotem do sterylnego pudełka i pozwól im wyschnąć przez noc w sterylnym inkubatorze. Używaj tych wcześniej powlekanych końcówek następnego dnia podczas procedury izolacji komórek.

3. Roztwory i bufory

  1. Zapas DNazy I (5 mg/mL)
    1. Przygotuj 150 mM NaCl z 5M NaCl i przefiltruj roztwór sterylnie.
    2. Dodaj 1 M CaCl₂ do przefiltrowanego roztworu NaCl o pojemności 150 mM, aby uzyskać końcowe stężenie 5 mM CaCl₂.
    3. Ponownie zawiesi 100 mg DNazy I w 20 ml buforu 150 mM NaCl / 5 mM CaCl₂, aby uzyskać roztwór zapasowy DNazy I o stężeniu 5 mg/mL.
    4. Przygotuj alikwoty o pojemności 500 μL i przechowuj je w temperaturze −20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy. Unikaj powtarzających się cykli zamrożenia i rozmrażania, aby zapobiec utracie aktywności enzymów.
  2. Ośrodek trawienia
    1. Dzień przed eksperymentem przygotuj mieszankę średniej bazy, mieszając DMEM/F12 z 0,5% BSA i filtruj ją.
    2. Dodaj 1M HEPES i 1M CaCl₂ do podstawowego medium DMEM/F12 / 0,5% BSA, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 15 mM i 3 mM.
    3. Dodaj wszystkie następujące enzymy tuż przed użyciem: kolagenaza IV (1 mg/mL; 125 U/mL), Dispaza II (2,5 mg/mL; 1,25 U/mL) oraz DNaza I (20 U/mL; 0,05 mg/mL z zapasu 5 mg/mL).
  3. Medium blokujące 1 (BM1)
    1. Dodaj 1M HEPES i 0,5M EDTA do 1x HBSS, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 15 mM i 3 mM.
  4. Blokujące medium 2 (BM2)
    1. Dodaj FBS i 1M HEPES do DMEM/F12, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 10% i 15 mM.
  5. Medium do leczenia DNazą
    1. Dzień przed eksperymentem przygotuj podłoże bazowe, mieszając 1x HBSS z 0,5% BSA i filtruj go.
    2. Dodaj 1M HEPES, 1M CaCl₂ i 1M MgCl₂ do podstawowego medium 1x HBSS / 0,5% BSA, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 10 mM, 1,5 mM i 2 mM.
    3. Tuż przed użyciem dodaj DNazę I (200 U/mL; 0,5 mg/mL z wywaru 5 mg/mL) do przygotowanej mieszanki.
  6. Blokujący Medium 3 (BM3)
    1. Użyj tego samego filtrowanego medium bazowego 1x HBSS / 0,5% BSA i dodaj 1M HEPES oraz 0,5M EDTA, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 10 mM i 1 mM.
  7. Blokujący Medium 4 (BM4)
    1. Użyj tego samego filtrowanego medium bazowego 1x HBSS / 0,5% BSA i dodaj 1M HEPES, aby uzyskać końcowe stężenia 10 mM.
  8. Bufor FACS
    1. Dzień przed eksperymentem przygotuj podłoże bazowe, mieszając 1x DPBS z 0,5% BSA i filtruj go.
    2. Dodaj 1M HEPES i 0,5M EDTA do 1x DPBS / 0,5% BSA, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 25 mM i 1 mM.
  9. Medium dla scRNAseq (MSC)
    1. Dzień przed eksperymentem przygotuj podłoże, mieszając 1x DPBS z 0,4% BSA i filtruj go.

4. Pobieranie tkanek i mikrosekcja (~ 40 - 50 min)

  1. Znieczulenie myszy izofluranem i uśpienie przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi IACUC.
  2. Użyj cienkich kleszczy i nożyczek, aby naciąć skórę między okiem a uchem i delikatnie ją cofnąć, odsłaniając gruczoł łzowy.
  3. Aby odizolować gruczoł, lekko go unieś za pomocą tępych szczypiec i ostrożnie oddzielić otaczającą tkankę łączną, delikatnie odsuwając ją okrężnym ruchem. Granice gruczołu łzowego są wyraźnie widoczne, co pozwala na łatwe oddzielenie od sąsiednich tkanek, w tym gruczołu przyusznego.
  4. Przenieś gruczoł łzowy (każdy waży około 10-25 mg, w zależności od wagi myszy, płci i wieku) do 35 mm szalki Petriego zawierającej 2 mL zimnego 1x PBS na lodzie. Pod mikroskopem rozcinającym usuń pozostałą tłuszczową i ostrożnie odklej torebkę tkanki łącznej za pomocą dwóch kleszczy.
  5. Potwierdź znakowanie komórek, badając mały fragment tkanki pod mikroskopem fluorescencyjnym i potwierdzając oczekiwany sygnał raportowy lub fluorescencjonalny, zanim przejdziesz do trawienia enzymatycznego.
  6. Umieść sterylną 35 mm szalkę Petriego na lodzie i dodaj 800-1000 μL zimnego 1x PBS (objętość dostosowana do rozmiaru gruczołu) do środka naczynia. Przenieś jeden gruczoł łzowy do 1x PBS.
  7. Używając dwóch sterylnych skalpeli, drobno pokrój gruczoł na małe fragmenty, aż uzyska miękką, pastowatą konsystencję. Upewnij się, że fragmenty tkanek pozostają zanurzone w PBS przez cały proces mielenia, ale nie pozwól im swobodnie unosić się po misce.
  8. Zbieraj fragmenty tkanek po jednej stronie naczynia, aspiruj resztki PBS i myj fragmenty 1 ml świeżego, zimnego PBS.
  9. Przełóż wymyte fragmenty tkanki do płytki z 6 dołkami zawierającą 2 mL podgrzanego podłoża trawiennego na każdy dołek. Trzymaj talerz na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną przetworzone.

5. Pierwsze trawienie enzymatyczne (~1,5 - 2 godziny)

  1. Inkubuj talerz w wstrząsającej kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C, 60 obr./min przez 30 minut.
  2. Delikatnie trituruj tkankę 15 razy za pomocą szerokiego grotu o pojemności 1 mL, a następnie wróć płytę do wstrząsającej kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C, 60 obr./min na dodatkowe 30 minut.
  3. Delikatnie tryturuj próbkę 10 razy za pomocą zwykłej końcówki 1 mL, a następnie wróć płytę do wstrząsanej kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C, 60 obr./min na dodatkowe 30 minut.
  4. Delikatnie tryturuj próbkę 10 razy i przelej zawiesinę komórkową do 2 mL rurek mikrowirówek Dolphin.
  5. Dodaj 1 mL zimnego BM1 do każdego dołka płyty, aby zebrać pozostałe pożywki trawiennicze zawierające pozostałe komórki. Połóż talerz na lodzie do następnego kroku.
    UWAGA: Jeśli na tym etapie nadal obserwuje się duże skupiska komórek lub fragmenty tkanek, przedłuż każdy krok inkubacji o dodatkowe 10-20 minut. Nie przekraczaj wskazanej liczby przejść trituracji (maksymalnie 10-15 łagodnych przejść), ponieważ dodatkowe obciążenia mechaniczne mogą zagrozić żywotności komórek.

6. Zakończenie aktywności enzymatycznej i pierwotnych płukań (~ 15 min)

  1. Wiruj rurki zawierające zawiesinę ogniwa w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Usuń nadmiar. Przenieś BM1 z każdej dołki płytki początkowej (zawierającej komórki resztkowe) do odpowiedniej rurki i delikatnie zawiesz osadki komórkowe.
  3. Każdą jamkę przepłucz dodatkowymi 600 μL zimnego BM1 i połącz ją z odpowiednią rurką, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki.
  4. Delikatnie ponownie zawiesić zawiesinę komórkową, ponownie wirować w 300 × g przez 5 minut w 4 °C i wyrzucić supernatant.

7. Leczenie akcutazą i DNazą (~ 30 - 35 min)

  1. Dodaj 1 ml Accutazy do pelletów komórkowych i delikatnie je zawiesz. Inkubuj tubkę tylko przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C i 60 obr./min.
    UWAGA: Podczas inkubacji połóż rurkę na boku, aby zapobiec osadzaniu się komórek i przyklejaniu się do dna.
  2. Delikatnie trituruj 10 razy za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 mL.
  3. Dodaj 1 ml zimnego BM2, aby zakończyć reakcję enzymatyczną przez rozcieńczenie Accutazy.
  4. Wirówka w 300 × g przez 5 minut w 4 °C i odrzuca supernatant.
  5. Ponownie zawiesij komórki w pożywce do leczenia DNazą, wypełniając rurkę aż do góry.
  6. Inkubuj przez 10 minut w RT, delikatnie zawieszając raz po 5 minutach.
  7. Jednocześnie wstępnie zwilż sitko ogniwa 70 μm z 1 mL BM3 umieszczone nad stożkową rurką o pojemności 15 mL.
  8. Przenieś zawiesinę komórki na sitko.
  9. Przepłucz oryginalną probówkę 1 ml BM3 i przelej płukanie na to samo sitko.
  10. Przemyj sitko dodatkowymi 5 ml BM3.

8. Liczenie komórek i sprawdzanie żywotności

  1. Weź 10 μL zawiesina z filtrowanych komórek w BM3 i wymieszaj z 10 μL Trypan Blue. Określ stężenie i żywotność komórek za pomocą wykluczenia Trypan Blue i ilościowo zlicz ręcznie lub za pomocą automatycznego licznika komórek (np. Countess 3 Automated Cell Counter). Kontynuuj dalej tylko wtedy, gdy wykonalność spełnia wymagany próg dla dalszych zastosowań (zazwyczaj ≥70-80%).
    UWAGA: Uwzględnij całkowitą objętość ~7-9 mL w probówce 15 mL przy obliczaniu wydajności.
  2. Postępuj zgodnie z wnioskiem końcowym. Dla scRNA-seq kontynuuj do Sekcji 9. Dla sortowania komórek opartych na cytometrii przepływowej, przejdź do Sekcji 10.
    UWAGA: Workflow scRNA-seq obejmuje lizę RBC oraz usuwanie magnetycznych martwych komórek, aby zmniejszyć ilość zanieczyszczeń i otaczającego RNA oraz poprawić jakość danych. Jednak te kroki mogą zwalniać reprezentację komórek, preferencyjnie oddziałując na populacje nabłonka delikatnego lub rzadkiego, w tym komórki acynarne. W przypadku sortowania opartego na cytometrii przepływowej te kroki zostały pominięte, aby zmaksymalizować odzyskanie i zachować epitopy powierzchni komórki. Wybór workflow powinien być zatem kierowany celami eksperymentalnymi, priorytetowo traktując jakość danych dla scRNA-seq lub odzyskiwania komórek oraz opłacalność do sortowania i dalszych aplikacji.

9. Przygotowanie komórek do scRNA-seq (~ 1 - 1,5 h)

  1. Przygotuj 1x roztwór RBC, rekonstytuując 10x roztworu z wodą miliQ.
  2. Wiruj probówkę 15 mL zawierającą zawiesinę ogniwa w stężeniu 400 × g przez 5 minut w 4 °C i wyrzuć supernatant.
  3. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w buforze 1x RBC o pojemności 5 mL i inkubuj przez 5 minut w RT.
  4. Ponownie wiruj w 300 × g przez 5 minut w 4 °C i wyrzuć supernatant.
  5. Ponownie zawiesij granulkę komórkową w 2 mL zimnego BM4.
  6. Weź 10 μL przefiltrowanej zawiesiny komórkowej w BM4 i wymieszaj z 10 μL Trypan Blue, aby ocenić stężenie i żywotność komórek.
  7. Wstępnie zwilż sitko MACS o pojemności 30 μm 1 mL 1x HBSS i przefiltruj zawiesinę ogniwa przez sitko do rurki 15 mL.
  8. Przepłucz poprzednią probówkę 2 mL zimnego BM4 i przepłukaj przez to samo sitko do probówki 15 mL.
  9. Przemyj sitko dodatkowym 10 ml zimnego BM4.
  10. Wiruj probówkę 15 mL w dawce 400 × g przez 5 minut w 4 °C i całkowicie usuń supernatant.
  11. Delikatnie ponownie zawiesić pellet w 100 μL mikrogranulek MACS i inkubować przez 15 minut w RT.
  12. Tymczasem przygotuj 1x bufora wiążącego (BB) z zestawu do usuwania martwych komórek, używając sterylnej podwójnie destylowanej wody.
  13. Przemyj kolumnę MACS MS 500 μL 1x BB, aby wyrównać równowagę.
  14. Dodaj 400 μL BB do próbki, ponownie zawiesij komórki mikrokulkami i nałóż całą objętość na zrównoważoną kolumnę MS. Zbierz przepływ do probówki o pojemności 15 mL.
  15. Przepłucz kolumnę cztery razy po 500 μL BB, zbierając wszystkie frakcje przepływu.
  16. Wiruj zebrany przepływ w dawce 400 × g przez 5 minut w 4 °C i wyrzucaj supernatant.
  17. Ponownie zawiesić ogniwa w 400 μL buforu MSC i przenieść zawiesinę do rurki 1,5 mL.
  18. Przepłucz poprzednią probówkę buforem MSC 700 μL i zgromadzę płukanie z próbką.
  19. Wiruj w 400 × g przez 5 minut w 4 °C i wyrzuć supernatant.
  20. Ponownie zawiesić pellet komórki w buforze MSC za pomocą szerokiego grotu do końcowej objętości około 1,5 mL.
  21. Ponownie wiruj w 400 × g przez 5 minut w 4 °C i wyrzuć supernatant.
  22. Zostaw ~100 μL supernatantu, delikatnie ponownie zawiesij pellet i ponownie policz komórki, mieszając 6 μL z 6 μL Trypan Blue.
  23. Dostosuj końcową objętość za pomocą buforu MSC, aby uzyskać 700-1200 komórek/μL i ponownie przelicz komórki, aby potwierdzić stężenie komórek.
  24. Upewnij się, że żywotność komórek po lizie RBC i usunięciu martwych komórek wynosi ≥ 70% (zazwyczaj 70-95%) przed załadowaniem do przetwarzania 10x chromu (Chromium Single Cell 3' Solution V3).
  25. Zastosowanie podstawowych kryteriów kontroli jakości scRNA-seq: nUMI > 500, ngenu > 200 oraz frakcji genów mitochondrialnych <15%. Stosuj permisywny próg mitochondrialny (15%), aby zachować populacje nabłonkowe o wyższej aktywności metabolycznej. Uwzględnić tylko komórki spełniające wszystkie kryteria kontroli jakości w analizach dalszych.
    UWAGA: Te progi QC reprezentują przykładowe wartości pochodzące z naszych zbiorów danych (Rysunek uzupełniający 1) i zostały przedstawione w naszej poprzedniej publikacji18.

10. Przygotowanie komórek do sortowania komórek za pomocą cytometrii przepływowej (~ 1 - 1,5 h)

  1. Do izolacji MEC i fibroblastów opartej na cytometrii przepływowej zastosowano odpowiednio linie zgłaszające myszy PdgfraEGFP i Acta2 GFP, aby umożliwić precyzyjną identyfikację każdej populacji.
  2. Wiruj probówkę 15 mL z zawiesiną komórkową w stężeniu 400 × g przez 5 minut w 4 °C i wyrzucaj supernatant.
  3. Ponownie zawiesić osad komórkowy w zimnym buforze FACS do końcowego stężenia 5 x 10⁵ do 2 x 10komórek 6 komórek na 100 μL.
  4. Przygotuj środki kontrolne wymagane do kompensacji FACS: kontrola negatywna – niezabarwione komórki myszy typu dzikiego, kontrola fluorescencji tła – niebarwione komórki myszy Acta2GFP i PdgfraEGFP , kontrola pojedynczego barwienia – komórki myszy typu dzikiego barwione indywidualnie każdym przeciwciałem użytym w eksperymencie.
    UWAGA: Dla każdej próbki kontrolnej należy użyć co najmniej 1 × 10⁵ komórek zawieszonych w 100 μL buforu FACS.
  5. Dodaj FcBlock (1:100) i inkubuj przez 5 minut na lodzie.
  6. Dodaj przeciwciało monoklonalne CD326 (EpCAM) – APC (1:100) lub przeciwciało monoklonalne CD140a (PDGFRα) (1:100). Inkubuj przez 45 minut na lodzie, chroniony przed światłem.
  7. Delikatnie zawieszaj komórki co 15 minut podczas inkubacji przeciwciał.
  8. Napełnij każdą probówkę do końca zimnym buforem FACS i wiruj w 300 × g przez 5 minut w 4 °C.
  9. Przygotuj rozwiązanie robocze FxCycle (1:1000) w buforze FACS.
  10. Próbki ponownie zawiesz w 1 mL i kontroluj w 500 μL zimnego bufora FACS za pomocą FxCycle.
  11. Przełóż wszystkie próbki do probówek FACS i trzymaj je na lodzie, chronione przed światłem.
  12. Natychmiast przejdź do Rdzenia Cytometrii Przepływowej do sortowania. Zbieraj posortowane komórki do buforu FACS, pożywki hodowlanej, buforu lizy lub RNAlater, w zależności od dalszych zastosowań.
    UWAGA: Ustawienia instrumentów (np. rozmiar i ciśnienie dyszy) oraz częstotliwość zdarzeń zależą od konfiguracji sortera i populacji komórek docelowych; Dlatego zaleca się wstępny test pilotażowy w celu określenia optymalnych parametrów dla każdego eksperymentu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysocjacja starzejących się gruczołów egzokrynowych jest trudna ze względu na nagromadzenie lipidów i rozległe osadzanie ECM. Stare gruczoły wykazują wyraźną infiltrację limfocytów oraz wyraźne rozszerzenie przewodów z materiałem śródświatłowym, co odzwierciedla zmiany strukturalne i zapalne komplikujące dysocjację tkanek. Gruczoł łzowy to narząd obozkrywny składający się z trzech głównych typów komórek nabłonkowych: komórek akinarnych, przewodowych i komórek mioepithelalnych. Komórki acinne produkują wodne i białkowe sk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj zoptymalizowaliśmy i oceniliśmy znacząco ulepszony protokół generowania zawiesin pojedynczych komórek z tkanek egzokrinnych, koncentrując się na gruczole łzowym. Stosując to podejście, wygenerowaliśmy czyste, wysokiej jakości zawiesiny pojedynczolowe zarówno ze starych, jak i młodych LG, odpowiednie do sekwencjonowania pojedynczych komórek i innych zastosowań w dalszej fazie rozwoju.

Pomimo dostępności licznych protokołów dysocjacji tkanek, konieczne było ich zmodyfikowanie i optymaliza...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te zostały wsparte przez National Institute of Health, National Eye Institute (NEI), USA, granty 5R01EY026202, R01EY035333; granty National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01DE031044, 2R01DE014756 oraz grant National Cancer Institute (NCI) 5R01CA271500.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
materiałowy
BSA Sigma-AldrichA4919
CaCl2 (1  Rozwiązanie M)BioVisionB1010-100
Kolagenaza IVSigma-AldrichC5138
Zestaw do usuwania martwych komórekMiltenyi biotec130-090-101
Zestaw do usuwania martwych komórekMiltenyi biotec130-090-101
Dispase IIRocheC756V28
DNaza ISigma-AldrichDN25-100MG
DPBS Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-144
Serum płodowe bydłe, ultra-niskie IgGGibco# 16250078
Zrównoważony Roztwór Soli Hanka (HBSS)Corning (Thermo Fisher Scientific)21-022-CV
HEPES (1  Rozwiązanie M)Sigma-AldrichH0887
Roztwór izofluranowyCovertus# 11695067772
MACS® SmartStrainers (30 & micro; m)Miltenyi biotec130-098-458
MACS® SmartStrainers (70 & mikro; m)Miltenyi biotec130-110-916
Średni/F12 (DMEM/F12)MilliporeDF-042-B
MgCl2 1MSigma-AldrichM1028-100ML
MS ColumnsMiltenyi biotec130-042-201
NaCl (akcje 5M)Invitrogen&handel;AM9759
Tabletki soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS)Sigma-AldrichP8920-500ML
Roztwór do lizy czerwonych krwinek (10& razy;)Miltenyi biotec130-094-183
StemPro Accutase Gibco, Thermo Fisher ScientificA1110501
Roztwór Trypan Blue 0,4%Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061
Ultra-czysta EDTA (0,5M, pH 8,0)Invitrogen15575020
przeciwciała
Przeciwciało monoklonalne CD140a (PDGFRA) (APA5), APC-eFluor ™ 780, Rat / IgG2a, kappaeBioscience47-1401-82; RRID:AB_2784706
FcBlock (bloker CD16/CD32 Fc)BD Biosciences 553141; RRID:AB_394656
FxCycle™ Violet StainThermo Fisher ScientificF10347
Przeciwciało monoklonalne Rat CD326 (EpCAM)-APC (G8.8), szczurze IgG2a, kappaeBioscience17-579182; RRID:AB_2716944
myszy
Acta2GFP  Miły prezent od dr. Ivo KalajzicaPMID: 18571490
PdgfraEGFP  - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/JLaboratorium JacksonaRRID:IMSR_JAX:007669
Sprzęt
Invitrogen&handel;   Hrabina i handel; 3 Automatyczny licznik komórekFisher ScientificA49862; RRID:SCR_026963

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guo, J., et al. Aging and aging-related diseases: from molecular mechanisms to interventions and treatments. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 391(2022).
  2. Zhang, X., Wang, L., Zheng, Y., Deng, L., Huang, X. Prevalence of dry eye disease in the elderly: A protocol of systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 99 (37), e22234(2020).
  3. Donthineni, P. R., et al. Aqueous-deficient dry eye disease: Preferred practice pattern guidelines on clinical approach, diagnosis, and management. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1332-1347 (2023).
  4. Yuksel, S., et al. Aging Affects Lipid Homeostasis in Lacrimal Glands by Upregulating Lipogenesis and Changing Its Specificity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 1(2025).
  5. Galletti, J. G., et al. Ectopic lymphoid structures in the aged lacrimal glands. Clin Immunol. 248, 109251(2023).
  6. Delcroix, V., et al. Lacrimal Gland Epithelial Cells Shape Immune Responses through the Modulation of Inflammasomes and Lipid Metabolism. Int J Mol Sci. 24 (5), 4309(2023).
  7. Mauduit, O., et al. Spatial transcriptomics of the lacrimal gland features macrophage activity and epithelium metabolism as key alterations during chronic inflammation. Front Immunol. 13, 1011125(2022).
  8. Prasad, D., et al. Assessing the Independent and Combined Effects of Hyperosmolarity and Inflammatory Stress on Human Corneal Epithelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 47(2025).
  9. Scholand, K. K., et al. Heterochronic Parabiosis Causes Dacryoadenitis in Young Lacrimal Glands. Int J Mol Sci. 24 (5), 4897(2023).
  10. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 13922(2025).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  12. Jankelow, A., Almeida-Porada, G., Atala, A., Sawyer, S. W., Porada, C. D. Recent advancements in tissue dissociation techniques for cell manufacturing single-cell analysis and downstream processing. Stem Cells Transl Med. 14 (11), szaf055(2025).
  13. Duong, A., et al. A Rapid Human Lung Tissue Dissociation Protocol Maximizing Cell Yield and Minimizing Cellular Stress. Am J Respir Cell Mol Biol. 71 (5), 509-518 (2024).
  14. Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. Single-Nucleus RNA-Sequencing Profiling of Mouse Lung: Reduced Dissociation Bias and Improved Rare Cell-Type Detection Compared with Single-Cell RNA Sequencing. Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).
  15. Ikeuchi, T., et al. Dissociation of murine oral mucosal tissues for single cell applications. J Immunol Methods. 525, 113605(2024).
  16. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  17. Kahwaji, N. Universal Precautions. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2024).
  18. Delcroix, V., et al. The First Transcriptomic Atlas of the Adult Lacrimal Gland Reveals Epithelial Complexity and Identifies Novel Progenitor Cells in Mice. Cells. 12 (10), 1435(2023).
  19. Mauduit, O., et al. A closer look into the cellular and molecular biology of myoepithelial cells across various exocrine glands. Ocul Surf. 31, 63-80 (2024).
  20. Zyrianova, T., Basova, L. V., Makarenkova, H. P. Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands. J Vis Exp. (148), e59602(2019).
  21. Montanari, M., et al. Automated-Mechanical Procedure Compared to Gentle Enzymatic Tissue Dissociation in Cell Function Studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  22. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. J Immunol Methods. 425, 69-78 (2015).
  23. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neurosci. 17 (1), 30(2016).
  26. Lai, T. Y., et al. Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of Fas receptor and Fas ligand. Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell RNA SequencingLacrimal Gland DissociationMyoepithelial Cell IsolationFibroblast IsolationFlow CytometryAged Lacrimal GlandTissue DigestionCell SortingEpCAM ImmunostainingPDGFR Alpha Fibroblasts

Related Articles