Synteza, enkapsulacja hemoglobiny i biortogonalna PEGylacja w hierarchicznie porowatych nanocząstkach UiO-66 do zastosowań dostarczania tlenu

Podsumowanie

Protokół ten szczegółowo opisuje syntezę, enkapsulację hemoglobiny oraz powierzchniową PEGylację hierarchicznie porowatych nanocząstek UiO-66 zaprojektowanych do dostarczania tlenu. Procedura łączy inżynierię defektów z koniugacją biortogonalną wspieraną przez odkształcenie, aby uzyskać wysoce przepuszczalne i fizjologicznie stabilne nośniki odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Streszczenie

Nośniki tlenu na bazie hemoglobiny (HBOC) są ważną platformą dostarczania tlenu, łagodząc hipoksję w kilku kontekstach biomedycznych. Jednak wolna hemoglobina (Hb) jest niestabilna i aktywna naczynia poza czerwonymi krwinkami. Przedstawiamy tutaj powtarzalny, skalowalny protokół krok po kroku do wytwarzania hierarchicznie porowatych nanocząstek UiO-66 (NP HP-UiO-66), które otoczają Hb i są stabilizowane przez powłoki bioortogonalnego glikolu polietylenowego (PEG). Hierarchiczna mezoporowatość jest wprowadzana przez modulację kwasu dodekanowego i późniejsze płukanie kwasem, co daje NP HP-UiO-66-NH₂ o zachowanej krystaliczności oraz połączonych izotermach typu I/IV N₂ . Aminy powierzchniowe są przekształcane w azidy (HP-UiO-66-N₃ NP), co umożliwia cyklododatkę alkinowo-azydową bez katalizatorów promowaną przez naprężenia (SPAAC) produkcję NP Hb@HP-UiO-66-PEG. Workflow obejmuje: i) inżynierię defektów NP UiO-66-NH₂, ii) usunięcie modulatora, iii) instalację azydu, iv) ładowanie Hb w buforowanym nośniku wodnem oraz v) PEGylację pośredniczoną przez SPAAC. Krytyczne parametry eksperymentalne, standardowe tryby awarii oraz strategie rozwiązywania problemów są szczegółowo opisane na każdym etapie, aby zwiększyć powtarzalność między laboratoriami. Protokół umożliwia produkcję NP HP-UiO-66-NH₂ na skalę gramów w każdej partii. Efektywność enkapsulacji na poziomie ~35% (zawartość obciążenia ~24 wt%) dla Hb uzyskuje się w łagodnych warunkach, z redyspersybilnymi NP o średnicy hydrodynamicznej ~140 nm i niskiej polidyspersyjności po PEGylacji. Kompleksowa charakterystyka fizykochemiczna potwierdza integralność szkieletu, mezoporowatość, skuteczną chemię powierzchni oraz rozproszoną koronę PEG o szerokości do ~12 nm. Testy funkcjonalne wykazują odwracalną oxygenację/deoxygenację enkapsulowanego Hb, co wskazuje na zachowaną zdolność transportu tlenu. PEGylacja znacząco zwiększa stabilność koloidalną i strukturalną w soli fizjologicznej, HEPES i surowicy, zapobiegając degradacji wywołanej fosforanami obserwowanej u odpowiedników niepegilatowanych. Dzięki integracji szczegółowych wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów, wizualizacji kluczowych kroków wspomaganej wideo oraz rozważań dotyczących skalowania, ten modułowy protokół zapewnia solidną i dostępną drogę do HBOC opartych na metalowo-organicznych ramach. Strategia ta jest łatwo adaptowalna do innych biomakrocząsteczek lub enzymów wymagających ochronnych, a jednocześnie dostępnych mikrośrodowisk do dostarczania terapeutycznego.

Wprowadzenie

Odpowiednie natlenienie jest kluczowe dla skutecznej terapii i gojenia tkanek w różnych środowiskach biomedycznych¹. W przypadku urazów i krwotoku chirurgicznego poważna utrata tlenu może zagrażać życiu, co podkreśla potrzebę stosowania bezpiecznych substytutów krwi, gdy krew dawcy jest niedostępna². W onkologii obszary nowotworów hipoksycznych ograniczają skuteczność leczenia zależnego od tlenu, a dodatkowe dostarczanie tlenu może znacząco zwiększyć skuteczność terapeutyczną 3,4,5,6. Tlen odgrywa również kluczową rolę w gojeniu ran, gdzie zwiększona dostępność tlenu sprzyja angiogenezie i naprawie tkanek⁷. Podobnie, w stanach niedokrwiennych i przeszczepach narządów, nośniki tlenu mogą zmniejszyć uszkodzenia niedotlenienia oraz poprawić żywotność tkanek i ich regenerację ^8,9.

Syntetyczne nośniki tlenu na bazie hemoglobiny (Hb) (HBOC) stanowią obiecujące podejście do łagodzenia hipoksji¹⁰. Jednak Hb poza czerwonymi krwinkami (RBC) jest z natury niestabilny i szybko dysocjuje się w dimery, które mogą powodować nefrotoksyczność, uszkodzenia oksydacyjne i zwężenie naczyń wazo-konskurnych w wyniku wydzielania tlenku azotu¹¹. Aby złagodzić te wyzwania, opracowano strategie enkapsulacji stabilizujące Hb w biokompatybilnych nanonośnikach, takich jak liposomy¹², polimeromy¹³ oraz polimerowe nanocząstki (NPs)14,15,16,17. Chociaż te systemy zwiększają stabilność Hb, osiągnięcie wysokiej efektywności enkapsulacji przy jednoczesnym zachowaniu natywnej funkcji wiązania tlenu pozostaje wyzwaniem¹⁸. Dodatkowo, przekształcenie oksydacyjne do methemoglobiny oraz wyciek hemu mogą ograniczyć wydajność przenoszenia tlenu¹⁹. Szybkie oczyszczanie i przedwczesne wycieki Hb dodatkowo ograniczają czas krążenia i translację kliniczną²⁰.

Metalowo-organiczne ramy (MOF) niedawno stały się wszechstronnymi nanoplatformami do dostarczania leków i biomakrocząsteczek dzięki swojej architekturze krystalicznej, dużej powierzchni oraz regulowanej porowatości²¹. Składające się z metalowych węzłów skoordynowanych z organicznymi łącznikami, MOF-y umożliwiają dyfuzję molekularną i modyfikację strukturalną, co czyni je atrakcyjnymi do zastosowań biomedycznych. Jednak większość MOF posiada głównie mikroporowate jamy (<2 nm), które poważnie ograniczają postsyntetyczne enkapsulowanie makrocząsteczek, takich jak białka, kwasy nukleinowe czy enzymy 22,23,24,25. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tego ograniczenia jest mineralizacja biomimetyczna in situ, gdzie biomolekuły pełnią rolę centrów nukleacji podczas wzrostu MOF, co zostało wykazane dla ZIF-8 i ZIF-90 26,27,28. Pomimo skuteczności, ta strategia wymaga łagodnych warunków syntezy, które ograniczają zakres kompatybilnych chemikaliów MOF^29,30.

UiO-66, cyrkonowy MOF zbudowany z węzłów oktaedralnych Zr_6O4(OH)₄ oraz łączników 1,4-benzenedikarboksylan (BDC), wyróżnia się wyjątkową stabilnością chemiczną i biokompatybilnością³¹. Jego solidna struktura opiera się rozkładowi w środowiskach wodnych i fizjologicznych, co czyni go idealnym do zastosowań biomedycznych³². Niemniej jednak jego wewnętrzna mikroporowata struktura ogranicza jego użyteczność do enkapsulacji biomakrocząsteczek. Hb, o wymiarze cząsteczkowym ~5 nm, nie może być umieszczony w wewnętrznych porach nieskazitelnej UiO-66. Odpowiednio, tylko ograniczona liczba badań badała UiO-66 w systemach związanych z Hb, gdzie MOF-y są wykorzystywane głównie do wykrywania Hb na powierzchni, a nie do enkapsulacji ramowej^33,34. W rezultacie platformy oparte na UiO-66 do enkapsulacji Hb pozostają stosunkowo słabo rozwinięte.

Niedawno wprowadziliśmy hierarchicznie porowaty UiO-66 NP (HP-UiO-66), który przełamuje ograniczenie wielkości porów, włączając mezoporowe domeny zdolne do przyjęcia Hb, rozszerzając tym samym funkcjonalny zakres UiO-66 dla rozwoju HBOC³⁵. Porowatość hierarchiczna jest wprowadzana poprzez inżynierię defektów, konkretnie poprzez zastosowanie długołańcuchowych kwasów monokarboksylowych, takich jak kwas dodekanowy (DA), jako modulatorów podczas syntezy^36,37. Ten modulator konkuruje z ligandem BDC o koordynację z Zr⁴⁺, co prowadzi do powstawania defektów i powiększania mezoporów. Późniejsze usunięcie modulatora daje NP HP-UiO-66 zawierające współistniejące mikro- i mezoporowe domeny, z regulowanym rozmiarem porów dzięki stężeniu modulatora lub długości łańcucha³⁶.

Chociaż wprowadzenie mezoporowatości poprawia dostępność cząsteczkową, może również ograniczyć integralność ramy buforów zawierających fosforany. Jony fosforanowe mogą koordynować się z klastrami Zr, prowadząc do częściowej lub całkowitej dezintegracji strukturalnej^38,39. W związku z tym strategie stabilizacji powierzchni są niezbędne do zachowania stabilności koloidalnej i chemicznej w warunkach fizjologicznych⁴⁰. Ogólnie rzecz biorąc, stabilizację powierzchni MOF można osiągnąć poprzez niekowalencyjne interakcje (np. interakcje van der Waalsa i wiązania wodorowe)⁴¹, interakcje koordynacyjne z odsłoniętymi miejscami metalowymi⁴² lub kowalencyjne przywiązanie do organicznych linkerów⁴³. Spośród innych linkerów glikol polietylenowy (PEG) jest szczególnie atrakcyjny ze względu na szeroką dostępność i minimalną złożoność syntezy⁴⁴. Co ważne, modyfikacja powierzchni PEG, powszechnie określana jako PEGylacja, zapewnia kilka korzystnych właściwości dla systemów podawania leków, w tym doskonałą biokompatybilność, zmniejszoną adsorpcję niespecyficznych białek oraz zmniejszone rozpoznawanie immunologiczne i absorpcję makrofagów^45,46. Łącznie te efekty zmniejszają odpowiedzi immunogenne i wydłużają krążenie układowe⁴⁷.

Tradycyjne techniki PEGylacji często opierają się na chemii karbodiamidu lub maleimidu, które zazwyczaj wymagają katalizatorów lub reaktywnych pośredników, które mogą uszkadzać wrażliwe biomolekusty, takie jak Hb. Aby obejść to ograniczenie, stosujemy cyklododatkę alkinowo-azydową wspieraną przez szczep (SPAAC), bioortogonalną reakcję wolną od katalizatorów między funkcjonalizowanymi azydem a dibenzylocykloktynem (DBCO), umożliwiającą specyficzną koniugację w łagodnych warunkach wodnych^35,48. Takie podejście zapewnia efektywną modyfikację powierzchni bez kompromisu w funkcji Hb w kapsule.

Bazując na wcześniej zgłoszonych HP-UiO-66 NPs³⁵, które koncentrowały się na projektowaniu strukturalnym i walidacji biofunkcjonalnej, niniejszy protokół kładzie nacisk na przejrzystość metodologiczną i powtarzalność, zapewniając szczegółowy, krok po kroku eksperymentalny workflow z określonymi zakresami parametrów i krytycznymi aspektami obsługi pacjentów. Uwzględnione są wskazówki dotyczące diagnostyki kluczowych etapów syntezy, enkapsulacji Hb oraz PEGylacji za pomocą chemii SPAAC, co ostatecznie daje stabilne NP Hb@HP-UiO-66-PEG (patrz Rysunek 1).

Workflow obejmuje: (i) inżynierię defektów z wykorzystaniem DA jako modulatora do syntezy amino-modyfikowanych HP-UiO-66-NH₂ NP; (ii) funkcjonalizację azydową powierzchniowych grup aminowych (azidowych); (iii) otoczenie Hb w łagodnych, wodnych warunkach; (iv) kowalencyjne sprzężenie PEG przez SPAAC.

Dla każdego ważnego etapu protokół ten identyfikuje typowe wyzwania eksperymentalne, takie jak agregacja cząstek, zapadanie się porów czy nieefektywna funkcjonalność powierzchni, oraz oferuje praktyczne strategie rozwiązywania problemów poprawiających powtarzalność między laboratoriami. Co ważne, artykuł ten szczegółowo pokazuje, że synteza NP HP-UiO-66 jest łatwo skalowalna, co umożliwia niezawodną produkcję w skali gramów na partię.

Ostatnie nanonośniki PEGylowane wykazują wysoką stabilność koloidalną w solach fizjologicznych, kwasie 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazineethansulfonowym (HEPES) oraz surowicy, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności wiązania i uwalniania tlenu przez Hb^{na poziomie 35}. Metody analityczne, takie jak spektroskopia podczerwieni z transformatem Fouriera (FTIR), jądrowy rezonans magnetyczny (NMR), dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego proszku (PXRD), sorpcja azotu (_{N 2}), analiza potencjału zeta (ζ), dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) oraz transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), potwierdzają transformację chemiczną, integralność ramy, porowatość, morfologię nanoskalową oraz skuteczną funkcionalizację powierzchni.

Poprzez nacisk na powtarzalność, skalowalność i przejrzystość operacyjną, wspieraną wizualizacją technicznie wrażliwych kroków opartą na wideo, ta metodologia zapewnia powtarzalną, solidną i dostępną drogę do wytwarzania stabilnych nośników tlenu opartych na MOF. Co ważne, podejście to jest modułowe i łatwo adaptowalne do innych biomakrocząsteczek lub enzymów, które wymagają chronionego, a jednocześnie tlenowo przepuszczalnego mikrośrodowiska, aby zachować funkcjonalność. W związku z tym NP Hb@HP-UiO-66-PEG stanowią obiecujący krok w kierunku stworzenia HBOC zdolnych do efektywnego dostarczania tlenu, jednocześnie odpornego na degradację płynów biologicznych.

Z praktycznego punktu widzenia strategia ta może być rozszerzona na inne biomakrocząsteczki poza Hb, pod warunkiem, że mają one wymiary poniżej około 20 nm, odpowiadające maksymalnemu dostępnemu rozmiarowi mezoporów, oraz wykazują jedną lub więcej z następujących cech: (i) wrażliwość na trudne warunki chemiczne, sprzyjającą łagodnej syntezie i modyfikacji powierzchni; (ii) wymóg nawadniania, tlenu przepuszczalnego mikrośrodowiska do utrzymania aktywności funkcjonalnej; oraz (iii) podatność na degradację MOF wywołaną fosforanami, co wymaga stabilizacji powierzchni. Podejście opiera się na umiarkowanych gęstościach defektów, aby zrównoważyć dostępność mezoporów z integralnością struktury. Gdy modyfikacja powierzchni bez katalizatorów i specyficzna dla miejsca jest konieczna, aby zachować funkcję biocząsteł, PEGylacja oparta na SPAAC oferuje wyraźne korzyści. W związku z tym protokół ten jest dobrze przystosowany do efektywnego ładowania biomakrocząsteczek, funkcjonalnej konserwacji oraz długoterminowej stabilności koloidalnej w warunkach fizjologicznych, podczas gdy znacznie większe biomolekuły lub systemy wymagające ekstremalnej stabilności termicznej lub kwasowej mogą wymagać alternatywnych platform MOF.

Protokół

1. Ekstrakcji Hb (oczekiwany czas trwania: 2 dni)

UWAGA: Ekstrakcja Hb z dostępnej komercyjnie krwi bydła (SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK) odbywa się zgodnie z wcześniej podanym protokołem⁴⁹.

1. Przelej krew bydła (zazwyczaj 10 mL na ekstrakcję) do stożkowej rurki wirówki o pojemności 50 mL. Dodaj równą ilość 0,9% (w/v) roztworu soli fizjologicznej, aby rozcieńczyć krew i zmniejszyć lepkość. Delikatnie odwracaj kilka razy, aż uzyskamy jednorodną zawieszkę.
2. Rozcieńczoną krew wiruj w 1 500 x g przez 20 minut w 4 °C. Po wirowaniu nad gęstym czerwonym granulkiem (RBC) pojawia się przezroczysty żółty supernatant (plazma). Jeśli nie zostanie osiągnięte pełne granulowanie, kontynuuj wirowanie w razie potrzeby.
3. Ostrożnie przelewaj i odrzucaj warstwę plazmy, nie naruszając granulki. Dodaj świeżą sól fizjologiczną (10 mL), ponownie zawiesij granulek krwinki przez delikatną inwersję i powtórz etap wirowania w identycznych warunkach. Wykonaj łącznie dwa cykle mycia, aby usunąć białka osocza i płytki krwi.
   UWAGA: Proces płukania jest kluczowy dla uzyskania czystych krwinek wolnych od zanieczyszczeń osocza, które mogłyby zakłócać dalszą ekstrakcję toluenu.
4. Po drugim myciu wyrzuć supernatant i ponownie zawiesijcie oczyszczony pellet z czerwonymi krwinkami w mieszance toluenu, wody ultraczystej i soli fizjologicznej w proporcji objętościowej 1:0,4:1. Na przykład przed dodaniem granulki wymieszaj 10 mL toluenu, 4 mL ultraczystej wody i 10 mL soli fizjologicznej w lejku separatorowym o pojemności 50 mL.
5. Uszczelnij lejek i delikatnie odwróć kilka razy, aby wymieszać fazy. Umieść lejek w temperaturze 4 °C przez noc (~12-16 godzin), aby umożliwić całkowite oddzielenie fazowe. Faza toluenowa ekstruje błony lipidowe, pozostawiając przezroczystą fazę wodną wzbogaconą w Hb.
6. Następnego dnia ostrożnie zbieraj dolną warstwę wodną, używając zaworu lejka rozdzielającego. Ta warstwa wydaje się przezroczysta i ciemnoczerwona.
7. Przelej wodny roztwór Hb do rurek wirówek i obróć w 8 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć pozostałości komórek lub emulgowany materiał.
8. Przefiltruj supernatant przez frit ziemi okrzemkowej za pomocą filtracji próżniowej. Stosuj tylko delikatne podciśnienie (unikaj wysokiego ciśnienia ujemnego, które może powodować pianę lub denaturację białka).
9. Zbierz filtrat zawierający bezstroma-bezpłodny Hb. Przechowuj ten zapas na lodzie, jeśli jest używany od razu, lub w aliquotach (~1 mL) i zamrażaj w temperaturze −80 °C do długotrwałego użytku.
   UWAGA: Alikwoty Hb mogą być przechowywane w mrozie przez kilka miesięcy bez wykrywalnej degradacji.
10. Ilościowo określ stężenie Hb za pomocą testu białka kwasu bicynchoninowego zgodnie z protokołem producenta, używając czystego Hb z bydła jako standardu kalibracyjnego. Dostosuj końcowy zapas Hb do pożądanego stężenia roboczego (zazwyczaj 20 mg ^mL-1 w buforze HEPES, pH 7,4).
    UWAGA: Spodziewaj się przezroczystego, czerwonego roztworu Hb wolnego od materiału komórkowego.
11. Opcjonalnie: zmierzyć spektra absorpcji UV-vs (375-700 nm) ekstrahowanego Hb w celu oceny jego zdolności wiązania i uwalniania tlenu. Zapisz początkowe widmo UV-vis. Dodaj ditionit sodu i przepłukaj gazem N₂ przez 10 minut, aby uwolnić tlen, i zapisz widmo odtlenionego Hb. Następnie przez 10 minut przepychaj powietrzem, aby umożliwić ponowne natlenienie i ponownie zarejestrować widmo.
    UWAGA: Obecność charakterystycznych pasm Soreta i Q odpowiednio natlenowanych (~412 nm dla pasma Soret; ~541 i ~577 nm dla pasm Q) i odtlenowanych (~430 nm dla pasma Soret; ~557 nm dla pasma Q) Hb po oczyszczeniu powietrzem i N₂ wskazuje, że Hb pozostaje funkcjonalny (Ilustracja uzupełniająca 1).
    UWAGA: Ostrożnie obchodzić się z toluenem w okapu wyparowym, nosząc odpowiedni sprzęt ochronny, w tym fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawiczki. W niniejszym badaniu wszystkie ciecze odpadowe zawierające toluen zostały zebrane i utylizowane jako organiczne ciekłe odpady chemiczne w wyznaczonych pojemnikach (Grupa C), oznaczonych jako "toluen i mieszanka", zgodnie z wytycznymi duńskiego Ministerstwa Środowiska. Odpowiednia dokumentacja dotycząca utylizacji odpadów znajduje się w Pliku Uzupełniającym 1.

2. Wytwarzanie NP HP-UiO-66-NH₂ (oczekiwany czas trwania: 3 dni)

UWAGA: HCl (37%) jest żrąca; Uchwyt wewnątrz okapu z dymonami z fartuchem laboratoryjnym, rękawiczkami odpornymi na kwasy oraz odpowiednią ochroną oczu. Dodawaj kwas powoli i unikaj wdychania par.

1. ZrCl₄ (400 mg, 1,715 mmol) należy do kolby o pojemności 250 mL z okrągłym dnem. Powoli dodawaj DMF (80 mL) i ultrasonikat przez 5 minut, aby całkowicie rozpuścić ZrCl₄. Dodaj DA (12 g, 60 mmol) i ultrasonikować przez dodatkowe 30 minut, aż uzyskamy przezroczysty, jednorodny roztwór. Zmierz całkowitą objętość roztworu za pomocą cylindra z podziałem i dodaj DMF w razie potrzeby, aby dostosować objętość końcową do 100 mL. DA działa jak modulator konkurencyjny, wprowadzając kontrolowane defekty kratowniczne.
   UWAGA: Dodawaj DMF powoli podczas rozpuszczania ZrCl₄, ponieważ proces koordynacji jest egzotermiczny i może powodować lekkie dymy; Wszystkie operacje wykonuj w okapie spalinowym. Uwzględnić wzrost objętości spowodowany włączeniem DA, stosując początkową objętość 80 mL DMF do rozpuszczenia ZrCl₄ i DA, a ostateczną objętość dostosuj do 100 mL dopiero po całkowitym rozpuszczeniu, aby zapewnić dokładną kontrolę stężenia.
2. Dodaj 2-amino-1,4-benzendikarboksylowy kwas (BDC-NH₂, 155 mg, 0,857 mmol) do tej samej piersiówki i sonikuj na dodatkowe 30 minut. Kontynuuj, aż uzyskamy jednorodny, jasnożółty roztwór.
3. Przelej mieszaninę do autoklawu wyłożonego teflonem lub naczynia ciśnieniowego o pojemności 150 mL odpowiedniego do syntezy solvotermicznej. Szczelnie uszczelnij i umieść w podgrzanym piecu tłumiczym w temperaturze 120 °C przez 18 godzin. Nie zakłócaj reaktora podczas podgrzewania, aby uniknąć niekontrolowanej nukleacji.
4. Po reakcji wyłącz piec i pozwól naczyniu naturalnie ostygnąć do temperatury pokojowej (~2 godziny). Obserwuj delikatne żółte zawieszenie widoczne równomiernie w całym medium.
5. Produkt zbieraj przez wirowanie (11 000 x g, 10 minut, temperatura pokojowa) i wyrzucaj supernatant. Przemyj pellet DMF (100 mL) trzy razy, stosując te same warunki wirowania, aby usunąć nadmiar ligandów i niezareagowanych DA. Jeśli produkt nie jest całkowicie osadzony w granulacji, należy wydłużyć czas wirowania w razie potrzeby.
6. Przygotuj roztwór usuwający kwasy składający się z DMF (100 mL) zawierającego 0,5 mL skoncentrowanego HCl (37%). Zanurz całkowicie wyprany pellet w tym roztworze i podgrzej go w piecu tłumiczym w temperaturze 90 °C przez 12 godzin. Ten etap usuwa modulator DA, tworząc mezopory wewnątrz struktury.
7. Po 12 godzinach odwiruj (11 000 x g, 5 minut w temperaturze pokojowej) i wyrzuć supernatant. Powtórz zabieg kwasem, używając świeżej partii DMF zawierającej 0,5 mL HCl, aby zapewnić całkowite usunięcie DA. Jeśli produkt nie jest całkowicie osadzony w granulacji, należy wydłużyć czas wirowania w razie potrzeby.
8. Przemyj pellet kolejno DMF, acetonem i etanolem (100 mL, 11 000 x g, 5 minut, temperatura pokojowa), aby usunąć wszelkie pozostałości kwasu i rozpuszczalnika. Jeśli osad nie jest całkowicie osadzony, należy wydłużyć czas wirowania w razie potrzeby. Między każdym płukaniem delikatnie rozpraszaj granulat poprzez wirowanie lub łagodną sonikację.
9. Susz produkt w piekarniku próżniowym (140 °C) przez noc po wyschnięciu w okapie oparowym. Materiały końcowe (HP-UiO-66-NH₂ NPs) pojawiają się jako drobny żółty proszek. Spodziewaj się typowej wydajności ~428 mg.
10. Potwierdź, że piki PXRD w 2θ = 7,3°, 8,4°, 25,7° pozostają ostre (rysunek 2A), co wskazuje na zachowanie topologii krystalicznej UiO-66. Zweryfikować całkowite usunięcie ^{DA za pomocą}1 H NMR po trawieniu zasadowym (2 M KOH w_{D2 O}) (brak pików metylenowych przy 1,2 ppm) (Rysunek 2B).
11. Charakteryzuj porowatość przez adsorpcję-desorpcję N₂ na poziomie 77 K⁵⁰. Krzywa pokazuje połączoną izotermę typu I/IV z pętlą histerezy (rysunek 2C), potwierdzając powstawanie mezoporów.
    UWAGA: Niepełne suszenie w wysokiej temperaturze lub niewystarczająca masa próbki prowadzi do niedokładnych pomiarów porowatości przy użyciu izotermów adsorpcyjne-desorpcyjne N₂ ; powtórz proces suszenia próżniowego w temperaturze 140 °C i upewnij się, że masa próbki przekracza 100 mg, jeśli obszar Brunauer−Emmett−Teller (BET) wynosi < 1000 m^{2 g-1}.
12. Opcjonalnie: ocena morfologii NP za pomocą SEM. NP HP-UiO-66-NH₂ wykazują morfologię sferyczną z wąskim rozkładem rozmiarowym ~100 nm (Rysunek 2D).
    UWAGA: Spodziewaj się NP HP-UiO-66-NH₂ posiadających zarówno mikro- jak i mezopory, odpowiednie do kolejnej enkapsulacji Hb.
13. Syntezę NP HP-UiO-66-NH₂ można skalować poprzez proporcjonalne zwiększenie liczby odczynników i rozpuszczalników stosowanych w krokach 2.1–2.9 oraz przeprowadzenie wielu równoległych reakcji solvotermicznych. Utrzymując te same stosunki molowe, stężenia, temperaturę reakcji i czas reakcji oraz zwiększając ilość odczynników i rozpuszczalników o 1,5-krotność, można jednocześnie pracować dwa lub więcej autoklawów wyłożonych teflonem lub zbiorników ciśnieniowych o pojemności 150 mL, umożliwiając produkcję NP HP-UiO-66-NH₂ na skali gramowej (rysunek 3).
    UWAGA: Obchodzić się ze wszystkimi rozpuszczalnikami organicznymi wewnątrz okapu oparowego, nosząc fartuch laboratoryjny, rękawice odporne na kwasy oraz odpowiednią ochronę oczu. Zbieranie wszystkich ścieków zawierających DMF i utylizacja ich jako organiczne chemiczne ciekłe odpady w wyznaczonych pojemnikach (Grupa C) oznaczonych jako "DMF i mieszanka" zgodnie z wytycznymi duńskiego Ministerstwa Środowiska. Roztwory odpadowe zawierające śladowe ilości ZrCl₄ i HCl były odpowiednio traktowane. Odpowiednia dokumentacja dotycząca utylizacji odpadów znajduje się w Pliku Uzupełniającym 1.

3. Funkcionalizacja azidowa HP-UiO-66-NH₂ NP (HP-UiO-66-N₃ NP) (Oczekiwany czas trwania: 1 dzień)

UWAGA: Trymetylosilylowy azyd (TMSN₃) i azotyn tert-butyloowy (tBuONO) są toksyczne i lotne. Wszystkie etapy wykonuj w okapu wyparowującym, ubranym w fartuch laboratoryjny, rękawiczki nitrylowe i ochronę oczu.

1. Dokładnie odważ HP-UiO-66-NH₂ NP (50 mg) do kolby o pojemności 25 mL z okrągłym dnem. Dodaj THF (10 mL) i ultrasonikanować przez 5 minut, aby w pełni rozproszyć cząstki. Zawieszenie staje się nieprzezroczyste, ale jednolite.
   UWAGA: Równomierna dyspersja NP po sonikacji jest kluczowa dla skutecznego kontaktu z reagentami. Jeśli dyspersja jest niepełna, zwiększ objętość roztworu i powtórz sonikację.
2. Umieść kolbę w kąpieli lodowodowodziej (0 °C) na mieszadle magnetycznym ustawionym na 400 obr./min. Za pomocą szklanej strzykawki dodaj tBuONO (0,4 mL) kropelami przez 5 minut, utrzymując temperaturę poniżej 5 °C.
3. Natychmiast dodaj TMSN₃ (0,35 mL) kroplami w tych samych warunkach zimna. Może pojawić się łagodne musowanie, co wskazuje na postęp nitrozacji. Owiń wannę folią aluminiową, aby chronić reakcję przed światłem...
4. Kontynuuj mieszankę reakcji przez noc (~16 h) w kąpieli lodowodowodniej, aby umożliwić całkowitą substytucję azydowych grup aminowych na powierzchni MOF.
5. Usuń kąpiel lodową i pozwól zawiesinie osiągnąć temperaturę pokojową. Wirówka (11 000 x g, 5 minut, temperatura pokojowa) do pobrania zmodyfikowanych NP. Jeśli osad nie jest całkowicie osadzony, należy wydłużyć czas wirowania w razie potrzeby.
6. Dokładnie umyj granulat THF (10 mL) trzy razy, zbierając go przez wirowanie (11 000 x g, 5 minut, temperatura pokojowa) po każdym myciu. Następnie wykonuję trzy dodatkowe płukania z użyciem acetonu (10 mL), wirując w tych samych warunkach, aby usunąć pozostałości i produkty uboczne. Jeśli osad nie jest całkowicie osadzony, należy wydłużyć czas wirowania w razie potrzeby.
7. Susz produkt (HP-UiO-66-N₃ NP) w piekarniku (140 °C) pod próżnią przez noc po wyschnięciu w okapie oparowym. Spodziewaj się typowej wydajności ~45 mg.
8. Zweryfikować przemianę chemiczną za pomocą spektroskopii FTIR: wyraźne rozciągnięcie asymetryczne azydu pojawia się na ~2122 ^cm-1 (rysunek 4A). Intensywność pasma koreluje z efektywnością podstawiania powierzchni.
   UWAGA: Niepełna konwersja może utrudnić późniejsze sprzęganie klików. Jeśli pasmo azydu jest słabe, powtórz funkcjonalizację z użyciem dwukrotnych wielkości tBuONO i TMSN₃. Można spodziewać_się azidowo zakończonych HP-UiO-66-N 3 NP o zachowanej krystaliczności i mezoporowej architekturze (rysunek 4B-D), gotowych do enkapsulacji Hb i SPAAC PEGylacji.
   UWAGA: Zbierać wszystkie ciecze odpadowe zawierające TMSN₃, w tym mieszaniny z innymi odczynnikami (np. tBuONO i THF), w wyznaczonych pojemnikach na odpady niebezpieczne grupy O zgodnie z wytycznymi duńskiego Ministerstwa Środowiska. Wyraźnie oznacz wszystkie pojemniki, aby wskazać obecność TMSN₃ i jego mieszanin. Odpowiednia dokumentacja dotycząca utylizacji odpadów znajduje się w Pliku Uzupełniającym 1.

4. Obciążenie Hb i ilościowość (przewidywany czas trwania: 2 dni)

1. Przelej HP-UiO-66-N₃ NP (5 mg) do rurki wirówki o pojemności 2 mL, a następnie wykonaj ~2 minuty sonifikacji w 0,5 mL buforu HEPES (20 mM, pH 7,4). Dodaj 0,5 mL buforu HEPES zawierającego Hb (20 mg ^mL-1) i delikatnie odwróć probówkę kilkakrotnie, aby w pełni rozprowadzić NP.
2. Umieść rurkę na termowstrząsie i inkubuj w temperaturze pokojowej (22-25 °C) poniżej 1000 obr./min, potrząsając przez 2 godziny.
3. Po inkubacji wiruj 13 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby rozpylić powstałe Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs. Ostrożnie zbierz supernatant w celu ilościowego określenia nieuwięzionego Hb. Jeśli osad nie jest całkowicie osadzony, należy wydłużyć czas wirowania w razie potrzeby.
4. Delikatnie myj pellet ultraczystą wodą (1 mL), pipetując w górę i w dół, aby usunąć luźno adsorbowany Hb, i powtórz mycie dwa razy. Ostrożnie zbieraj supernatant każdego płukania w celu ilościowego określenia nieuwięzionego Hb. Ostatni pellet ponownie zawiesij w 0,5 mL w wodzie ultraczystej do charakteryzacji. Przechowuj próbki w lodówce (4 °C), aby zapobiec utlenianiu.
5. Określ nieuwięziony Hb w zebranych supernatantach za pomocą testu laurylosiarczanu sodu (SLS)-Hb⁵¹. Pipeta 10 μL każdego supernatantu do mikropłytki z 96 dołkami i dodaj 100 μL odczynnika SLS (0,6 mg ^mL-1 w wodzie ultraczystej). Inkubuj 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie mierz absorpcję przy 412 nm za pomocą spektrofotometru UV-vis.
6. Przygotuj standardową krzywą z użyciem roztworów Hb stockowych (0-10 mg ^mL-1) w buforze HEPES, aby przekształcić wartości absorpcji na stężenie.
7. Oblicz efektywność enkapsulacji (EE) i zawartość obciążenia (LC) jako:
   EE (%) = [(początkowy Hb - supernatant Hb)/początkowy Hb] × 100
   LC (%) = [(kapsułkowane Hb)/(kapsułkowane Hb + NP masa)] × 100
8. Aby zwiększyć skalę enkapsulacji Hb, inkubuj 100 mg NP z 20 mL roztworu Hb (10 mg mL⁻¹). Aby ocenić porowatość po kapsularzu, zanurz powstałe NP w etanolu na 24 godziny, następnie wysusz na noc w piecu próżniowym w temperaturze 140 °C i zapisz izotermę adsorpcyjne-desorpcyjne N₂ w celu oceny porowatości. Czerwony kolor proszku wskazuje na pomyślne otoczkowanie Hb (rysunek 5A), a wyraźny spadek wchłaniania_N2 potwierdza pomyślne wypełnienie mezoporów Hb (Rysunek 5B).
9. Zmierz ζ-potencjał za pomocą Zetasizer Nano ZS. Ładunek powierzchniowy spada z ~+40 mV (HP-UiO-66-N₃ NPs) do ~+20 mV (Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs), co jest zgodne z adsorpcją Hb (rysunek 5C).
10. Opcjonalnie: wykonanie mikrografii SEM (rysunek 5D) oraz dyfraktogramu PXRD (rysunek 5E), aby zapewnić integralność morfologiczną i stabilność strukturalną.
11. Rejestruj widma UV-vis (375-700 nm), aby ocenić odwracalne wiązanie tlenu NP. Dodaj ditionit sodu i przepłukaj N₂ przez 10 minut, aby uwolnić tlen, zapisz widmo, następnie płucz powietrzem przez 10 minut, aby umożliwić ponowne wiązanie, i ponownie zapisz widmo (rysunek 5F).
    UWAGA: Obecność charakterystycznych pasm Soreta i Q odpowiednio natlenowanych (~412 nm dla pasma Soret; ~541 i ~577 nm dla pasm Q) oraz odtlenowanych (~430 nm dla pasma Soret; ~557 nm dla pasma Q) po oczyszczenia powietrzem i N₂ wskazuje, że Hb pozostaje funkcjonalny.
12. Spodziewaj się jednolitych czerwonych NP Hb@HP-UiO-66-N₃ zawierających funkcjonalnie aktywne Hb z odwracalnym zachowaniem natleniania.

5. Wytwarzanie NP Hb@HP-UiO-66-PEG: PEGylacja za pomocą SPAAC (oczekiwany czas trwania: 2 dni)

1. Przygotuj rurkę wirówki o pojemności 2 mL zawierającą Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs (10 mg) rozproszonych w 0,5 mL ultraczystej wodzie. Dodaj DBCO-PEG (Mw ~2 000, 20 mg w 0,5 mL wodzie ultraczystej), aby uzyskać stosunek 2:1 (w/w) PEG do NP. Delikatnie wiruj aż do pełnego wymieszania.
2. Inkubuj mieszankę na termowstrząsie w temperaturze pokojowej i 1000 obr./min przez 1 godzinę, a następnie przelej do lodówki (4 °C) na reakcję nocną (~16 h). Ta wolna od katalizatorów reakcja klikowa SPAAC kowalencyjnie łączy DBCO z grupami azydowymi, tworząc stabilne wiązania triazolowe.
3. Wirować w 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby osadzić PEGylowane Hb@HP-UiO-66-PEG NP. Jeśli osad nie jest całkowicie osadzony, należy wydłużyć czas wirowania w razie potrzeby. Usuń supernatant zawierający niezareagujący PEG.
4. Przemyj pellet trzy razy ultraczystą wodą (po 2 mL każdy, pipetując w górę i w dół) w identycznych warunkach wirowania. Zapewnia to usunięcie wolnych łańcuchów PEG oraz małych molekularnych produktów ubocznych.
5. Ponownie zawiesić oczyszczone Hb@HP-UiO-66-PEG NPs w 2 mL ultraczystej wodzie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   Koloid wydaje się jednorodny i lekko opalescentyczny, co wskazuje na dobrą stabilność dyspersyjną.
6. Potwierdzenie skutecznej PEGylacji za pomocą spektroskopii FTIR (Rysunek 6A): zniknięcie pasma azydu na 2122 ^cm-1 oraz pojawienie się sygnałów METYLENOWYCH (−CH₂−) i wiązań eterowych (−O−) pochodzących z PEG odpowiednio na 2883 i 1097 ^cm-1.
7. Zweryfikować za ^{pomocą 1}godziny NMR (rysunek 6B) po zasadowym trawieniu w 2 M KOH/D₂O; Próbki PEGylowane wykazują dodatkowy sygnał przy δ = 3,53 ppm, odpowiadający protonom oksyetylenu PEG.
8. Zmierz średnicę hydrodynamiczną i wskaźnik polidyspersji (PDI) za pomocą DLS (rysunek 6C).
   Zwiększenie z ~115 nm (PDI ~0,1) do ~140 nm (PDI ~0,17) potwierdza powłokę powierzchniową cienką warstwą polimerową.
9. Opcjonalnie: zmierzyć powierzchniowy potencjał ζ za pomocą Zetasizer Nano ZS, aby zweryfikować znikomy wpływ powierzchniowej PEGylacji na ładunek powierzchniowy (rysunek 6D). Niewielka zmiana po PEGylacji (z ~+20 mV do ~+17 mV) wskazuje na minimalny wpływ na ładunek powierzchniowy.
10. Obserwuj morfologię za pomocą TEM (Rysunek 6E). TEM ujawnia rozproszony obrzeż ~10-12 nm wokół krawędzi cząstek, reprezentujący koronę PEG.
11. Wykonaj test uwalniania tlenu za pomocą elektrody tlenowej (rysunek 6F), aby wykazać, że funkcja Hb pozostaje nienaruszona po PEGylacji, podobnie jak w formie niepeGiylowanej. Można się spodziewać stabilnych, czerwono-brązowo-rozproszonych NP Hb@HP-UiO-66-PEG wykazujących silną stabilność koloidalną i zachowaną zdolność wiązania tlenu, odpowiednie do długoterminowych badań fizjologicznych.
12. Opcjonalnie: przeprowadzić krzywe dysocjacji tlenu (ODC) wolnych Hb i Hb enkapsulowanych w NP Hb@HP-UiO-66-PEG w celu zidentyfikowania ciśnienia cząstkowego tlenu przy 50% nasycenia tlenem Hb (p50) i współczynnika Hilla (Hill-n) (Rysunek 7).

6. Ocena stabilności NP (oczekiwany czas trwania: 7 dni)

1. Podawaj Hb@HP-UiO-66-PEG NP (~5 mg) do siedmiu rurek wirówek po 2 mL. Dodaj po 2 ml każdego medium: ultraczystą wodę, sól fizjologiczną (0,9% NaCl), HEPES (20 mM), serum myszy, osocze ludzkie, zmodyfikowaną średnio-wysoką glukozę Dulbecco (DMEM) oraz sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Upewnij się, że koreczki rurek wirówek są szczelnie zamknięte, aby zapobiec parowaniu medium podczas inkubacji. Serum CD-1 na myszy oraz osocze ludzkie są kupowane w Innovative Research (Novi, MI, USA).
2. Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C w termowstrząsie z prędkością 1000 obr./min przez maksymalnie 7 dni.
3. Po 3 i 7 dniach zbieraj cząstki przez wirowanie (12 000 g, 10 min, temperatura pokojowa), raz przemyj wodą ultraczystą i wysusz do PXRD (rysunek 8A). Jeśli osad nie jest całkowicie osadzony, należy wydłużyć czas wirowania w razie potrzeby.
4. Przy 0, 24, 72 i 168 h wyjmij aliquoty (~50 μL) i rozcieńcz je 20 razy do analizy DLS (rozmiar i PDI) (rysunek 8B).
5. Opcjonalnie: przygotować próbki SEM po 48 godzinach w PBS do wizualnej kontroli morfologii (rysunek 8C).
   UWAGA: Rozcieńczenie zawiesiny NP (w PBS) za pomocą ultraczystej wody jest niezbędne do analizy SEM, ponieważ zmniejsza zakłócenia tła ze strony składników buforu i umożliwia wyraźne obrazowanie NP.
6. Porównaj_{z NP bez} PEGylowanego Hb@HP-UiO-66-N w identycznych warunkach; szybkie znikanie charakterystycznych odbić krystalicznych oraz pojawienie się szerokich cech rozpraszania amorficznego wskazują na niestabilność bez powłoki PEG.
   UWAGA: Próbki PEGylowane pozostają strukturalnie nienaruszone po 7 dniach we wszystkich ośrodkach, podczas gdy próbki niepegilowane rozkładają się w ciągu 24 godzin w PBS lub DMEM.

7. Charakterystyka fizykochemiczna (Przewidywany czas trwania: ~15 dni)

UWAGA: Ta sekcja opisuje metody analityczne potrzebne do potwierdzenia morfologii, składu, porowatości oraz integralności Hb NP. Techniki te łącznie potwierdzają powtarzalność procesów syntezy i modyfikacji.

1. PXRD
   1. Susz ~5 mg każdej próbki NP w zamrażarce na noc przed pomiarem, aby usunąć adsorbowaną wilgoć.
   2. Załaduj próbkę na płaskim silikonowym uchwycie bez tła i delikatnie spłaszcz za pomocą czystej szklanej szkiełki, aby utworzyć cienką, jednolitą warstwę.
      UWAGA: Unikaj zbyt mocnego naciskania, co może wywołać efekty preferowanej orientacji.
   3. Rejestruj wzory PXRD za pomocą dyfraktometru stołowego wyposażonego w promieniowanie Cu Kα (λ = 1,5418 Å). Ustaw parametry skanowania na 2θ = 4-50°, rozmiar kroku = 0,02°, dwell = 1 s na krok.
   4. Porównaj uzyskane wzory z symulowaną strukturą UiO-66 wygenerowaną za pomocą oprogramowania Mercury na podstawie wcześniej podanych danych kryształowych³¹. Obecność ostrych szczytów na 7,3°, 8,4° i 25,7° wskazuje na integralność krystaliczną.
2. N₂ Adsorpcja-Desorpcja (powierzchnia BET i rozkład wielkości porów)
   1. Degazowanie ~100 mg każdej próbki NP w temperaturze 140 °C przez 24 godziny przy użyciu systemu Micromeritics Smart VacPrep z oczyszczaniem ultra-wysokiej czystości N₂.
   2. Natychmiast przenieś odgazowane próbki do portu analitycznego analizatora powierzchni Micromeritics Tristar. Zapisz izotermy N₂ w temperaturze 77 K w względnym zakresie ciśnieniowym (P/P₀) 0-1.
   3. Oblicz powierzchnie za pomocą metody BET, zgodnie z rozszerzonymi kryteriami Rouquerol⁵². Oblicz rozkład wielkości porów za pomocą nielokalnej teorii funkcjonału gęstości zaimplementowanej w oprogramowaniu Micromeritics.
   4. Wygeneruj krzywe adsorpcji/desorpcji oraz wykresy rozkładu wielkości porów według Origin 2022. Zaimportuj dane adsorpcyjne/desorpcyjne do oprogramowania, z ciśnieniem względnym (P/P₀) na osi X i adsorbowaną objętością N₂ na osi Y.
   5. Wykres rozkładu wielkości porów z szerokością porów jako osi X i przyrostową objętością porów jako osią Y. Prezentuj wyniki jako wykresy "Linia + Symbol". Wszystkie analizy wykonuj w domyślnych ustawieniach oprogramowania.
3. Spektroskopia FTIR
   1. Zmiel ~5 mg każdej wysuszonej próbki na drobny proszek za pomocą czystej zaprawy z agatu. Umieść proszek na krysztale ATR spektrometru ALPHA-P Bruker⁵³.
   2. Zbieraj widma w zakresie 4 000-400 ^cm-1 z rozdzielczością 2 ^cm-1 .
   3. Identyfikacja charakterystycznych szczytów: Pojawienie się rozciągania N₃ na wysokości ~2122 ^cm-1 potwierdza powstawanie azydu (Rysunek 4A). Po PEGylacji obserwuj pasma −CH₂− i C-O-C odpowiednio na ~2883 ^cm-1 i ~1097 ^cm-1, wraz z zanikaniem rozciągnięcia N₃ (rysunek 6A). Spodziewaj się, że zniknięcie pasma azydu oraz pojawienie się sygnałów METYLENOWEGO (−CH₂−) i eterowego (−O−) pochodzącego z PEG potwierdzą zakończenie reakcji SPAAC.
   4. Wyrysuj krzywe FTIR za pomocą Origin 2022. Zaimportuj surowe dane do oprogramowania z wartościami X (fala) i Y (transmisja). Generuj wykresy w formacie "liniowym" z użyciem domyślnych ustawień oprogramowania.
4. ¹H NMR
   1. Dodaj ~10 mg NP do 0,5 mL 2 M KOH w_D2Oumieszczonych w szklanej fiolce i podgrzej w 80 °C przez 1-2 godziny, aby strawić ramę.
   2. Wirówka (12 000 x g, 10 minut, temperatura pokojowa), aby rozkręcić nierozpuszczone reszty. Przenieś supernatant do rurki NMR o średnicy 5 mm.
   3. ^Nagraj1 H spektrum NMR na spektrometrze Bruker Avance o częstotliwości 400 MHz.
   4. Przypisz charakterystyczne przesunięcia chemiczne, w tym aromatyczne protony BDC-NH₂ (δ = 6-8 ppm) oraz sygnały PEG (δ = ~3,53 ppm, rysunek 6B), korzystając z oprogramowania MestReNova. Analizuj dane NMR za pomocą modułu przetwarzania NMR w oprogramowaniu z jego domyślnymi ustawieniami.
5. SEM
   1. Osadzenie ~5 μL zawieszenia NP na płytkę krzemową; pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w szafce wolnej od kurzu. Jeśli dojdzie do naładowania, pokryj go sutter złotem o średnicy 5 nm.
   2. Obraz FEI Quanta 200 SEM przy napięciu przyspieszającym 10-20 kV.
   3. Przeanalizuj obrazy za pomocą ImageJ. Importuj oryginalne obrazy TIFF z wbudowanymi informacjami o skali do oprogramowania i dostosuj jasność oraz kontrast wyłącznie dla wizualizacji. Nie stosuj dodatkowego przetwarzania, które mogłoby wpłynąć na informacje wymiarowe. Wygeneruj paski skali za pomocą funkcji Analizuj w oprogramowaniu.
6. TEM
   1. Umieść ~5 μL dyspersji NP na siatce Cu z koronkowym węglem (siatka 300). Nadmiar osusz papierem filtracyjnym i wysusz w warunkach otoczenia.
   2. Zbadaj pod FEI Tecnai T20 G2 TEM przy napięciu 200 kV.
   3. Przeanalizuj obrazy za pomocą ImageJ. Przetwarzanie obrazu przebiega zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 7.5.3.
7. DLS i ζ-Potencjał
   1. Rozcieńczenie NP ~20 razy w ultraczystej wodzie dla analizy wielkości i PDI; dla potencjału ζ rozcieńcz w buforze HEPES (20 mM, pH 7,4).
   2. Zmierz za pomocą Zetasizer Nano ZS w temperaturze 25 °C. Przygotowuje się co najmniej trzy niezależne próbki (n = 3), a każda próbka mierzona jest w potrójnym egzemplarzu.
   3. Wyrysuj dane DLS i ζ-potencjał za pomocą Origin 2022. Przedstawimy rozkład wielkości cząstek ważony intensywnością jako wykresy "Linia + Symbol", a wyniki ζ-potencjału jako wykresy "kolumnowe". Zgłoś dane jako średnią ± odchylenia standardowego (n = 3). Wszystkie analizy wykonuj według domyślnych ustawień oprogramowania.
8. Spektroskopia UV-vis dla funkcjonalności Hb
   1. Rozproszyć 3 mg wolnego Hb lub odpowiadającą mu ilość NP (czyli zawierającej równoważną ilość kapsułkowanego Hb) w 3 mL ultraczystej wodzie. Przenieś zawieszenia do kwarcowej cuwetty. Rejestruj widma UV-vis od 375 do 700 nm za pomocą spektrofotometru UV-2600 UV−vis.
   2. Dodaj szczyptę ditionitu sodu do roztworu Hb lub zawiesiny NP i płucz N₂ przez 10 minut, aby odtleśnić próbkę. Zarejestruj przesunięcie pasma Soreta z 412 do 430 nm oraz łączenie pasm Q. Ponowne natlenienie próbki poprzez bąbelki powietrzne przez 10 minut, aby obserwować odwrócenie (Rysunek 5F i Ilustracja Uzupełniająca 1).
   3. Wykres danych według Origin 2022. Przedstawimy widma jako wykresy "liniowe", z długością fali na osi X i absorbancją na osi Y.
9. Ilościowa identyfikacja uwolnionego tlenu
   1. Rozproszyć 1 mg wolnego Hb lub odpowiadającą mu ilość Hb@HP-UiO-66-N₃ i Hb@HP-UiO-66-PEG NP (zawierających równoważną ilość enkapsulowanego Hb) w wodzie ultraczystej o pojemności 600 μL. Przełóż zawiesiny do szklanych fiolek po 2 mL i szczelnie je uszczelnij gumowymi kapslami.
   2. Ostrożnie włóż sondę iglicową elektrody tlenowej przez gumową nakrętkę do zawieszenia, aby monitorować poziom rozpuszczonego tlenu za pomocą igłowego metra typu O₂ .
   3. Szybko dodaj roztwór K₃[Fe(CN)₆] (10% masy w 100 μL wodzie ultraczystej) do zawiesiny za pomocą igły strzykawki i nieustannie rejestruj zmianę poziomu tlenu.
   4. Oblicz uwolniony tlen, odejmując maksymalną wartość obserwowaną po dodaniu K₃[Fe(CN)₆] od wartości początkowej przed dodaniem. Znormalizuj uzyskane wartości do tlenu uwalnianego z tej samej ilości wolnego Hb (rysunek 6F) według Origin 2022. Zmierz trzy próbki niezależne (n = 3) dla wolnego Hb lub każdego NP.
      UWAGA: NP Hb@HP-UiO-66-N₃ i Hb@HP-UiO-66-PEG wykazują porównywalne uwalnianie tlenu, każdy uwalniając ~60% tlenu uwalnianego przez wolny Hb.
10. Pomiar ODC i obliczenia p50 oraz Hill-n
    1. Przygotuj wolne bédne Hb lub Hb@HP-UiO-66-PEG NP przy końcowym stężeniu Hb ~1 mg ^mL-1 w buforze soli fizjologicznej HEPES 3 mL (20 mM HEPES, 0,9% (z w/w) NaCl, pH 7,4). Przełóż próbkę do kwarcowej kuwety wyposażonej w magnetyczny pręt mieszający.
    2. Włóż kuwetę do analizatora Hemox. Ustaw temperaturę pomiarową na 37 °C i pozwól układowi wyrównać się przy ciągłym mieszaniu, aż osiągnie się stabilny poziom bazowy.
    3. Rejestruj ODC poprzez stopniową deoxygenację w zakresie ciśnienia cząstkowego od 1 do 148 mmHg. Użyj preinstalowanego oprogramowania analizatora Hemox, aby mierzyć ODC i obliczać p50 oraz Hill-n przy użyciu domyślnych ustawień analizy. Zmierz trzy niezależne próbki (n = 3) dla każdej próbki.
    4. Eksportuj przetworzone dane i wyrysuj ODC za pomocą Origin 2022 w domyślnym formacie wykresu "Line".

8. Powtarzalność i analiza statystyczna

1. Wszystkie procedury opisane w tym protokole wykonaj co najmniej trzy niezależne razy. Przedstawij wyniki jako typowe wyniki obserwowane w tych powtórzeniach. Utrzymywanie kluczowych parametrów eksperymentalnych, takich jak czasy reakcji i temperatury, w rozsądnym zakresie, aby zapewnić powtarzalność i niezawodność dla innych użytkowników.
2. Przedstawienie charakterystyki strukturalnej (PXRD, adsorpcja-desorpcja_N2 , FTIR, ¹H NMR, SEM, UV-vis) jako reprezentatywne dane do jakościowego potwierdzenia bez przeprowadzania analizy statystycznej.
3. Raportuj pomiary ilościowe (DLS, ζ-potencjał, p50, Hill-n) jako średnią ± SD (n ≥ 3). Określ istotność statystyczną za pomocą niesparowanego dwustronnego testu Welcha lub jednokierunkowego ANOVA, w zależności od stosowności. Wskazywanie poziomów istotności jako ns (brak istotności), * = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001.

Wyniki

Pomyślną syntezę NP HP-UiO-66-NH₂ potwierdził PXRD (Rysunek 2A), który wykazał charakterystyczne piki dyfrakcyjne w 2θ = 7,3°, 8,4° i 25,7°, co dobrze odpowiada symulowanej strukturze UiO-66³⁶. Niewielkie rozszerzenie szczytu względem symulowanego wzoru przypisano nanoskalowym wymiarom cząstek oraz potwierdzeniu zachowania integralności krystalicznej po syntezie⁵⁴. Całkowite usunięcie DA potwierdzono spektroskopią NMR ¹H p...

Dyskusja

Protokół ten oferuje solidną i powtarzalną drogę syntezy, funkcjonalizacji i charakteryzacji NP HP-UiO-66 zaprojektowanych do enkapsulacji Hb i dostarczania tlenu. Przyjmując podejście inżynieryjne od środka na zewnątrz, prace te ustanawiają uogólnione ramy projektowania NP MOF do zastosowań biomedycznych, w tym biomakrocząsteczek i dostarczania leków. Chociaż koncepcja materiału podstawowego i funkcjonalna wydajność były już wcześniej raportowane, obecny protokół znacząco rozszerza wcześniejsze prace, kładąc nacisk na p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-amino-1,4-benzenodoksylowy kwas	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	381071-25G
4-(2-hydroksyetylo)piperazyna-1-etansulfonowy kwas	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	H3375-100G
Aceton (99%)	VWR International (Sø borg, DK)	23J244030
Badanie białka kwasu bicynchoninowego	Thermo Fisher Scientific (Roskilde, DK)	23235
Krew bydła	SSI Diagnostica A/S (Hiller & Oslash; d, DK)	77667
Rurka wirówkowa
Wirówka	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, USA)	75009903	Seria Megafuge ST Plus
Tlenek deuteru	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	151882
Dibenzocyklooktyno-polietylenowy glikol	BroadPharm	BP-23949
Kwas dodekanonowy	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	L556-1KG
Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle' s średnio-minus; wysoki poziom glukozy	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	11965092
Etanol (100%)	VWR International (Sø borg, DK)	24L044013
Spektroskopia podczerwieni z transformacją Fouriera	Bruker (Billerica, USA)
Analizator hemoksygenu	TSC Scientific Crp (PA, USA)
Plazma cytowana ludzka	TebuBio	SER-PLP25
Kwas solny (37%)	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	320331-500ML
Oprogramowanie ImageJ	Narodowe Instytuty Zdrowia (USA)		Wersja 1.47t
Siatka Cu z koronką i węglem (siatka 300)	Agar Scientific Ltd., (Stansted Essex, Wielka Brytania)	AGS166-3H
Mieszadła magnetyczna	IKA-Werke GmbH & Kompania KG (,DE)	Ident. Nr.: 0010011496
MestReNova sofeware	Mestrelab Research (Hiszpania)		Wersja 12
Analizator powierzchni Tristar Micromeritics	Thermo Fisher Scientific Inc	ASAP 2020 Plus
Mini wirówka	Eppendorf Nordic (Hø rsholm, DK)	Nr katalogowy   5452000010
Serum myszy	Innowacyjne badania (Novi, MI, USA)	IGMSCD1SER10ML
Piec tłumiczy	Nabertherm GmbH (Brema, DE)	Piec tłumiczy LE 6/11
N,N′-dimetyloformamid (99,9%)	VWR International (Sø borg, DK)	250131a008
Sprzęt Nanodrop 2000c	Thermo Fisher
Rezonans magnetyczny jądrowy	Bruker (Billerica, USA)
O2 metr	PreSens (Ratyzbona, Niemcy)
Oprogramowanie Origin 2022	OriginLab Corporation (MA, USA)		Wersja 2022
Czujnik tlenu	PreSens (Ratyzbona, DE)	Ślad OXY-1 ST
Fosforanem buforowana sól fizjologiczna	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	P4417-50TAB
Czytnik płyt	Tecan Group Ltd.  (Mä nnedorf, CH)
Heksacyjanoferian potasu	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	60299-100G
Wodorotlenek potasu	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	221473-500G
Dyfrakcja rentgenowska proszku,	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Wielka Brytania)		Model: Malvern Panalytical Aeris Research 600W XRD do pomiarów proszku (wydane w 2020 roku)
Naczynie ciśnieniowe z okrągłym dnem	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	SYNP170004-1EA
skaningowa mikroskopia elektronowa	Kompania FEI (Hillsboro, USA)	Dual Beam FEI Helios Nanolab 600
kloryd sodu & nbsp;	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	71376
Ditionit sodu & nbsp;	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	71699-250G
Dodecylosiarczan sodu & nbsp;	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	L4509-100G
Synthware™ Zbiornik ciśnieniowy z okrągłym dnem	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	SYNP170003
Azotyn tert-butylo	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	20370-100ml-F
Tetrahydrofuran (99,7%)	VWR International (Sø borg, DK)	201022A004
Termowstrząs	Grant Instruments (Cambridge) Ltd (Wielka Brytania)	PHMT-PSC18 (01012015020119)
Transmisyjna mikroskopia elektronowa	Kompania FEI (Hillsboro, USA)	FEI Tecnai T20
Trymetylosilylazol	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	155071-10G
TSC HEMOX DAQ System	TSC Scientific Crp (PA, USA)		Oprogramowanie analizatora hemox
Ultrosound sonicator	Branson Ultrasonics Corporation (Danbury, USA)	SKU: 2410240003
UV-Vis spektrofotometr	Shimadzu (Kioto, JP)
Piekarnik próżniowy	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, USA)
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Wielka Brytania)	Numer seryjny. MAL1188530
Chlorek cyrkonu(IV)	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	357405-100G