$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Przygotowanie próbki
Separacja białek od mąki ciecierzycy (CF)
Kabulska ciecierzyca (Cicer arietinum L.), zebrana w sezonie wegetacyjnym 2025 i pozyskana z południowo-wschodniej Turcji, była przetwarzana przy użyciu systemu mielenia powietrznego opartego na uderzeniach, w którym cząstki były poddawane siłom odśrodkowym i powtarzającym się uderzeniom tarczy mielnej i zębatki pierścieniowej. Po początkowym etapie wstępnego mielenia, grube ziarnistości były dalej mielone, aby uzyskać CF przy użyciu młyna klasyfikującego powietrze. Podczas frezowania uderzeniowego zastosowano przepływ powietrza 40-45 m3/h, prędkość klasyfikatora 7 000-8 000 obr./min oraz prędkość posuwu 200 kg/h, zgodnie z wcześniej zgłaszanymi warunkami pracy oraz protokołem optymalizacji wewnętrznego, opisanym w literaturze8.
Szczegółowe frakcje bogate w białka zostały następnie uzyskane z CF poprzez klasyfikację powietrzną w temperaturze otoczenia, przy użyciu tego samego systemu klasyfikującego powietrza. Prędkość koła klasyfikującego została ustawiona na 10 000 obr./min, podczas gdy prędkość posuwu utrzymywano na poziomie około 200 kg/h, a przepływ powietrza na 52 m³/h, jak wcześniej opisano8. Ten etap separacji selektywnie wzbogacał frakcję białka na podstawie różnic w rozmiarze, gęstości i właściwościach aerodynamicznych cząstek.
Po klasyfikacji powietrznej, powstały proszek wykazywał rozkład drobnych rozmiarów cząstek (d(0,9) = 20-22 μm); dlatego nie zastosowano żadnego kroku sitowania, aby uniknąć utraty materiału i niepotrzebnych naprężeń mechanicznych. Frakcja wzbogacona w białko była bezpośrednio pakowana w 25 kg worków polietylenowych z przepłukanym gazem i przechowywana w temperaturze 4 °C, aby zminimalizować pochłanianie wilgoci i zachować właściwości funkcjonalne do dalszego przetwarzania.
Przygotowanie nanoemulsji
CPC był używany jako jedyny emulgator do przygotowania oleju w wodzie (O/W) NE, które w ostatecznej formulacji osiągały aktywne stężenie białka 3,0% w/v. To stężenie wybrano na podstawie wstępnych badań przesiewowych 1,0% w/v, 2,0% w/v oraz 3,0% w/v CPC, które wykazały, że 3,0% zapewniło najskuteczniejsze zmniejszenie wielkości kropelek i najwyższą krótkoterminową stabilność fizyczną. Na podstawie zmierzonej zawartości białka w proszku CPC (44,8% w/w), wymagane stężenie proszku obliczono na 6,67% w/v. CPC pełniło funkcję emulgator w fazie ciągłej wodnej, natomiast olej trójglicerydowy średniołańcuchowy (MCT) był stosowany wyłącznie jako faza rozproszona w stężeniu oleju przy stałym stężeniu 5,0% v/v, co odpowiada 5,0 mL oleju na 100 mL. W żadnej formulacji nie stosowano niskomolekularnych surfaktantów9.
Dyspersja CPC w wodnym momencie została przygotowana przez rozpuszczenie obliczonej ilości proszku CPC w ultraczystej wodzie pod ciągłym mieszaniem magnetycznym z częstotliwością 800 obr./min przez 1800 sekund, aby zapewnić pełne uwodnienie i jednorodną dyspersję białek. Całkowite nawodnienie potwierdzono brakiem widocznych cząstek lub osadów.
Faza olejowa była następnie powoli dodawana do uwodnionego roztworu CPC przy ciągłym mieszaniu, a następnie nastąpiła homogenizacja o wysokim ścinaniu przy 12 000 obr./min przez 240 s, co dało grubą (konwencjonalną) emulsję, wizualnie rozpoznawalną po jednolitym, nieprzezroczystym wyglądzie bez widocznego rozdzielania oleju. Warunki te zostały wybrane tak, aby uniknąć agregacji białek, jednocześnie zapewniając wystarczające zakłócenie kropelek.
NE zostały następnie uzyskane przez sondowanie grubej emulsji o amplitudzie 30% przez 180 s, przeprowadzane w kąpieli lodowodowodniej, aby utrzymać temperaturę próbki poniżej 30 °C i zapobiec agregacji białek. Podczas sonacji monitorowano temperaturę okresowo. Wstępne eksperymenty optymalizacyjne (dane nie pokazano) oceniły czasy sonifikacji 60 s, 120 s i 180 s, a jako optymalny stan wybrano 180 s, opierając się na powtarzalnym tworzeniu NE o średnicy kropli poniżej 200 nm i niskim PDI. Dlatego wszystkie NE zgłoszone w tym badaniu zostały przygotowane z wykorzystaniem zoptymalizowanego czasu sonifikacji wynoszącego 180 s.
Udana formacja NE była wspierana przez pojawienie się stabilnej, lekko opalizującej dyspersji bez separacji fazowej po 1800 sekundach stoienia. Próbki wykazujące widoczne kremowanie lub separację fazową zostały wykluczone z dalszej analizy. Wszystkie próbki zostały wyrównane do temperatury pokojowej (25 ± 2 °C) przed charakterystyką fizykochemiczną9.
UWAGA: Obsługa sprzętu o wysokiej energii (homogenizator i sonikator) była prowadzona zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa laboratoryjnego. Podczas sonifikacji stosowano ochronę słuchu i osłonę przeciwrozbryzgową. Podczas przygotowania emulsji nie używano kwasów ani zasad; dlatego nie było wymaganych żadnych działań neutralizacji chemicznej ani utylizacji odpadów niebezpiecznych.
Charakterystyka żywieniowa i fizykochemiczna mąki ciecierzycowej (CF) oraz koncentratu białka ciecierzycy (CPC)
Analiza kompozycyjna
Skład odżywczy próbek CF i CPC został określony za pomocą oficjalnych metod analizy Stowarzyszenia Oficjalnych Chemików Analitycznych (AOAC). Włókno surowe analizowano według AOAC 991,43, popiół całkowity według AOAC 923,03, tłuszcz surowy według AOAC 920,39, a białko surowe według AOAC 984,13, przy użyciu współczynnika konwersji azot-białko N × 6,25. Całkowita zawartość węglowodanów we wszystkich próbkach została określona przez różnicę poprzez odejmowanie sumy procentów wilgoci, białka, tłuszczu i popiołu od 100%3.
Analiza kolorów
Parametry kolorów próbek mierzono za pomocą kolorymetru stołowego pracującego w trybie odbicia. Przed pomiarem instrument był standaryzowany według czarno-białych standardów kalibracyjnych dostarczonych przez producenta. Aby zapewnić jednolite i powtarzalne pomiary, 5,0 g sproszkowanej próbki delikatnie załadowano do okrągłej szklanej kuwety (średnica wewnętrzna 64,0 mm), aby uzyskać gładką, jednorodną powierzchnię. Zastosowano odpowiednią grubość warstwy (≥ 50,0 mm), aby zminimalizować wpływ efektów podłoża i tła oraz uczynić przezroczysty proszek skutecznie nieprzezroczystym w warunkach refleksji. Wszystkie pomiary przeprowadzano w trybie odbicia w temperaturze pokojowej.
Współrzędne kolorów wyrażono w przestrzeni kolorów CIELAB, gdzie L* oznacza jasność (0 =, 100 = biały), a* oznacza oś czerwono-zielona, a b* oś żółto-niebieska. Dodatkowe parametry kolorów, w tym całkowita różnica barw (ΔE*), chrominacja (C*), kąt barwy (H°) oraz indeks barwy (CI), zostały obliczone zgodnie z równaniami opisanymi w11 (równania 1–4) w następujący sposób:
(Równanie 1)
(Równoleg 2)
(Równie 3)
(Egz. 4)
Analiza pH
pH próbek CF i CPC było określane za pomocą cyfrowego miernika pH wyposażonego w szklaną elektrodę, wkładając elektrodę bezpośrednio do dyspersji próbki w temperaturze 25,0 ± 2,0 °C. Przed pomiarem miernik pH był kalibrowany przy użyciu standardowych roztworów buforowych (pH 4,0 i 7,0). Wszystkie pomiary przeprowadzono w trzech egzemplarzach (n = 3), aby zapewnić analityczną powtarzalność.
Zawartość wilgoci
Resztkowa wilgotność próbek CF i CPC została określona za pomocą szybkiego analizatora wilgoci działającego w kontrolowanych warunkach ogrzewania. Wszystkie pomiary przeprowadzono w trzech egzemplarzach (n = 3), aby zapewnić analityczną powtarzalność.
Charakterystyka strukturalna i funkcjonalna CPC
Analiza XRD
Analiza XRD CPC została przeprowadzona za pomocą laboratoryjnego dyfraktometru rentgenowskiego wyposażonego w promieniowanie Cu-Kα (λ = 1,5406 Å). Dyfraktogramy rejestrowano w zakresie 2θ od 10° do 90° z częstotliwością skanowania 2,5° min-1, pracując przy 40 mA i 45 kV, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą12.
Identyfikacja pików, odejmowanie tła oraz dopasowanie krzywej wykonywano za pomocą standardowego oprogramowania do analizy XRD. Stopień krystaliczności obliczono jako stosunek całkowitej powierzchni odbić krystalicznych do całkowitej powierzchni pod dyfraktogramem, zgodnie z metodą opisaną przez13, jak pokazano w równaniu (5):
(Pas 5)
Pozorny rozmiar krystalitu (D) oszacowany na podstawie danych XRD za pomocą równania Scherrera (równanie 6), zastosowanego do najintensywniejszych pików dyfrakcji:
(Napr. 6)
gdzie D to pozorny rozmiar krystalitu (nm), K to współczynnik kształtu (zakładany jako 0,9), λ to długość fali rentgenowskiego, β to pełna szerokość przy połowie maksimum (FWHM, w radianach) wybranego piku dyfrakcyjnego, a θ to kąt Bragga.
Analiza kalorymetrii skanialnej różnicowej (DSC)
Analiza różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) CF i CPC została przeprowadzona za pomocą laboratoryjnego kalorymetru różnicowego skanowania. Dokładnie zważono i zapieczętowano około 10,0 ± 0,1 mg próbki w wklęsłym aluminiowym tyglu z przebitą pokrywką, natomiast jako punkt odniesienia użyto pustego aluminiowego tygla. Pomiary przeprowadzono w atmosferze azotowej (20 mL/min), aby zminimalizować efekty oksydacyjne. Próbki podgrzewano od 0 °C do 400 °C przy stałej częstotliwości nagrzewania 5 °C min-1 w warunkach dynamicznego skanowania. Przed analizą przeprowadzono kalibrację temperatury i czułości, aby zapewnić dokładność pomiaru i powtarzalność.
Przejścia termiczne charakteryzowano poprzez określenie temperatury początkowej (To), temperatury szczytowej (Tp), temperatury końcowej (Te) oraz zmiany entalpii (ΔH) związanych z każdym przejściem. Ponadto endotermiczna szerokość szczytu (EPW) oraz indeks szczytowej wysokości (PHI) były obliczane zgodnie z równaniami. (7) i (8), odpowiednio:
EPW= (Te−Tp) (Napr. 7)
PHI =ΔH/(Tp− To) (Równanie 8)
Zdolność pienienia (FC) i stabilność (FS)
Wartość pienienia (FC) i stabilność piany (FS) dyspersji wodnej CPC (3,0 g/L) oceniono przy pH 7,0, dostosowano w razie potrzeby przy użyciu kwasu solnego 0,1 N (HCl). 30 mL aliquot dyspersji białek zostało przeniesione do 50 mL polipropylenowych wirówek i ujednoliczone za pomocą wysokoobrotowego homogenizatora pracującego z prędkością 11 000 obr./min przez 120 sekund, aby wygenerować pianę. Powstawanie piany zostało wizualnie potwierdzone przez szybki wzrost objętości próbki oraz powstanie stabilnej warstwy piany bezpośrednio po homogenizacji.
FC obliczono jako procentowy wzrost objętości bezpośrednio po ujednoliceniu, natomiast FS na podstawie objętości zachowanej po 600 s, 1 800 s, 3 600 s i 7 200 s. Wszystkie pomiary wykonywano w trzech egzemplarzach (n = 3), a wartości FC i FS obliczono zgodnie z równaniami. (9) oraz równania. (10), odpowiednio14:
(Napr. 9)
(Egz. 10)
UWAGA: Rozcieńczony kwas solny był traktowany przy użyciu odpowiednich środków bezpieczeństwa laboratoryjnego, w tym rękawiczek i ochrony oczu. Roztwory odpadów były utylizowane zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa chemicznego instytucji.
Fizykochemiczna stabilność CPC i NE opartych na CPC
Średni rozmiar cząstek i rozkład rozmiarów cząstek
Rozkład wielkości cząstek oraz średnia hydrodynamiczna Z średnicy próbek zostały określone za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Średnia średnica hydrodynamiczna Z oraz wskaźnik polidyspersności (PDI) zostały zarejestrowane, aby scharakteryzować średni rozmiar kropli i jednorodność rozkładu rozmiarów, odpowiednio15,16.
Przed pomiarem próbki rozcieńczano wodą destylowaną w stosunku 1:100 (v/v), aby zminimalizować efekty wielokrotnego rozpraszania i zapewnić wiarygodne pomiary rozpraszania światła. Analizy przeprowadzono w kontrolowanej temperaturze 25 ± 2 °C. PDI był używany jako wskaźnik jednorodności rozkładu wielkości kropli (droplet), przy czym niższe wartości PDI odpowiadały węższym rozkładom rozmiarów. Pomiary przeprowadzono w dniu 0 (świeżo przygotowane NE) oraz po 7 dniach przechowywania, aby ocenić krótkoterminową stabilność fizyczną układuNE 16. Próbki wykazujące widoczne kremowanie, sedymentację lub separację fazową przed pomiarem zostały wykluczone z analizy DLS.
ζ-potencjał cząstek
Potencjał ζ próbek został określony w celu oceny całkowitej powierzchniowej ładunku i stabilności elektrostatycznej kropelek za pomocą elektroforetycznego rozpraszania światła (ELS), zgodnie z wcześniej opisanymi metodami15,16. Pomiary przeprowadzono w kontrolowanej temperaturze 25,0 ± 2 °C, a do zachowania oryginalnego środowiska jonowego NE użyto nierozcieńczonych próbek.
Dla każdej próbki obliczono średnie wartości ζ-potencjału oraz odpowiadające im odchylenia standardowe, aby ocenić interakcje elektrostatyczne i stabilność koloidalną emulsji. Wszystkie pomiary wykonywano z użyciem wody jako dyspersantu, zgodnie z ustalonym
wewnętrzna standardowa procedura operacyjna15. Próbki wykazujące widoczne rozdzielenie fazowe lub kreming przed analizą zostały wykluczone z pomiarów ζ-potencjału.
Walidacja metod i oczekiwane wyniki
Walidacja metody została osiągnięta poprzez ocenę kluczowych parametrów fizykochemicznych, w tym średnicy hydrodynamicznej średniej Z, PDI, potencjału ζ oraz stabilności fizycznej pod obciążeniem. Pomyślne wykonanie protokołu wspierała powtarzalna formacja NE o rozmiarze kropli poniżej 200 nm i PDI ≤0,30. Aby dodatkowo potwierdzić stabilność wykraczającą poza proste przechowywanie, przeprowadzono test obciążeniowy wirowania przy 4000 obr./min przez 900 sekund. Brak widocznego rozdzielenia fazowego lub kremowania po wirówce, w połączeniu ze spójnym profilem potencjału ζ i pH przez 7 dni przechowywania, łącznie wspiera solidną zdolność emulgacji CPC oraz powtarzalność proponowanego protokołu.
Analiza statystyczna
Pomiary składowe i funkcjonalne przeprowadzano w trzech egzemplarzach (n=3), natomiast analizy strukturalne (XRD i DSC) jako pojedyncze pomiary, reprezentatywne serie. Wyniki przedstawiane są jako wartość średnia ± odchylenia standardowego (SD). Analizy statystyczne przeprowadzano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) za pośrednictwem oprogramowania SPSS. We wszystkich analizach wartość p < 0,05 była uznawana za istotną statystyczną. W przypadkach, gdy zidentyfikowano istotne różnice, stosowano test Tukey'a Szczerze Istotnej Różnicy (HSD) pooperacyjnie stosowany do wielokrotnych porównań. Statystyczne litery łączące (np. a, b, c) przedstawione w tabelach i rysunkach zostały wyprowadzone z wyników testu Tukey HSD; Oznacza, że dzielenie tej samej litery nie różni się znacząco na poziomie 5% istotności.