Metoda in vitro do oceny interakcji laserowo-tytanowych z użyciem laserów Er, Cr:YSGG oraz diodowych

Summary

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę in vitro do oceny wpływu termicznego i powierzchniowego na tytan podczas napromieniowania laserem Er, Cr:YSGG oraz diodowym laserem, przy użyciu zalecanych przez producenta ustawień cięcia tkanek miękkich. Bezpośrednia termometria kontaktowa i wielomodalna analiza powierzchni zapewniają powtarzalny sposób pracy do charakteryzowania zależnych od długości fali interakcji laserowo-tytanowych.

Abstract

Niniejsze badanie przedstawia ustandaryzowany protokół in vitro do oceny odpowiedzi termicznej i zmian powierzchni tytanu podczas napromieniowania laserem Er, Cr:YSGG oraz diodowym w zalecanych przez producenta warunkach tkanek miękkich. Specjalne cylindry tytanowe klasy 4 z wewnętrznym kanałem umożliwiały bezpośrednie pomiary temperatury za pomocą wbudowanej termopary, umożliwiając kontrolowaną ocenę zmian termicznych wywołanych laserem. Aby zapewnić geometryczną spójność i zminimalizować zmienność zależną od operatora, zastosowano system stabilizacji drukowany w 3D, który ustandaryzował kąt napromieniowania, trajektorię przemiatania i ruch końcówki. Modyfikacje powierzchni po ekspozycji laserowej były charakteryzowane ilościowo i jakościowo za pomocą technik uzupełniających, w tym profilometrii do analizy chropowatości, skaningowej mikroskopii elektronowej do oceny mikromorfologicznej oraz mikroskopii siły atomowej do nanoskalowej oceny topograficznej. Napromieniowanie diodowo-laserowe powodowało podwyższenia temperatury zależne od mocy i czasu, przy czym najwyższe kombinacje parametrów przekraczały klinicznie akceptowany próg bezpieczeństwa 10 °C. Dla porównania, wszystkie testowane warunki Er,Cr:YSGG pozostały poniżej tego limitu, co wskazuje na wyraźne, zależne od długości fali zachowanie termiczne. Oba systemy laserowe indukowały istotny wzrost chropowatości powierzchni w stosunku do nieobrobionej powierzchni kontrolnej, podczas gdy analizy obrazowe ujawniły różnice zależne od długości fali w morfologii mikro- i nanoskalowej. Łącznie protokół ten zapewnia ramy eksperymentalne do systematycznego badania interakcji laser-tytan i może wspierać bezpieczniejszy, oparty na dowodach dobór parametrów dla laserowo wspomaganych procedur tkanek miękkich wykonywanych w pobliżu komponentów implantu.

Introduction

Zabiegi wspomagane laserowo tkanek miękkich są szeroko stosowane podczas drugiego etapu implantacji oraz leczenia błony śluzowej wokół implantu, gdzie napromieniowanie często zachodzi w bliskim sąsiedztwie składników^{tytanowych 1,2}. W takich sytuacjach klinicznych zrozumienie zachowania termicznego tytanu oraz potencjału zmian powierzchni jest kluczowe, ponieważ nadmierne podniesienie temperatury lub zakłócenia powierzchni mogą zagrozić integralności kości okołoimplantowej i długoterminowej stabilności implantu ^3,4. Istniejąca literatura dostarcza cennych informacji na temat interakcji laserowych z tytanem zależnymi od długości fali, jednak zmienność metodologiczna, taka jak różnice w geometrii napromieniowania, trybie kontaktu, angulacji i technikach oceny powierzchni, stanowi wyzwanie przy ustalaniu powtarzalnych i klinicznie stosowalnych progów bezpieczeństwa ^5,6,7.

Najnowsze badania coraz częściej koncentrują się na termicznych i powierzchniowych efektach różnych długości fal laserowych na tytan, szczególnie w kontekście procedur tkanek miękkich w okołoimplantach. Wykazano, że lasery diodowe indukują zależne od mocy i czas podwyższenia temperatury oraz zmiany powierzchni tytanu, przy czym niektóre ustawienia przekraczają klinicznie istotne progi termiczne, co budzi obawy dotyczące bezpieczeństwa termicznego w pobliżu komponentów implantu 8,9,10,11. Natomiast lasery oparte na erbie, w tym systemy Er,Cr:YSGG, wykazują interakcje specyficzne dla długości fali, charakteryzujące się silnym pochłanianiem wody i mechanizmami hydrokinetycznej ablacji, które mogą ograniczać nadmierny transfer ciepła i uszkodzenia powierzchni w odpowiednich warunkach 12,13,14. Pomimo tych postępów, zgłaszane wyniki pozostają niejednorodne z powodu różnic w konstrukcji eksperymentów oraz braku ustandaryzowanych metodologii.

Wcześniejsze badania analizowały zmiany temperatury 9,10,11,15, modyfikację powierzchni indukowaną laserowo 14,16,17 oraz specyficzne aspekty optycznej absorpcji tytanu ⁷, jednak wiele modeli eksperymentalnych nie miało standaryzowanej kontroli parametrów takich jak kąt włókna, kontakt z powierzchnią końcówki czy jednolitość przemiatania. Te różnice mogą wpływać na dostarczanie energii i komplikować porównania między badaniami. Dodatkowo, stosowanie obrazowania pojedynczej modalności w kilku raportach ograniczyło możliwość wykrywania zmian mikro- i nanoskalowych zależnych od długości fali na powierzchniach tytanu^16,18. Bardziej zintegrowane ramy analityczne mogą zatem zwiększyć interpretowalność i znaczenie kliniczne badań nad interakcją laserowo-tytanową¹².

Aby uzupełnić te luki metodologiczne, niniejsze badanie wprowadza ustandaryzowany protokół in vitro do oceny interakcji laserów Er, Cr:YSGG oraz diodowych z powierzchniami tytanowymi przy klinicznie istotnych, zalecanych przez producenta parametrów cięcia tkanek miękkich. Hipotezowano, że lasery Er, Cr:YSGG oraz diodowe, pracujące w zalecanych przez producentów warunkach tkanek miękkich, będą powodować wyraźne, zależne od długości fali różnice w odpowiedzi termicznej i modyfikacji powierzchni tytanu. Protokół wykorzystuje specjalnie obrabiane cylindry tytanu klasy 4 z wewnętrznym kanałem termoparowym, umożliwiając bezpośrednie pomiary temperatury bazowej i po napromieniowaniu kontaktowym oraz minimalizację artefaktów często kojarzonych z zewnętrznymi sondami.

Sztywny system stabilizacji drukowanej w 3D utrzymuje stały kąt napromieniowania, kontrolowaną trajektorię rękodziałki oraz stały tryb kontaktu, zmniejszając zmienność zależną od operatora i zapewniając powtarzalne dostarczanie energii.

Kluczową zaletą tego protokołu jest jego wielomodalna strategia ewaluacji, łącząca ocenę termiczną, profilometryczną analizę chropowatości oraz obrazowanie SEM i AFM w wysokiej rozdzielczości. To zintegrowane podejście umożliwia jednoczesną charakterystykę makroskopowego zachowania termicznego, mikroskalowych zmian morfologicznych oraz nanoskalowych zmian topograficznych, oferując bardziej kompleksową ocenę niż techniki jednoparametrowe powszechnie stosowane we wcześniejszych badaniach 9,10,15,18 . Dzięki wizualnie demonstrowalnemu i metodologicznie kontrolowanemu workflow, protokół ten tworzy powtarzalną platformę do porównywania interakcji laserów Er, Cr:YSGG oraz diodowych z powierzchniami tytanowymi.

Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiona tutaj metodologia ma na celu wsparcie rozwoju klinicznie istotnych, specyficznych dla długości fali progów bezpieczeństwa dla ekspozycji na implanty drugiego etapu wspomaganego laserem oraz innych procedur tkanek miękkich okołoimplantowych 10,11,13.  

Protocol

Przygotowanie próbek tytanu
Cylindry tytanu klasy 4 (5 mm × 10 mm, piaskowana powierzchnia trawiona kwasem (SLA)) były czyszczone etanolem 70% przez 30 sekund. Okazy umieszczano na czystej powierzchni i suszono na powietrzu przez 10 minut. Sprawdzono płaską powierzchnię napromieniowania każdego cylindra, aby potwierdzić brak widocznych zanieczyszczeń. Każdy cylinder umieszczono w uchwytie stabilizującym wydrukowanym w 3D, z płaską powierzchnią skierowaną ku górze i dostępnym szczeliną termopary bocznej. Wszystkie odpady etanolowe oraz wszelkie skażone materiały zużywalne powstałe podczas przygotowywania i czyszczenia próbek zostały zebrane i utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego zarządzania odpadami laboratoryjnymi.

Przygotowania środowiskowe i bezpieczeństwa
Wszystkie eksperymenty prowadzono w kontrolowanym środowisku laboratoryjnym w temperaturze 27 °C. Temperatura otoczenia była nieprzerwanie monitorowana przez cały czas za pomocą cyfrowego termometru umieszczonego obok zestawu eksperymentalnego. Podczas aplikacji laserowej stosowano okulary ochronne odpowiednie do długości fali. Obiekty odblaskowe zostały usunięte z miejsca pracy, a systemy laserowe zostały włączone i umożliwione wykonaniu wewnętrznych procedur samokontroli przed użyciem. (Rysunek 1).

Rysunek 1: Systemy laserowe stosowane do napromieniowania. (A) Laser diodowy. (B) Eee, Cr:YSGG laser. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Losowość i przydział grup
Wszystkie cylindry tytanowe zostały ponumerowane i losowo przydzielone do 13 grup badawczych przy użyciu komputerowej listy losowej, w tym sześciu grup Er,Cr:YSGG, sześciu grup diodowych oraz jednej grupy kontrolnej. Przydziały grup i parametry lasera są podsumowane w Tabeli 1. Każdy okaz był oznaczony unikalnym kodem identyfikacyjnym, aby zapewnić śledzenie w trakcie eksperymentu, zgodnie z przypisaną grupą.

Oznaczenie grupy	Używany system laserowy	Liczba okazów	Zastosowanie ustawienia mocy (W)	Czas naświetlania
D1	Dioda	8	1.2 W	20
D2		8	1.2 W	40
D3		8	1.7 W	20
D4		8	1.7 W	40
D5		8	2.2 W	20
D6		8	2.2 W	40
E1	Eee, Cr:YSGG	8	2,75 W	20
E2		8	2,75 W	40
E3		8	3,75 W	20
E4		8	3,75 W	40
E5		8	4,75 W	20
E6		8	4,75 W	40
C	Kontrola	8

Tabela 1: Przegląd grup badawczych eksperymentalnych i parametrów laserowych.

Stabilizacja okazów w uchwytie wydrukowanym w 3D
Do napromieniowania uchwyt stabilizujący drukowany w 3D był mocowany do sztywnej tacy, aby zapobiec ruchowi podczas aplikacji laserowej. Każdy tytanowy cylinder był wkładany pionowo do wyznaczonego otworu, z płaską powierzchnią skierowaną w stronę ścieżki napromieniowania. Uchwyt utrzymywał stały kąt napromieniowania 15°, standaryzując geometrię interakcji między końcówką lasera a powierzchnią tytanową. Rękodzieło prowadzono wzdłuż kanału uchwytu, aby zapewnić stałą trajektorię napromieniowania na próbkach.

Umieszczanie termopary i pomiary temperatury bazowej
Termopara typu K była wprowadzana do centralnego kanału każdego cylindra tytanowego, aż osiągnięto stabilny kontakt metal-metal (Rysunek 2). Termopara była podłączona do cyfrowego multimetru ustawionego na tryb temperatury (°C). Temperatura bazowa była rejestrowana po stabilizacji, definiowana jako okres wahań temperatur poniżej 0,1 °C przez 30 sekund.

Rysunek 2: Cylindry tytanowe z kanałem termopary. (A) Widok boczny. (B) Widok boczny odwrotny. (C) Widok wierzchołkowy kanału termopary. (D) Widok koronowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Er,Cr:YSGG napromieniowanie laserowe
Er,Cr:YSGG laserowe napromieniowanie wykonywano w ciągłych warunkach rozprysku powietrza i wody. Końcówka lasera była ustawiona w bezpośrednim kontakcie z powierzchnią tytanu pod stałym kątem 15°. Grot był przesuwany po liniowej ścieżce o szerokości 5 mm z prędkością 1 cm/s. Ponieważ napromieniowanie wykonywano w warunkach bezpośredniego kontaktu, efektywna średnica interakcji lasera odpowiadała mniej więcej producentowi średnicy końcówki 500 μm. Próbki były napromieniowane kombinacjami moc–czas 2,75 W, 3,75 W lub 4,75 W przez 20 s lub 40 s.

Napromieniowanie laserem diodowym
Napromieniowanie laserem diodowym wykonywano w trybie fali ciągłej, używając światłowodu o średnicy 400 μm w bezpośrednim kontakcie z powierzchnią tytanu pod stałym kątem 15°. Światłowód był przesuwany wzdłuż liniowej ścieżki o szerokości 5 mm z prędkością 1 cm/s. Efektywny ślad kontaktu na powierzchni tytanu był określany przez średnicę włókna używaną w trybie bezpośredniego kontaktu. Próbki były napromieniowane kombinacjami czasowo-mocno-mocowymi 1,2 W, 1,7 W lub 2,2 W przez 20 s lub 40 s.

Pomiar temperatury i obliczanie ΔT
Bezpośrednio po napromieniowaniu laserowym temperaturę po napromieniowaniu rejestrowano za pomocą termopary podłączonej do cyfrowego multimetru. Zmiana temperatury (ΔT) została obliczona jako różnica między temperaturą po napromieniowaniu a temperaturą bazową. Każdy próbek był napromieniowany tylko raz, a na tym samym okazie nie przeprowadzono powtarzających się zastosowań laserowych.

Profilometryczne pomiary chropowatości powierzchni
Po pomiarach termicznych powierzchnie napromieniowane były czyszczone sprężonym powietrzem wolnym od oleju. Każdy okaz był montowany na stopniu profilometru, a obszar 2 × 2 mm skanowano przy użyciu siły igły 4 mN, prędkości skanowania 0,5 mm/s i długości odcięcia 0,8 mm. Wykonano pięć skanów na każdą okazkę, a średnią wartość Ra obliczono (Rysunek 3).

Rysunek 3: Eksperymentalny przepływ pracy. Przygotowanie próbek, umieszczanie termopar, napromieniowanie laserowe, rejestracja temperatury, profilometria, analizy SEM i AFM. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Results

Analiza temperatury
We wszystkich grupach Er,Cr:YSGG zmiana temperatury pozostawała poniżej progu bezpieczeństwa 10 °C, z wartościami wahającymi się w zakresie od –2,65 °C do +2,20 °C. Moc miała istotny wpływ na zmianę temperatury (p < 0,001), podczas gdy czas trwania napromieniowania nie wykazywał istotnego wpływu (p = 0,898). Najniższą temperaturę zaobserwowano w E2 (2,75 W–40 s: –2,65 °C). Dla porównania, napromieniowanie laserem diodowym powodowało znacznie wyższe podwyższenia temperatury (3,25–...

Discussion

Badanie wykazało, że interakcje z tytanem laserowym są silnie zależne od długości fali, mocy wyjściowej oraz łącznych efektów mocy i czasu ekspozycji. Napromieniowanie Er,Cr:YSGG konsekwentnie powodowało podwyższenia temperatury poniżej klinicznie akceptowanego progu 10 °C związanego z termicznym uszkodzeniem kości ^3,4, podczas gdy napromieniowanie laserem diodowym wykazywało progresywne obciążenie termiczne, przekraczające ten limit przy 2,2 W zarówno przez 20, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Uchwyt stabilizujący drukowany w 3D	Na zamówienie	Wykonane na zamówienie / Nie ma zastosowania	Jednostka stabilizująca wydrukowana w 3D zaprojektowana do określenia kąta napromieniowania i ścieżki uchwytu.
Mikroskop sił atomowych (EzAFM-Compact)	Instrumenty Nanomagnetyczne, Oxford, Wielka Brytania	URL: https://www.nanomagnetics-inst.com/product/scanning-probe-microscopy/ezafm	Wykorzystywane do topografii powierzchni na skalę nanoskalową oraz charakteryzacji chropowatości.
Multimetr cyfrowy (Keithley 2000, 6½ Cyfra)	Keithley Instruments	URL: https://www.tek.com/en/products/keithley/digital-multimeter/keithley-2000-series-6-digit-multimeter-scanning	Stosowany z termoparą typu K do pomiaru temperatury.
Diodowy laser Epic (940 nm)	Biolase, Irvine, CA, USA	URL: https://www.biolase.com/products/dental-lasers-soft-tissue/epic-x/	Układ laserowy z diodą ciągłą (940 nm); regulowane 0,5– 10 W mocy; stosowany do napromieniowania tkanek miękkich.
Er,Cr:YSGG System Laserowy (Waterlase iPlus, 2780 nm)	Biolase, Irvine, CA, USA	URL: https://www.biolase.com/products/dental-lasers-all-tissue/waterlase-iplus-intl/	Er,Cr:YSGG laser (2780 nm) używany z MZ-5 Ziptip, 9 mm; działał w trybie gingivektomii z ciągłym air– Spray z wodą.
Etanol, 70% (v/v)	Ulusoy Kozmetik	URL: https://www.ulusoykozmetik.com/urun/tr/105_ulusoy-etil-alkol-70%25C2%25B0	Czyszczenie powierzchni próbek
Oprogramowanie do sterowania i analizy EzAFM	Instrumenty Nanomagnetyczne, Oxford, Wielka Brytania	URL: https://www.nanomagnetics-inst.com/product/scanning-probe-microscopy/ezafm	Wykorzystywany do sterowania AFM, akwizycji danych i przetwarzania obrazów.
IBM SPSS Statystyka 25	IBM Corp., Armonk, NY, USA	Wersja 25	Wykorzystywany do analiz statystycznych, w tym testów normalności, porównań nieparametrycznych oraz dwukierunkowej metody ANOVA.
Termopara typu K	Nieokreślona	Nie dotyczy	Sonda termopary typu K używana do pomiaru temperatury.
Oprogramowanie do sterowania mikroskopem (Quanta FEG 250)	Thermo Fisher Scientific (dawniej FEI), Hillsboro, OR, USA	URL: https://www.thermofisher.com	Używany do akwizycji obrazu SEM i sterowania przyrządami.
MZ-5 Ziptip (9 mm)	Biolaza	URL: https://store.biolase.com/products/7200712-pkg-mz5-9mm-ziptips-20-pack-wl-md	Końcówka używana z rękodziełem Er,Cr:YSGG.
Sprężone powietrze bez oleju	Nieokreślona	Nie dotyczy	Używany do usuwania zanieczyszczeń z powierzchni tytanu.
Wosk parafinowy	MumveMum (sprzedawane przez Trendyol)	URL: https://www.trendyol.com/mumvemum/hazir-parafin-1-kg-p-31671380	Używany do pokrywania przewodów termoparowych, aby zmniejszyć zakłócenia termiczne.
Profilometr (Surftest SJ-201)	Mitutoyo, Tokio, Japonia	URL: https://www.bergeng.com/m m5/downloads/mti/sj201.pdf?srsltid =AfmBOoq2vJN7b4UPc2Yg-aO1 zhsL64p6vFDHSWJ54M_x5gdI8 KkIJgaV	Używany do pomiarów Ra w 2 &; Obszar skanowania 2 mm.
Skaningowy mikroskop elektronowy (Quanta FEG 250)	Thermo Fisher Scientific (dawniej FEI), Hillsboro, OR, USA	URL: https://www.thermofisher.com	Obrazowanie SEM z 250 razy; – 5000 razy; powiększenia.
Wskazówki E4, 400 & mikro; m, 4 mm	Biolaza	URL: https://store.biolase.com/products/7400016-tips-e4-400-µm-4mm-surgical-30-qty	Światłowód używany do naświetlania laserem diodowym.
Cylindry tytanowe (Grade 4, powierzchnia SLA, 5&; 10 mm)	Naxis, Niemcy	Wykonany na zamówienie	Cylindry wykonane na zamówienie z wewnętrznym kanałem o średnicy 5 mm na termoparę.