Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

Summary

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o >90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Abstract

Komórki macierzyste pochodzące z apipozy (ADSC) stały się idealnymi komórkami nasion w medycynie regeneracyjnej ze względu na ich obfite źródła, minimalnie inwazyjne pozyskiwanie, potencjał różnicowania wieloliniowego oraz właściwości immunomodulacyjne. Ich zastosowania obejmują naprawę tkanek, modelowanie chorób oraz terapię komórkową; jednak efektywna izolacja wysoko żywotnych ADSC pozostaje kluczowa dla postępu badań i klinicznego tłumaczenia. Konwencjonalne metody izolacji, takie jak trawienie enzymatyczne połączone z dysocjacją mechaniczną przez pipetowanie, są ograniczone długim czasem przetwarzania (1–3 godziny), słabą żywotnością komórek (często <70%) oraz znaczną zmiennością partia do partii, co ogranicza dalsze eksperymenty.

Przedstawiamy tutaj system SoniConvert (mechaniczny system separacji komórek oparty na falach), który łączy trawienie falowe i enzymatyczne, aby sprostać tym wyzwaniom. System integruje mikroprocesorową jednostkę sterującą, która reguluje dysocjację falową mechaniczną za pomocą cyfrowego sprzężenia zwrotnego, wraz z tkankowo specyficznym odczynnikiem rozluźniającym zoptymalizowanym pod kątem tkanki tłuszczowej (inkubacja 5–15 minut). Takie podejście umożliwia szybkie przekształcenie tkanki w zawiesinę jednokomórkową, a dysocjacja mechaniczna trwa 3–9 sekund.

System oferuje trzy zalety: (1) ultraszybkie przetwarzanie, przy czym proces izolacji rdzenia — od trawienia enzymatycznego do początkowego rozdzielania frakcji komórkowej — trwa około 30 minut (redukcja >90% w porównaniu do metod konwencjonalnych); (2) wysoką zdolność zachowania żywotności, z barwieniem trypanowym potwierdzającym żywotność komórek na poziomie 80–95%, przewyższając tradycyjne protokoły; oraz (3) szeroką kompatybilność, ponieważ powstałe zawiesiny jednokomórkowe spełniają wymagania dotyczące pierwotnej hodowli komórek, cytometrii przepływowej, testów cytotoksyczności oraz budowy organoidów tłuszczowych. Skracając czas przetwarzania, poprawiając integralność komórek i ograniczając zmienność, system ten zapewnia praktyczną platformę do badań związanych z tłuszczem.

Introduction

Komórki macierzyste pochodzące z adipozy (ADSC), kluczowy podzbiór mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) izolowanych z tkanki tłuszczowej, wykazują znaczny potencjał terapeutyczny ze względu na dostępność, minimalnie inwazyjne pozyskiwanie, silną zdolność proliferacyjną, potencjał różnicowania wieloliniowego oraz silne właściwości parakrynowe i immunomodulacyjne 1,2,3,4 . Te cechy uczyniły ADSC obiecującymi kandydatami do medycyny regeneracyjnej, inżynierii tkankowej i immunoterapii. Jednak translacyjne zastosowanie ADSC zależy od możliwości izolowania funkcjonalnie nienaruszonych, wysoko czystych populacji — proces, który pozostaje technicznie wymagający. Unikalna biologia tkanki tłuszczowej wprowadza dwie główne przeszkody: (1) wysoka zawartość lipidów w adipocytach sprawia, że są one podatne na pęknięcia podczas przetwarzania mechanicznego, uwalniając wolne lipidy zanieczyszczające frakcję naczyniową stromalną (SVF), co obniża żywotność komórek i daje ^5,6; oraz (2) złożoność strukturalna tkanki, obejmująca powięź, komórki śródbłonka, komórki układu odpornościowego oraz składniki krwi⁷, utrudnia rozdzielanie komórek pochodzących z tłuszczu. Te ograniczenia podkreślają pilną potrzebę efektywnej, szybkiej i zachowującej żywotność metody izolowania wysokiej jakości ADSC i adipocytów, które są równie istotne w późniejszych zastosowaniach, takich jak modelowanie chorób metabolicznych czy terapie komórkowe.

Obecnie dostępnych jest kilka ustalonych metod izolowania komórek pochodzących z tłuszczu, w tym trawienie enzymatyczne, hodowla roślin oraz separacja mechaniczna ^8,9,10. Trawienie enzymatyczne, najczęściej stosowana metoda, wykorzystuje kolagenazę do degradacji składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), uwalniając kapsułkowane komórki macierzyste. Metoda ta zazwyczaj obejmuje mielenie tkanek, trawienie kolagenazy (37 °C, 1–2 godziny), izolację SVF przez wirowanie oraz oczyszczanie przylegających kultur. Chociaż trawienie enzymatyczne jest skuteczne w rozkładzie ECM, cierpi na istotne wady: wydłużony czas przetwarzania (łącznie 3–4 godziny), zależność od dużych objętości próbek oraz ryzyko enzymatycznej cytotoksyczności lub zmienności w poszczególnych partiach przez kolagenazy pochodzenia zwierzęcego — co utrudnia tłumaczenie kliniczne. Hodowla eksplantów, która wykorzystuje migrację komórek macierzystych z fragmentów tkanek, daje komórki o zachowanej żywotności, ale cierpi na niską przepustowość i opóźnioną regenerację komórek (7–10 dni). Dysocjacja mechaniczna, która opiera się na fizycznych zakłóceniach (np. oscylacjach, ścinaniach), skraca czas przetwarzania, ale często obniża integralność komórek, prowadząc do obniżenia żywotności i populacji nieczystych. Łącznie metody te nie pogodzają efektywności, czystości i żywotności — kluczowych kryteriów dla izolacji komórek klinicznej jakości. Dlatego proponujemy nowatorską metodę izolowania komórek pochodzących z tłuszczu (adipocytów i ADSC), która łączy trawienie enzymatyczne z dysocjacją falową^{mechaniczną 11}. To podejście przynosi dwa kluczowe postępy: (1) efektywność czasu: łącząc wstępnie zoptymalizowane, bezzwierzęce koktajle enzymów z falami mechanicznymi o niskiej częstotliwości, całkowity czas przetwarzania skraca się z 3–4 godzin do ~30 minut (Rysunek 1); (2) Zachowanie żywotności: delikatna dyspersja mechaniczna minimalizuje pęknięcie adipocytów i uwalnianie lipidów. Co istotne, 30-minutowy okres odnosi się do procesu izolacji rdzenia (trawienie, dysocjacja mechaniczna, filtracja i początkowa wirowanie) w celu uzyskania surowych frakcji adipocytów i SVF; opcjonalne dalsze etapy oczyszczania, takie jak liza czerwonych krwinek (RBC), wymagają dodatkowego czasu na obsługę.

Nasza zoptymalizowana metoda izolacji komórek tłuszczowych wykazuje znaczący potencjał zastosowania w wielu dziedzinach badań i klinicznych. W badaniach podstawowych uzyskane komórki o wysokiej żywotności wykazują wyjątkowe wyniki w badaniach różnicowania adipogenicznego i osteogennego, stanowiąc wiarygodne źródło komórek do zastosowań inżynierii tkankowej. W medycynie translacyjnej badania kliniczne wykazały terapeutyczny potencjał ADSC w leczeniu schorzeń takich jak choroba zwyrodnieniowa stawów¹², choroby sercowo-naczyniowe¹³, stwardnienie rozsiane¹⁴ oraz zapalne choroby jelit (IBD)/choroba Crohna¹⁵. Szybko izolowane ADSC stanowią idealne elementy budulcowe do budowy organoidów tkanki tłuszczowej oraz wdrażania zastosowań terapii komórkowej, znacząco przyczyniając się do rozwoju badań nad lekami i modelowania chorób. Ponadto wysokiej jakości zawiesiny jednokomórkowe są odpowiednie do sekwencjonowania pojedynczokomórkowego RNA. Podsumowując, to zintegrowane podejście tworzy solidną platformę technologiczną dla tkanki tłuszczowej, wspierając zarówno badania podstawowe, jak i translację kliniczną w medycynie regeneracyjnej.

Protocol

Wszystkie badania na zwierzętach były prowadzone zgodnie z Regulaminem dotyczącym Spraw dotyczących Zwierząt Doświadczalnych (Ministerstwo Nauki i Technologii Chin, Chin, zaktualizowane w marcu 2017) i zatwierdzone przez Komitet Etyki i Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu Rolniczego Syczuan (numer zezwolenia: 20230089). Protokół ten wymaga użycia systemu SoniConvert, komercyjnie dostępnego urządzenia do dysocjacji tkanek wspomaganej falami mechanicznymi (dalej określanego jako system dysocjacji mechanicznej). Protokół jest zoptymalizowany pod kątem tkanki tłuszczowej wieprz, a jego poleganie na tym specjalistycznym sprzęcie jest kluczowym ograniczeniem.

1. Pobieranie i przygotowanie tkanek tłuszczowych

1. Dezynfekcja przedoperacyjna i usuwanie owłosienia
   1. Uśpienie świni przez dożylne przedawkowanie pentobarbitalu sodu (100 mg/kg masy ciała). Potwierdz śmierć przed pobraniem tkanek.
   2. Stosuj sterylną gazę nasączoną 2% jodoforem do spiralnej dezynfekcji grzbietu świnki, wystając 15 cm od linii środkowej. Pozwól wyschnąć przez 30 sekund.
   3. Użyj sterylnej maszynki, aby ogolić włosy z obszaru 16 cm × 8 cm. Upewnij się, że wszystkie włosy są usunięte z miejsca operacyjnego.
   4. Przetrzyj tył 2 razy etanolem 75% za pomocą sterylnej gazy.
2. Pobieranie tkanki tłuszczowej
   1. Wykonaj 20 cm poprzeczne nacięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej sterylnym skalpelem.
   2. Podnieś krawędź cięcia sterylnymi kleszczemi. Rozciąć wzdłuż naturalnej płaszczyzny między tkanką tłuszczową a skórą skórną, aby uzyskać pełną górną warstwę podskórnej tkanki tłuszczowej (ULB) o grubości około 2–3 mm.
   3. Przepłucz ULB raz w lodowato zimnej, sterylnej soli fizjologicznej i umieść ją w naczyniu do sterylnej kultury (Rysunek 2).

Rysunek 2: Zbieranie ULB świń do izolacji komórek. (A) Ilustracja struktury tkanki tłuszczowej na grzbiecie świń; (B) Miejsce cięcia bama minipig; (C) Prezentacja tkanki tłuszczowej na plecach, podskórna tkanka tłuszczowa w pig back zawiera dwie warstwy: górną (ULB) i wewnętrzną (ILB); (D) Zebrał ULB. Skrót: ULB = górna warstwa pleców; ILB = wewnętrzna warstwa pleców. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Punkt pauzy: Zebraną tkankę tłuszczową można przechowywać w lodowato zimnym, sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub D-Hanks w temperaturze 4 °C przez krótki czas przed dalszą sekcją.
UWAGA: Celem jest zebranie ULB. Unikaj włączania dolnej warstwy tkanki tłuszczowej podskórnej (ILB) podczas rozwarstwienia.

3. Rozwarstwienie i czyszczenie tkanek tłuszczowych
   1. Dodaj 10 ml lodowatego D-Hanks Buffer na każde 1,8 g tkanki do naczynia i upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona.
   2. Zidentyfikuj i usuń wszystkie widoczne naczynia krwionośne z tkanek za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych. Usuń wszelkie tkanki łączne i włókniste. Wyrzuć usunięte materiały do wyznaczonych pojemników na zagrożenia biologiczne.
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas obsługi ostrych instrumentów; Zawsze odcinaj je od ciała i natychmiast po użyciu wyrzucaj do pojemników na ostre ostrze i nożyczki.
   3. Przepłucz tkankę w buforze D-Hanks, aby usunąć resztki krwi i zanieczyszczeń.
      UWAGA: W przypadku próbek z nadmiarem krwiaka należy wymienić bufor 1–3 razy zgodnie z potrzebą, aby uzyskać wyraźność wzroku. Wszystkie etapy sekcji należy trzymać na lodzie, aby zachować żywotność tkanek.
4. Dysocjacja mechaniczna tkanki tłuszczowej
   1. Przenieś 1,8 g wypłukanych fragmentów tkanki do sterylnej mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Dodaj do probówki 800 μL buforu dysocjacyjnego tkanki typu A (A-Buffer).
   2. Za pomocą sterylnych nożyczek okulistycznych pokrój tkankę w tubie na małe kawałki o wielkości około 1–2^{mm 3} .
      UWAGA: Jeśli podczas lub po mieleniu zaobserwowane jest znaczne wyciekanie lipidów, ponownie umyj tkankę 1 mL wstępnie schładzonego roztworu D-Hanks, a następnie przejdź do trawienia enzymatycznego w celu usunięcia lipidów z rozbitych adipocytów. Ten krok zachowuje integralność adipocytów do dalszej analizy.

2. Izolacja i homogenizacja komórek

1. Przetwarzanie enzymatyczne
   1. Dodaj 200 μL środka do dysocjacji tkanek typu A (roztwór typu A) do nowej rurki mikrowirówki. Delikatnie obróć i potrząśnij tubką ręką 3 razy, aby wymieszać zawartość i upewnić się, że fragmenty tłuszczu są całkowicie zanurzone w roztworze dysocjacyjnym.
   2. Sprawdź, czy korek rurki jest szczelnie zamknięty. Umieść tubkę w metalowej kąpieli o temperaturze 37 °C i inkubuj przez 5–10 minut.
      UWAGA: Monitoruj roztwór aż stanie się mętny, a fragmenty tkanek będą wyglądać na częściowo strawione. Roztwór typu A zawiera kolagenazę i neutralną proteazę. Noszę rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny i gogle ochronne podczas obchodzenia. Unikaj kontaktu ze skórą; Jeśli nastąpi ekspozycja, natychmiast spłukuj dużą ilością wody przez 15 minut. Bufor A nie zostanie odrzucony po dodaniu Roztworu A-Typu.
2. Dysocjacja mechaniczna wspomagana ultradźwiękową
   1. Przenieś częściowo strawione fragmenty tkanki tłuszczowej wraz z otaczającym buforem z rurki mikrowirówki do sterylnej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL przeznaczonej do mechanicznego systemu dysocjacji.
   2. Uruchom gotowy program dla tkanki apipozyjnej w systemie dysocjacji mechanicznej, aby wykonać dysocjację mechaniczną za pomocą fali sinusoidalnej o częstotliwości 200 Hz.

3. Filtracja w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki

1. Filtracja i wirowanie
   1. Zbierz zawiesinę komórkową i przepuścij ją przez sitko o pojemności 200 μm do nowej rurki wirówki 50 mL, aby usunąć duże zanieczyszczenia i niestrawione grudki tkanek.
   2. Dodaj 5 ml wstępnie schłodzonego (4 °C) roztworu D-Hanks do sitka. Przepłucz sitko roztworem D-Hanks 2 razy, aby zmaksymalizować wydajność ogniwa.
   3. Wiruj przefiltrowaną zawiesinę ogniwową w stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      Punkt pauzy: Po wirowaniu zawiesina komórkowa może być natychmiast przetwarzana lub przechowywana na lodzie przez krótki czas przed separacją warstw.
   4. Zbieranie adipocytów: Aby zebrać adipocyty, aspiruj i odrzucaj nadnatrętną warstwę lipidową za pomocą sterylnej pipety pasteura, pozostawiając 1 mL buforu chroniącego warstwę adipocytów. Zbierz drugą warstwę do dalszej analizy adipocytów. Unikaj naruszania trzeciej i czwartej warstwy.
   5. Kolekcja SVF (frakcji naczyniowej stromalnej): Po usunięciu górnych warstw delikatnie zawiesz dolny pellet zawierający frakcję naczyniową stromalną (SVF) w 1 mL D-Hanks/PBS. Delikatnie zawiesz pellet komórkowy w 1 mL D-Hanks/PBS, aby uzyskać stężenie komórkowe 2–5 × 10^{6 komórek} /mL.
      UWAGA: Idealnie po wirowaniu można zaobserwować cztery warstwy: warstwę lipidową na górze; druga warstwa zawiera adipocyty; trzecią jest warstwa buforowa hydrofilowa; a dolną warstwą jest SVF, który zawiera komórki macierzyste (Rysunek 1).
2. Liza RBC
   1. UWAGA: Jeśli pellet komórkowy wykazuje znaczący czerwony kolor, wskazujący na skażenie czerwonymi krwinkami, wykonaj lizę RBC.
      Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 1–3 mL buforu lizy czerwonych krwinek (RBC) za pomocą pipety P1000 z szerokimi końcówkami. Inkubuj na lodzie przez 15 minut z okazjonalnym mieszaniem.
   2. Wszystkie roztwory i wirniki do 4 °C wstępnie schładzają, aby zminimalizować aktywność metaboliczną podczas przetwarzania.
   3. Wiruj w 500 × g przez 10 minut w 4 °C. Całkowicie zasysaj supernatant.
   4. Ponownie przemyj ogniwa, ponownie zawieszając granulat w 5 mL wstępnie schładzonego roztworu D-Hanks, a następnie wiruj w 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usuń supernatant.
3. Ostateczne zawieszenie
   1. Ponownie zawiesz ostatni pellet ogniwa w D-Hanks/PBS do zastosowań dalszych.

4. Zastosowania i analizy w dalszej fazie

1. Ocena żywotności komórek SVF i wydajności komórek
   1. Przygotuj zawiesinę ogniwa SVF uzyskaną w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Trzymaj zawieszenie na lodzie do czasu użycia.
   2. Wymieszaj 10 μL zawiesiny ogniwa SVF z 10 μL roztworu Trypan Blue 0,4% w sterylnej rurce mikrowirówki o pojemności 0,5 mL. Delikatnie pipetuj w górę i w dół 3 razy, aby zapewnić równomierne mieszanie.
      UWAGA: Końcowe stężenie Trypan Blue w mieszance wynosi 0,2%. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas mieszania, ponieważ mogą one zakłócać automatyczne liczenie komórek.
      Przelej 10 μL mieszanki barwionych komórek na preparat liczący odpowiedni dla Automatycznego Licznika Komórek. Upewnij się, że próbka całkowicie wypełni komorę bez przepełnienia.
   3. Włóż slajd liczący do licznika komórek. Wybierz typ testu Trypan Blue i w razie potrzeby dostosuj zakres stężenia komórek.
   4. Naciśnij przycisk Liczenie, aby rozpocząć automatyczne liczenie komórek. Instrument rejestruje obrazy komory liczącej i automatycznie odróżnia żywe komórki od martwych.
   5. Zapisz procent żywotności komórek i policz łączną liczbę żywotnych komórek wyświetlanych na ekranie instrumentów. Wykonaj trzy niezależne pomiary dla każdej próbki i oblicz średnią żywotność oraz wydajność komórek na gram tkanki tłuszczowej.
      UWAGA: Po każdym użyciu czyść szkiełko liczące i port załadunku instrumentu 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między próbkami.
2. Obserwacja morfologii adipocytów
   1. Izolowane adipocyty barwić 5 μg/mL Hoechst dla jąder oraz 1 μM BODIPY dla lipidów w D-Hanks/PBS przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
      Punkt pauzy: Po barwieniu próbki powinny być niezwłocznie fotografowane; w razie potrzeby można je chronić przed światłem w temperaturze 4 °C przez krótki czas przed mikroskopią.
   2. Do przygotowania preparatów stosuj własnoręcznie wykonany, przyjazny adipocytom system szkiełkowy, aby uniknąć uciskania komórek.
   3. Obserwuj jądra (barwione Hoechstem) oraz krople lipidowe (barwione BODIPY) pod mikroskopem fluorescencyjnym.
      UWAGA: Ze względu na duże rozmiary (20–300 μm) i wysoką zawartość lipidów, adipocyty są delikatne, mają tendencję do unoszenia się i układają się w wiele warstw, co czyni konwencjonalne metody montażu nieodpowiednimi do wyraźnej obserwacji mikroskopowej (rysunek 3A). Aby temu zaradzić, opracowano domowy, przyjazny adipocytom system montażowy z wykorzystaniem standardowych suwaków i pokrywek (Rysunek 3B).
3. Oczyszczanie elementów naczyniowych stromalnych i obserwacje morfologiczne ADSC
   1. Świeżo wyizolowany SVF zasiać w kolbie do hodowli komórek T25 zawierającej 5 ml DMEM z dodatkiem 10% FBS i 1% penicylin-streptomycyny. Inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO₂.
   2. Po 48 godzinach delikatnie umyj kolbę 2 razy podgrzanym PBS, aby usunąć nieprzywierające komórki. Dodaj świeże podłoże hodowlane i kontynuuj inkubację.
   3. Wymieniaj podłoże co 2–3 dni. Monitoruj morfologię komórek i ich zbiegi pod mikroskopem odwróconym.
   4. Gdy komórki osiągną 80–90% konfluencji (zazwyczaj po 7–10 dniach), odłącz komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA na 3–5 minut w temperaturze 37 °C. Zneutralizuj pożywką hodowlową i pobierz zawiesinę komórkową.
   5. Wykonaj barwienie Trypanowym Blue, aby wykryć żywotność komórek przed wykryciem i sortowaniem przez FACS.
   6. Obserwuj morfologię oczyszczonych hodowanych ADSC pod mikroskopem optycznym.
   7. Przefiltruj zebraną zawiesinę komórkową przez sito o pojemności 70 μm, aby usunąć pozostałe agregaty. Ponownie zawiesij komórki w PBS zawierające 2% FBS do analizy FACS.
   8. Barwić komórki przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko CD73, CD90, CD11b i CD45 przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
   9. Przemyj komórki 2 razy buforem barwniczym i ponownie zawiesij w PBS zawierającym 2% FBS.
   10. Wykonaj analizę cytometryczną przepływu przy użyciu dyszy o średnicy 70 μm przy 20 psi i przepływie poniżej 3,0.
   11. Wyklucz odpadki komórkowe, blokując główną populację przy użyciu parametrów obszaru rozpraszania do przodu (FSC-A) i obszaru rozpraszania bocznego (SSC-A).
   12. Usuń dublety przez bramkowanie FSC-A w porównaniu z FSC-H i wybierz opłacalną populację singletów do analizy dalszej.
   13. Przeanalizuj komórki gate-cells na podstawie ekspresji markerów powierzchniowych. Użyj CD73 i CD90 jako markerów dodatnich oraz CD11b i CD45 jako markerów ujemnych, aby zweryfikować fenotyp ADSC.
   14. Obserwuj morfologię wzbogaconych i hodowanych ADSC pod mikroskopem optycznym. Charakterystyczna morfologia wrzecionowata i przypominająca fibroblasty wskazuje na pomyślne wzbogacenie ADSC.
4. Różnicowanie ADSC adipogeniczne
   1. Rozsiewaj trzecią generację ADSC o gęstości 1× 10⁴ komórek/^{cm 2}. Gdy konfluencja komórek osiągnie około 90%, inicjuj indukcję adipogeniczną.
   2. Przygotuj adipogeniczne podłoże indukcyjne z wykorzystaniem wysokoglukozowego zmodyfikowanego medium Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, które zawiera 10% surowicy płodowej bydła (FBS), 0,5 mM 3-izobutyl-1-metyloksantyny (IBMX), 1 μM deksametazonu, 10 μg/mL insuliny oraz 1 μM rozyglitazonu.
   3. Po 3 dniach od wprowadzenia podania zamień podłoże na podtrzymujące i wymieniaj roztwór co 2 dni.
   4. Po 14 dniach od indukcji zabarw komórki olejem czerwonym O i obserwuj krople lipidowe pod mikroskopem odwróconym.
5. Różnicowanie osteogeniczne ADSC
   1. Gdy konfluencja komórek osiągnie 80–90%, rozpocznij indukcję osteogenną. Sformułuj pożywkę indukcyjną osteogenową z wysokoglukozowym DMEM, zawierającą 10% FBS, 10 mM β-glicerofosforanu, 50 μg/mL kwasu askorbinowego, 10 μM kalcytryolu oraz 1 μM deksametazonu.
   2. Wymiana podłoża co 2–3 dni i kontynuacja indukcji przez około 14 dni.
   3. Barw komórki 2% Alizarin Red S (pH 5,2) i obserwuj je pod mikroskopem odwróconym.
6. Konstrukcja i identyfikacja organoidów
   1. Przygotuj zawiesinę ADSC w pojedynczej komórkach w kompletnej pożywce hodowlowej i dostosuj stężenie komórkowe do 2 × 10⁴ komórek/20 μL.
   2. Odwróć pokrywkę naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm i wylej 20 μL zawiesiny komórkowej na wewnętrzną powierzchnię pokrywki.
   3. Dodaj sterylny PBS na dno naczynia, aby utrzymać wilgotność, ostrożnie przykryj pokrywkę i inkubuj wiszące krople w standardowych warunkach hodowlanych.
   4. Codziennie obserwuj krople i pozwól komórkom gromadzić się i tworzyć sferoidy przez 6 dni.
   5. Delikatnie zbieraj sferoidy pipetą i przelać je do schłodzonego Matrigela na lodzie.
   6. Umieść sferoidy w Matrigelu i umieść mieszankę na płytkach hodowlanych przed inkubacją w standardowych warunkach hodowlanych.
   7. Regularnie wymieniaj podłoże i monitoruj wzrost organoidów do dni 18–28, kiedy struktury stają się zwarte i dojrzałe.
   8. Utrwalić organoidy 4% paradehydem, przepuścić je 0,1% Triton X-100 i blokować wiążenie niespecyficzne 5% BSA.
   9. Inkubuj próbki z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko CD73, CD90, CD11b i CD45, a następnie inkubuj je odpowiadającymi fluorescencyjnymi przeciwciałami wtórnymi.
   10. Barwimy organoidy metodami Hoechst i BODIPY, aby zobaczyć odpowiednio jądra i krople lipidów, a następnie obserwuj zabarwione próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym.
       UWAGA: Przeprowadzaj sortowanie komórek oraz wszelkie manipulacje związane z otwartymi hodowlami, w tym siew, karmienie i przygotowanie do barwienia, w ścisłych warunkach aseptycznych w szafie bioasepcyjnej.

Results

Rysunek 1: Schematyczna ilustracja procesu izolacji komórek pochodzących z tłuszczu. Diagram przedstawia tradycyjną metodę oraz obecną metodę jako ilustracyjne procesy pracy. W izolacji komórek pochodzących z tłuszczu biorą udział trzy główne etapy: pierwszy to wstępne przetwarzanie; drugą jest dysocjacja tkanki tłuszczowej w celu uwolnie...

Discussion

Niniejsze badanie wprowadza nowatorskie zintegrowane podejście do izolowania komórek pochodzących z tłuszczu (głównie adipocytów i ADSC), które rozwiązuje kluczowe ograniczenia konwencjonalnych metod. Łącząc specyficzne tkankowo enzymatyczne luzowanie z precyzyjną dysocjacją fal mechanicznych, system ten osiąga szybką (łączny czas przetwarzania ~30 min), wysoką żywotność (80–95%) i powtarzalną izolację komórek.

Konwencjonalne trawienie enzymatyczne, choć szeroko stosowane, opiera się na przedł...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw do dysocjacji tkanek typu	Docsense	TM001	Zawiera typowy środek do dysocjacji tkanek (roztwór typu A) oraz bufor dysocjacji tkanek typu (A-buffer).
Zestaw do Medium Różnicowania Adipogenicznego	OriCell	GUXMD-90031	Stosowany do różnicowania adipogennego, w tym wysokoglukozowego zmodyfikowanego medium Eagle's (niemodyfikowany) i podtrzymującego
Alizarin Red S	OriCell	A5533ALIR-10001	Barwienie mineralizacyjne dla różnicowania osteogennego (pH 5,2)
Kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich	A4544	Kwas L-askorbinowy, testowana hodowla komórkowa, do indukcji osteogennej
Bama minipigi	Chengdu Dossy Experimental Animals Co.,Ltd		Roczne, samce, zwierzęta o klasie SPF utrzymywane pod standardowymi szczepionkami, odrobaczaniem i czyszczeniem. https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html
Bio-Rad TC20 Automatyczny Licznik Komórek	Laboratoria Bio-Rad	1450011	Zautomatyzowany licznik komórek do oceny żywotności i wydajności
BODIPY	Thermo Fisher Scientific	D3922	Neutralne barwienie lipidowe
BSA (5%)	Sigma-Aldrich	A9418	Albumina surowicy bydłej, liofilizowany proszek, do blokowania
Kalcytriol	Sigma-Aldrich	C9756	1&alfa;,25-dihydroksywitamina D3, w celu indukcji osteogennej
sito komórkowe (70 μ m)	Corning	352350	Falcon 70 μ Sitko komórek M, sterylne, do przygotowania próbki FACS
sito komórkowe (200 μ m)	pluriSelect	43-50200-03	PluriStrainer, siatka PET, pasuje do probówek 50 mL, sterylnych i nbsp;
Rurka wirówka (50 mL)	Corning	352098	Falcon 50 mL o wysokiej klarowności stożkowej rurce, sterylny, polipropylen
Slajd liczący (dla Bio-Rad TC20)	Laboratoria Bio-Rad	1450011	Dwukomorowy zamek liczący dla automatycznego licznika komórek TC20
Miska kulturowa (100 mm)	Corning	430167	Sterylna misa z polistyronu, do wiszącego kształtowania organoidów kropli
Deksametazon	Sigma-Aldrich	D4902	≥ 98% dla indukcji adipogennej i osteogennej
Zrównoważony roztwór soli D-Hanks, czyli PBS	Gibco	10010015	Schłodzone do 4 stopni i stopień; C, pH 7,4.
DMEM	Gibco	11965084	Jest wykorzystywany do świeżej, izolowanej uprawy SVF
DNaza I	Beyotime	D7073	Opcjonalnie, zalecane w przypadku zaobserwowania zgrudkowania.
etanol	Sigma-Aldrich	459836	75% dla dezynfekcji powierzchni.
Serum bydła płodu (FBS)	Gibco	A4736201	System Tet zatwierdzony, pochodzenie amerykańskie, sterylny
Cytometr przepływowy	BD Biosciences	BD FACSCanto II	3 lasery (405 nm, 488 nm, 633 nm), 8 kanałów fluorescencyjnych, do analizy markerów powierzchniowych (CD73, CD90, CD11b, CD45), spełniają 70 20 psi
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus		Model odwrócony lub pionowy zdolny do obsługi zestawów filtrów FITC i DAPI.
Fluorescencyjne przeciwciała wtórne	Thermo Fisher Scientific	A-11001 (przeciw myszom), A-11008 (przeciw królikom)	Alexa Fluor sprzężony, dla immunofluorescencji
Przeciwciała sprzężone z fluorochromem (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD Biosciences	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Do analizy cytometrycznej przepływu fenotypu ADSC
Hoechst	Thermo Fisher Scientific	H3570	Barwienie jądrowe do oceny żywych/martwych komórek.
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879	≥ 99% (HPLC), dla adipogenicznego medium indukcyjnego
Lodowato zimna, sterylna sól fizjologiczna	Baxter	2F7124	Zastrzyk chlorku sodu 0,9%, USP, do płukania tkanek
Insulina	Sigma-Aldrich	I9278	Rekombinant, wyrażany w drożdżach, do indukcji adipogennej
Iodophor	Sigma-Aldrich	25104	2% roztwór dezynfekujący.
Matrigel	Corning	354230	Czynnik wzrostu zmniejszony, wolny od fenolu czerwonego, do osadzania sferoidów
Metalowa łaźnia	Servicebio	SMB-H	Używany do inkubacji w temperaturze 37 °C.
Olej czerwony O	OriCell	OILR-10001	Barwienie lipidowe w celu różnicowania adipocytów
Mikroskop optyczny	Olympus		Standardowy mikroskop jasnego pola z 10x– 40x celów.
Zestaw do Osteogenic Differentiation Medium	OriCell	GUXMD-90021	Stosowany do różnicowania osteogennego, w tym zmodyfikowanego medium Dulbecco o wysokiej glukozie i podtrzymującego
Pipeta P1000 z końcówkami o szerokiej średnicy	Beckman Coulter	B01113	Biomek P1000 Span-8 końcówki o szerokim przełęcie, sterylne
Paraformaldehyd (4%)	Thermo Fisher Scientific	J61899	Roztwór wodny do wiązania organoidów
Pasteur Pipette	Corning	7095S-5C	Sterylny, jednorazowy.
Penicylina-Streptomycyna	Gibco	15070063	10 000 U/mL penicyliny, 10 000 i mu; g/mL streptomycyny, bezpłodnej
Pentobarbital sodowy	Hikma Pharmaceuticals USA Inc.	24201-010-20	Podawana do zastrzyków, do eutanazji (100 mg/kg masy ciała, dożylnie). ANDA 203619
Przeciwciała pierwotne (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD Biosciences	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Do immunobarwienia organoidów
Bufor lizy czerwonych krwinek (RBC)	Solarbio	R1010	Jeśli jest to konieczne dla zastosowań dalszych.
Wirówka chłodzona	Eppendorf	5702R	Stosowany do kroków wirowania w temperaturze 4 i °C.
Rosiglitazon	Cayman Chemical	71740	≥ 98%, PPAR i gamma; Agonista indukcji adipogennej
Pojemnik na ostre przedmioty	Becton Dickinson	305270	Pojemnik odporny na przebicie do używanych ostrzy i nożyczek
System przygotowania zawiesiny jednokomórkowej SoniConvert	Docsense	SC-L1W	Wykorzystywane do mechanicznej dysocjacji tkanek.
Bufor barwienia (Bufor barwienia cytometrii przepływowej)	eBioscience (Thermo Fisher Scientific)	00-4222-57	200 mL, gotowe do użycia, zawiera FBS i 0,09% azydu sodu jako konserwant, przeznaczony do rozcieńczania przeciwciał i komórek, barwienia powierzchniowego oraz płukania w cytometrii przepływowej
Sterylna rurka Eppendorfa o pojemności 1,5 mL	Eppendorf	30121.517	Safe-Lock mikrowirówka, sterylna, do mielenia tkanek
Naczynie z jałowej kultury	Corning	430167	Sterylna miska hodowla 100 mm x 20 mm, do pobierania tkanek
Sterylne kleszcze	Sklar	96-1719	Sterylne kciukowe szczypce, ząbkowane, do pracy z tkankami
Gaza sterylna	Korporacja Książęca	7060033	Sterylne gazy do dezynfekcji i wycierania
Sterylne nożyczki okulistyczne	Sklar	10023-580	nożyczki szyścienne w stylu Vannas, do drobnego mielenia tkanki na 1-2 mm³ Figurki
Sterylna maszynka	3M	9681	Maszynka do chirurgicznego przygotowania, do usuwania owłosienia z obszaru operacyjnego
Skalpel sterylny	Integra Miltex	4-415	Sterylny jednorazowy skalpel do wykonywania nacięcia
Sterylne nożyczki chirurgiczne	Sklar	10022-580	Merit Sterile Iris Scissors, do rozcinania naczyń krwionośnych i tkanki łącznej;
Kolba do hodowli komórek T25	Corning	430639	Kolba do hodowli komórek Falcon T25, z nakrętką wentylacyjną, sterylną
Triton X-100 (0,1%)	Sigma-Aldrich	T8787	Jakość laboratoryjna, do permeabilizacji
Trypan Blue	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15250061	Roztwór 0,4% do liczenia żywotności komórek.
Trypsyna-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	0,25% trypsyny, 1 mM EDTA, do odłączania ADSC
β-glicerofosforan	Sigma-Aldrich	G9422	Piotohydrat soli sodowej do indukcji osteogennej