Artykuł przeglądowy
Przedstawiamy tutaj protokół oceny synergicznej aktywności fosfomycyny w połączeniu z ceftriaksonem, meropenemem i gentamycyną przeciwko odolnym na karbapenemy izolatom Escherichia coli z wykorzystaniem metody rozcieńczania agarowego. Synergie obserwowano z meropenemem i gentamycyną, ale nie z ceftriaksonem.
Ze względu na ograniczone opcje leczenia dotyczące oporności na karbapenemowe Enterobacterales, reżimy terapii skojarzonej zyskują na znaczeniu. Niniejsze badanie miało na celu zbadanie wskaźników oporności na fosfomycin i ocenę synergistycznych interakcji in vitro fosfomyciny w połączeniu z meropenemem, gentamycyną i ceftriaksonem przeciwko opornym na karbapenemowe Escherichia coli szczepom. W badaniu uwzględniono sześćdziesiąt opornych na karbapenemowe E. coli szczepów izolowanych z różnych próbek klinicznych (mocz, krew, aspirat, rana, płyn mózgowo-rdzeniowy, aspirat endotrachealny) uzyskanych od pacjentów z oddziałów klinicznych i intensywnej terapii szpitali Wydziału Medycznego Uniwersytetu Dicle. Identyfikacja gatunku została przeprowadzona za pomocą zautomatyzowanego systemu identyfikacji mikroorganizmów. Testy wrażliwości na antybiotyki i potwierdzenie oporności na karbapenemowe wykonano za pomocą dysk-dyfuzyjnego testu z użyciem ertapenemu, imipenemu i meropenemu. Oporność na fosfomycin i interakcje między antybiotykami oceniano za pomocą metody agar-dylucji. Ponadto, kombinacje antybiotyków oceniono w seryjnych dwukrotnych gradientach stężeń z użyciem protokołu opartego na dylucji agarowej, a indeksy frakcyjnego hamowania stężenia (FICI) obliczono w celu określenia synergii, obojętności lub antagonizmu. Wskaźniki oporności wyniosły 76,6% dla fosfomyciny, 61,6% dla meropenemu, 85,0% dla gentamycyny i 98,3% dla ceftriaksonu. Synergiczne interakcje obserwowano w 35% szczepów dla kombinacji fosfomycina-meropenem, 33,4% dla kombinacji fosfomycina-gentamycyna i 1,7% dla kombinacji fosfomycina-ceftriakson. Antagonizm wykryto tylko w jednym szczepie w kombinacji fosfomycina-meropenem. Kombinacje fosfomyciny z meropenemem i gentamycyną wykazały synergistyczną aktywność in vitro przeciwko opornym na karbapenemowe E. coli. Potrzebne są dalsze badania in vitro, aby potwierdzić te ustalenia.
Rodzina Enterobacterales obejmuje bardzo zróżnicowaną grupę Gram-ujemnych pałeczek, z których wiele ma znaczenie kliniczne1. Wśród nich Escherichia coli jest gatunkiem najczęściej izolowanym w laboratoriach mikrobiologii klinicznej i jest szeroko kojarzony z infekcjami zawierającymi prawie wszystkie układy narządów, w tym infekcjami dróg moczowych, infekcjami ran, zapaleniem płuc u pacjentów z osłabioną odpornością, zapaleniem jelit i zapaleniem opon mózgowych u noworodków. Jest również główną przyczyną Gram-ujemnej sepsy i septycznego wstrząsu związanego z endotoksyną. Poza medycyną ludzką E. coli jest również ważnym patogenem weterynaryjnym, powodującym infekcje układowe i oddechowe u różnych gatunków zwierząt, w tym u koni, co rozszerza perspektywę zakresu żywicieli patogenezy E. coli zarówno na ludzi, jak i na zwierzęta2,3,4.
Wytwarzające beta-laktamazę o rozszerzonym spektrum (ESBL) Enterobacterales, w szczególności E. coli i Klebsiella pneumoniae, były związane ze zwiększoną śmiertelnością, przedłużonym pobytem szpitalnym i wyższymi kosztami opieki zdrowotnej1. Powszechne stosowanie antybiotyków jest głównym czynnikiem wywołującym wielolekooporność (MDR) wśród tych organizmów1. Mechanizmy oporu obejmują produkcję karbapenemaz, ESBL, enzymy modyfikujące aminoglikozydy (AME), mutacje sprzyjające oporowi na chinolony oraz zmiany w układach porynowych i efektorowych. U E. coli i Klebsiella pneumoniae oporność jest głównie przenoszona przez plazmidy, ułatwiając przenoszenie poziome genów. Takie cechy odporności są również coraz częściej zgłaszane u E. coli pochodzenia zwierzęcego, w tym u izolatów z bydła, co wspiera koncepcję One Health i wskazuje na potencjalne ryzyko transmisji zoonotycznej2,3.
Karbapenemy są uważane za ostatnie leki w leczeniu ciężkich infekcji wielolekoopornych. Jednak Enterobacterales opornych na karbapenemy (CRE) stały się głównym globalnym problemem zdrowia4. Ta oporność jest głównie spowodowana przez karbapenemaz, w tym metalo-beta-laktamazy klasy B, co przyczynia się do fenotypów rozlegle opornych i uniwersalnie opornych5.
Wielolekoodporne szczepy E. coli znacznie ograniczają opcje terapeutyczne i komplikują leczenie infekcji. Podkreśla to potrzebę alternatywnych strategii leczenia, takich jak terapie skojarzone, aby poprawić wyniki kliniczne. Co więcej, te oporne szczepy są coraz częściej zgłaszane nie tylko w środowiskach klinicznych, ale także ze źródeł żywności, takich jak produkty mleczne. Rozszerza to epidemiologiczne konteksty rozprzestrzeniania się oporności na antybiotyki i wspiera terapię skojarzoną jako potencjalną strategię łagodzenia jej rozprzestrzeniania się i wpływu klinicznego6,7. Aminoglikozydy, tigecyklina i polimyksyny są często stosowane jako leki w infekcjach wielolekoopornych8. Fosfomycin także wykazał działanie przeciwko wytwarzającym ESBL E. coli, szczególnie w infekcjach dróg moczowych9.
Fosfomycin, odkryty po raz pierwszy w 1969 roku, hamuje wczesną syntezę ściany komórkowej bakterii i ponownie pojawił się jako obiecujący lek w terapii skojarzonej10. Efekty synergistyczne między fosfomycinem a aminoglikozydami lub β-laktamiami były zgłaszane w organizmach wielolekoodpornych11,12. Ponadto fosfomycin został oceniony w dużych kohortach klinicznych, wykazując skuteczność w ciężkich infekcjach, gdy jest stosowany samodzielnie lub w reżymach skojarzonych13. Jednak większość wcześniejszych badań obejmuje heterogeniczne populacje bakterii, a dane dotyczące specyficznie oporności E. coli na karbapenemy pozostają ograniczone.
Standardowe metody badania wrażliwości na antybiotyki obejmują rozcieńczanie na agarze, rozcieńczanie w pożywce i rozsiew na dyskach. Testowanie kombinacji na bazie rozcieńczenia agarowego umożliwia ilościową ocenę interakcji przeciwdrobnoustrojowych poprzez określenie WZM i obliczenie FICI. Alternatywne metody, takie jak zabijanie w czasie i gradientowa dyfuzja, dostarczają dynamicznych lub uproszczonych danych dotyczących interakcji, ale mogą różnić się pod względem odtwarzalności i standaryzacji13,14. Ten protokół jest najbardziej odpowiedni do kontrolowanej oceny in vitro zdefiniowanych kombinacji antybiotyków. Jednak nie odzwierciedla w pełni warunków farmakokinetycznych in vivo15. Wśród nich rozcieńczanie na agarze jest uważane za metodę referencyjną do wyznaczania WZM; jednak jego zastosowanie w ocenie aktywności kombinacji fosfomycinu przeciwko opornym na karbapenemy E. coli jest ograniczone.
Niniejsze badanie dostarcza systematycznej oceny kombinacji opartych na fosfomycinie przeciw
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zgoda na to badanie została uzyskana od Komitetu Etyki Badań Klinicznych Nieinterwencyjnych Wydziału Medycznego Uniwersytetu Dicle (Decyzja nr: 100, Data: 01.01.2021).
Protokół opisany poniżej przedstawia standaryzowaną metodę agar dilution checkerboard do oceny synergii działania fosomyciny w połączeniu z szczepami E. coli odpornymi na karbapenemy.
Zbieranie szczepów
W okresie od 15.02.2021 do 15.12.2021 włączono łącznie 60 szczepów E. coli odpornych na karbapenemy, izolowanych z różnych próbek klinicznych (mocz, krew, aspirat, rana, płyn mózgowo-rdzeniowy i aspirat z oskrzeli) uzyskanych od pacjentów hospitalizowanych w szpitalach Wydziału Medycznego Uniwersytetu Dicle. Identyfikację przeprowadzono za pomocą systemu spektrometrii mas MALDI-TOF. Gdy z tego samego pacjenta uzyskano wiele szczepów, uwzględniono tylko pierwszy. Wykluczono próbki pobrane w ambulatoriach i pacjentów hospitalizowanych krócej niż 48 godzin. Wszystkie szczepy E. coli odporne na karbapenemy, które spełniały wcześniej zdefiniowane kryteria włączenia w badaniu, były kolejno włączane; dlatego wielkość próby określono na podstawie liczby kwalifikujących się szczepów i nie przeprowadzono a priori obliczeń wielkości próby. E. coli ATCC 13846 i E. coli ATCC 25922 zostały użyte jako szczepy kontroli jakości. Szczepy kontroli jakości były testowane równolegle z izolatami klinicznymi w identycznych warunkach agar dilution. Wszystkie wykonania oceniło dwóch niezależnych obserwatorów. Wyniki szczepów kontroli jakości wykazały oczekiwane wzorce hamowania wzrostu we wszystkich eksperymentach i nie zaobserwowano wyników poza zakresem ani nieważnych.
Wszystkie procedury z użyciem szczepów klinicznych wykonano w warunkach bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 (BSL-2). Stosowano odpowiednie wyposażenie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawiczki i osłona oczu) i wszystkie manipulacje przeprowadzano w certyfikowanym szafie bezpieczeństwa biologicznego.
Identyfikacja gatunku i testy na wrażliwość na antybiotyki
Oporność na karbapenemy i testy na wrażliwość na antybiotyki przeprowadzono za pomocą zautomatyzowanego systemu identyfikacji mikroorganizmów i testów na wrażliwość. Oporność na karbapenemy wykryta przez system potwierdzono za pomocą testu rozsiewu dyskowego z użyciem dysków z ertapenem, imipenem i meropenem. Średnice stref stłuczenia interpretowano zgodnie z przedziałami krytycznymi EUCAST16,17(Tabela 1). Wszystkie szczepy zachowano w bulionie tryptykowym z soją zawierającym 20% glicerolu i przechowywano w temperaturze -20 °C.
Tabela 1: Przedziały krytyczne stref stłuczenia dla karbapenemów określone dla E. coli za pomocą testu rozsiewu dyskowego (DDT). Kryteria interpretacyjne testu rozsiewu dyskowego stosowane w testach na wrażliwość na karbapenemy. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Butelki do hodowania krwi przeznaczone do próbek pediatrycznych i tlenowych inkubowano w zautomatyzowanym systemie do hodowania krwi. Butelki pozytywne były przesiewane na agar EMB, 5% agar z krwią owiec i agar Sabouraud Dextrose.
Próbki moczu i aspiratu oskrzelowego badano metodami ilościowymi, podczas gdy pozostałe próbki przetwarzano metodami półilościowymi. Próbki aspiratu oskrzelowego oceniono za pomocą barwienia Grama i tylko próbki o wynikach Bartletta > 0 i Murraya > 3 uznano za istotne i zostały włączone18.
W przypadku próbek ran oceniono barwienie Grama zgodnie z systemem punktacji Q; próbki o wynikach Q > 0 zostały włączone19.
Izolaty bakteryjne identyfikowano za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Wynik ≥2,0 uważano za wiarygodny dla identyfikacji na poziomie rodzaju i gatunku, podczas gdy wyniki między 1,7 a 2,0 wskazywały na wiarygodną identyfikację na poziomie rodzaju20,21. Dołączono tylko izolaty o wynikach ≥2,0.
Oznaczanie wrażliwości na fosomycinę metodą agar dilution
Zgodnie z Europejskim Komitetem do spraw Badania Wrażliwości na Leki Przeciwbakteryjne (EUCAST), metoda agar dilution jest zalecana do oznaczania wrażliwości na fosomycinę wśród członków rodziny Enterobacterales16.
Przygotowanie fosfomyciny i innych roztworów roboczych antybiotyków
Do metody agar dilution stosowano fosfomycinę w proszku w postaci soli disodium hydratu i sterylną wodę destylowaną do przygotowania roztworu. Zaplanowano osiem różnych rozcieńczeń dla każdego antybiotyku, począwszy od czterokrotnego rozcieńczenia poniżej i trzykrotnego rozcieńczenia powyżej wartości granicznej MIC określonej przez EUCAST.
Przygotowano roztw
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W badaniu uwzględniono łącznie 60 szczepów E. coli opornych na karbapenemy. Wszystkie szczepy uzyskano od pacjentów hospitalizowanych na oddziałach intensywnej terapii lub klinicznych wydziałach szpitali Wydziału Medycznego Uniwersytetu Dicle. Dorośli stanowili 83,3% przypadków, podczas gdy pediatryczni pacjenci stanowili 16,7% (Tabela 8 i Tabela 9). Wielolekoodporność obserwowano u 80% (n = 48) szczepów.
Tabela 8: Rozkład szczepów E. coli wed...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują, że nie mają żadnego konfliktu interesów.
To badanie było wspierane przez Koordynacyjną Jednostkę Projektów Badawczych Uniwersytetu Dicle (DÜBAP) z numerem projektu SBE.21.004.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie