Ten protokół ocenia drenaż limfatyczny po złamaniu poprzez łączenie obrazowania w bliskiej podczerwieni z użyciem zielonej indokyaninowej (ICG) z ultrasonografią w celu ilościowego określenia usuwania ICG podeszwowego i powiększenia węzłów chłonnych okołokolanowych u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena drenażu limfatycznego z wykorzystaniem obrazowania ICG w bliskiej podczerwieni i ultradźwięków po złamaniu
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Urazowe złamania często towarzyszy upośledzona funkcja drenażu limfatycznego. Zmniejszony drenaż limfatyczny i powiększenie węzłów chłonnych po złamaniu wskazują na trwające, dynamiczne procesy ostrej reakcji zapalnej i rekrutacji komórek immunologicznych. W tym artykule opisano metodę, w której 6 µL 0,2 mg/mL indocyaninowej zieleni wstrzykiwano śródskórnie w okolicę podeszwową myszy poddawanych operacji udanej lub złamaniu kości piszczelowej. Za pomocą bliskiego podczerwieni fluorescencyjnego obrazu zmierzono sygnał ICG w podeszwie w godzinach 0 i 24, aby obliczyć wskaźnik klirensu w ciągu 24 godzin jako odczyt drenażu limfatycznego u myszy. Równocześnie wykorzystano ultradźwięki do 3D-rekonstrukcji węzłów chłonnych podkolanowych (PLNs), porównania ich objętości i oceny powiększenia wywołanego złamaniem. Wyniki wykazały, że po złamaniu wskaźnik klirensu limfatycznego znacząco spadł, intensywność fluorescencji ICG w okolicy podeszwy była znacząco wyższa, a objętość PLNs była znacząco powiększona. W porównaniu z poprzednimi metodami pomiaru układu limfatycznego, takimi jak przekroje histopatologiczne lub limfoscyntygrafia, które często nie pozwalają na in vivo, dynamiczne i ciągłe obserwacje, ta metoda wykazuje wysoką stabilność i powtarzalność. Należy zauważyć, że umożliwia dynamiczne in vivo monitorowanie funkcji drenażu limfatycznego, zapewniając solidne wsparcie techniczne do badania zmian w refluksie limfatycznym w modelach złamań.
Wprowadzenie
Złamania traumatyczne często powodują znaczne uszkodzenie tkanek i obrzęk, zwiększając ryzyko powikłań, takich jak zakażenie, martwicę i niegojenie się kości1,2. Grzegorz Szczesny i in. wykazali, że dysfunkcja drenażu limfatycznego, prowadząca do obrzęku tkanek, jest związana z opóźnionym gojeniem3. Badania wskazują, że podczas procesu gojenia złamań, oprócz naprawy tkanki kostnej, układ limfatyczny w miejscu złamenia odgrywa również ważną rolę. Naczynia limfatyczne są odpowiedzialne nie tylko za odprowadzanie płynu międzykomórkowego i zapobieganie obrzękowi4, ale także za regulację migracji komórek immunologicznych i usuwanie odpadów metabolicznych. Jednak we wczesnych stadiach złamań, czynniki prozapalne takie jak TNF-α, IL-1, IL-6 i Makrofagowy Czynnik Stymulujący Kolonie (MCSF) mogą uszkadzać komórki śródbłonka limfatycznego5, prowadząc do zmian patologicznych takich jak zwyrodnienie, obrzęk i zwłóknienie6. Odpowiednie badania wykazały obecność komórek śródbłonka limfatycznego w kości i okostnej, jak również w otaczających tkankach tłuszczowych i mięśniowych. Ponadto drenaż limfatyczny uczestniczy również w regulacji mikrośrodowiska krwiaka po złamaniu; skuteczny drenaż limfatyczny ułatwia przeżycie osteoblastów i proliferację komórek macierzystych tkanki łącznej szpiku kostnego (BMSC)7. Podczas złamań, czynniki prozapalne (TNF-α, IL-1 i IL-6) oraz czynniki wzrostu (TGFβ1 i PDGF) wytwarzane przez komórki odpornościowe w uszkodzonym miejscu są ważnymi czynnikami regulacyjnymi apoptozy osteoblastów i proliferacji BMSC8. Hüseyin Arslan i inni naukowcy potwierdzili negatywny wpływ obrzęku limfatycznego na osteoblasty. Te wyniki badań podkreślają ważną rolę drenażu limfatycznego w gojeniu złamań. Ostatnie osiągnięcia w zakresie obrazowania fluorescencyjnego ICG w podczerwieni (NIR) umożliwiły nieinwazyjne, czasowe obserwowanie dynamiki przepływu limfy zarówno w modelach zwierzęcych, jak i u ludzi9,10,11. Technika ta pozwala na ilościową ocenę kurczliwości naczyń limfatycznych, prędkości drenażu i integralności ścieżek10,11. Badanie przeprowadzone na mysich modelach zapalenia stawów i zapalenia wykazało, że obrazowanie ICG-NIR może rozróżniać ostre i przewlekłe reakcje limfatyczne, podkreślając odrębne wzorce drenażu podczas uszkodzenia tkanek i regeneracji. Ponadto obrazowanie limfatyczne NIR okazało się skuteczne w monitorowaniu funkcjonalnego powrotu po manualnym drenażu limfatycznym i ocenie skuteczności terapii ukierunkowanych na układ limfatyczny. Ultrasonografia zapewnia uzupełniającą ilościową modalność oceny morfologii i objętości węzłów limfatycznych, jak również obrzęku tkankowego związanego z upośledzonym drenażem limfatycznym. Integracja obrazowania fluorescencyjnego NIR z ultrasonografią umożliwia jednoczesną ocenę funkcji limfatycznych i zmian anatomicznych, zapewniając multimodalne podejście do badania dynamiki limfatycznej in vivo. Pomimo rosnącej świadomości krytycznej roli dysfunkcji limfatycznej w gojeniu pourazowym, nadal brakuje znormalizowanych i powtarzalnych metod oceny drenażu limfatycznego po złamaniach. Wiele obecnych metod obrazowania jest inwazyjnych, cierpi na niedostateczną rozdzielczość przestrzenną lub nie umożliwia dynamicznego monitorowania przepływu limfy. Dlatego opracowanie protokołu łączącego obrazowanie ICG-NIR i ultrasonograficzne jest przewidywane jako rozwiązanie tego metodologicznego niedostatku i zapewnienie efektywnego narzędzia do oceny regeneracji limfatycznej i jej wkładu w naprawę kości.
Niniejsze badanie przedstawia innowacyjną ramę łączącą obrazowanie fluorescencyjne ICG-NIR z ultrasonografią wysokiej rozdzielczości w celu oceny drenażu limfatycznego po złamaniach kości strzałkowej u myszy. Takie podejście umożliwia półilościową analizę wydajności drenażu i mierzy objętość węzłów limfatycznych podczas procesu gojenia złamań. Ma również pewne ograniczenia. Po pierwsze, ICG-NIR jest głównie stosowany do oceny powierzchownych naczyń limfatycznych, a jego zdolność obrazowania głębszych struktur jest ograniczona. Po drugie, chociaż zmiany w objętości węzłów limfatycznych dostarczają pewnych informacji, brakuje im specyficzności i nie mogą w pełni zastąpić bezpośrednich pomiarów funkcjonalnych. Ta metodologia ma znaczący potencjał translacyjny i poprawia nasze rozumienie funkcji limfatycznych w regeneracji kości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania w Centrum Modeli Organizmów w Szanghaju (Numer zgody NMB-SMP-IACUC-01-0002-R02-03). W badaniu tym użyto myszy samców C57BL/6 z modelem złamań (w wieku 6–8 tygodni). Stosowany sprzęt i reagenty są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Opieka przedoperacyjna
- Aklimatyzuj myszy przez co najmniej 1 tydzień z ad libitum dostępem do jedzenia i wody. Losowo przypisz zwierzęta do grupy z złamaniem lub do grupy kontrolnej za pomocą listy losowych przypisań wygenerowanej przez komputer.
- Umieść myszy na podgrzewanej poduszce dla zwierząt i utrzymuj stałą temperaturę 37 °C.
- Włącz aparat do znieczulenia gazowego i umieść mysz w komorze indukcyjnej na 5 min przy 2%–3% izofluranu.
- Po indukcji, przełącz na 1%–2% izofluranu i utrzymuj znieczulenie via czujnik nosowy aż do końca zabiegu. Potwierdź, że mysz straciła refleksy i że mięśnie są w pełni zrelaksowane. Zweryfikuj brak reakcji na ucisk palców i odruchy rogówkowe, i upewnij się, że oddech brzuszny jest stabilny. Nalotuj maść z erytromycyną do obu oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki podczas znieczulenia.
2. Procedura eksperymentalna
UWAGA: Standardyzuj ustawienia znieczulenia, dawkę i objętość ICG, miejsce i głębokość wstrzyknięcia, czas ekspozycji, definicję ROI oraz parametry skanowania ultradźwiękowego na wszystkich sesjach, aby zminimalizować zmienność między zwierzętami.
- NIR-ICG imaging
UWAGA: Krok po kroku procedura dotycząca ICG obrazowania w podczerwieni jest pokazana na Rysunku 1.- Waż 0,2 mg indocyanine green (ICG), przenieś do mikroprobówki o pojemności 1,5 mL i rozpuść w 1 mL PBS, aby przygotować 0,2 mg/mL roztwór ICG. Owinąć probówkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
- Włącz system obrazowania i otwórz FluoBeam v1.46. Wyreguluj wysokość kamery zgodnie z potrzebami.
- Zwilż wacik alkoholem 75% i zdezynfekuj powierzchnię podeszwy modelowanej tylnej łapy.
- Za pomocą 10 μL mikrostrzykawki pobierz 6 μL roztworu ICG. Wsuń igłę około 1 mm w powierzchnię podeszwy i wstrzyknij roztwór z stałą prędkością, aż zostanie dostarczona pełna objętość.
- W oprogramowaniu, aktywuj zarówno funkcję “kamera”, jak i “laser”. Kliknij “modyfikuj” aby utworzyć nowy folder i ustawić go jako katalog zapisu. Zachowaj identyczny czas ekspozycji podczas akwizycji obrazu o 0 h i 24 h.
- Umieść mysz pod kamerą w pozycji brzusznej z modelowaną tylną łapą centralnie w polu widzenia. Upewnij się, że modelowana tylna łapa jest centralnie w polu widzenia.
- Ustaw czas ekspozycji na 30 ms i zachowaj go identyczny dla obrazów o 0 h i 24 h. Zdobądź obrazy tej samej ROI po wstrzyknięciu do podeszwy w 0 h i 24 h po wstrzyknięciu, aby zmierzyć intensywność sygnału ICG. Zachowaj identyczny czas ekspozycji o 0 h i 24 h.
- Kiedy naczynia limfatyczne tylnej łapy są wyraźnie widoczne w polu widzenia, kliknij “zdjęcie” aby uchwycić obrazy.
- Po akwizycji obrazu, eksportuj dane i użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby sprecyzować intensywność fluorescencji o 0 h i 24 h, a następnie oblicz wskaźnik usuwania fluorescencji.
- Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu.
- Zaimportuj obrazy fluorescencji klikając Plik → Otwórz, i otwórz 0 h obraz podeszwy odpowiadający temu samemu zwierzęciu i temu samemu dniowi badania (następnie otwórz dopasowany 24 h obraz później).
- Wybierz Owal, a następnie kliknij Edycja → Wybór → Określ; ustaw Szerokość = 30 i Wysokość = 30, wybierz Owal, i kliknij OK.
- Umieść okrąg na obszarze tła.
- Kliknij Analizuj → Zmieraj, i zapisz wartość Średnia w oknie Wyniki jako intensywność fluorescencji na tle o 0 h (FI0hbg).
- Umieść okrąg na docelowym obszarze obserwacji, kliknij Analizuj → Zmieraj, i zapisz wartość Średnia w oknie Wyniki jako FI0h.
- Oblicz skorygowaną intensywność fluorescencji o 0 h jako Skorygowana FI0h = FI0h - FI0hbg.
- Otwórz dopasowany 24 h obraz i powtórz kroki 3–7
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W dniach 1., 7. i 14. po utworzeniu modelu złamania intensywność fluorescencji ICG w stopie po 24 h (FI24h) w grupie ze złamaniem była konsekwentnie wyższa niż w grupie po operacji pozornej (Rysunek 3). Względna analiza ilościowa intensywności fluorescencji ICG z zebranych obrazów stóp wykazała, że szybkość klirensu limfatycznego ICG w grupie ze złamaniem była znacząco niższa niż w grupie po operacji pozornej (p < 0,05) (Rysunek 4). Jednoc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół obejmuje kilka łatwo przeoczonych szczegółów. Na przykład czas ekspozycji nie jest ustalony i musi być określony na podstawie konkretnej intensywności fluorescencji. Jednak czas ekspozycji dla tej samej grupy myszy o 0 h i 24 h musi pozostać spójny; w przeciwnym razie wyniki mogą być niewiarygodne. Podczas obserwacji za pomocą ultradźwięków istotne jest, aby w pełni pokryć dolne kończyny myszy środkiem sprzęgającym, ponieważ wszelkie odsłonięte obszary powodują zniekształcenie powstałych obrazów, gdy sonda skanu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konfliktów interesów do zadeklarowania.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez Narodową Fundację Nauki Przyrodniczej (82174407 dla YJZ), Program Szkolenia Liderów Dyscypliny Komisji Zdrowia Nowej Dzielnicy Pudong w Szanghaju (PWRd2020-05), Projekt Liderów Dyscypliny Komitetu Zdrowia Nowej Dzielnicy Pudong (PWRq2020-56) oraz Projekt Medyczny Sanming w Shenzhen (nr. SZZYSM202311006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10 Microliter Microsyringe | Hamilton Company | 80330/00 | The Hamilton 80330/00 microsyringe is a precision instrument with a 10 L capacity, featuring a 26s gauge needle, 51mm length, and point style 2. It is designed for accurate delivery of small volumes in chromatography, sample injection, and analytical chemistry applications. |
| 3D Ultrasound Vevo 3100 Imaging System | Vevo 2100 | The Vevo 2100 is a high-frequency ultrasound imaging system for preclinical research, providing real-time 3D visualization of small animals. It offers superior resolution for cardiovascular, oncology, and developmental biology studies, integrated with Vevo LAB software for data analysis. | |
| 75% Ethanol | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | G73537O | 75% ethanol is a disinfectant solution widely used in laboratories for surface sterilization, equipment cleaning, and antisepsis. It effectively kills bacteria, viruses, and fungi through protein denaturation and is commonly applied in biological and clinical settings. |
| Cotton Swab | Hebei Kangji Medical Equipment Co., Ltd. | 20250303 | Cotton swabs are sterile, absorbent applicators used for precise sample collection, application of solutions, or cleaning in medical, diagnostic, and laboratory procedures. They feature wooden or plastic sticks with cotton tips for hygienic handling. |
| Coupling Agent | Tianjin Jinya Technology Development Co., Ltd. | 20241029 | Coupling agent, commonly known as ultrasound gel, is a water-based medium used to enhance acoustic transmission between the ultrasound transducer and skin. It eliminates air pockets for clear imaging, is non-irritating, and supplied in a 250mL container for medical and diagnostic use. |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | Prism 10 | A scientific graphing and statistical analysis software used for data analysis, visualization, and presentation. |
| Image J | National Institutes of Health | ImageJ 1.54d | A public-domain, Java-based image processing and analysis program widely used for biological and medical image analysis. |
| indocyanine green | Dandong Yichuang Pharmaceutical Co., Ltd. | 8305128 | Indocyanine green is a water-soluble anionic dye used in medical diagnostics for determining cardiac output, hepatic function, liver blood flow, and ophthalmic angiography. It is supplied in 25mg vials for intravenous administration and exhibits fluorescence in the near-infrared spectrum for imaging purposes. |
| isoflurance | RWD | R650-IE | Isoflurane is an inhaled general anesthetic. It has a small blood/gas partition coefficient. When used for animal anesthesia, it can induce anesthesia smoothly, rapidly and comfortably, with a quick recovery, good muscle relaxation, and no excitatory effect on the sympathetic nervous system. The metabolic rate of isoflurane in the liver is low, so it has little toxicity to the liver, and there are no obvious side effects even with repeated use. To avoid the adverse effects of anesthetic waste gas on the environment and laboratory personnel, it is recommended to use it together with a gas recovery system. |
| Microbalance | Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd. | FA1004B | The FA1004B microbalance is a high-precision analytical instrument designed for accurate weighing of small samples, offering readability up to 0.0001g and suitable for laboratory applications requiring precise measurements in research and quality control. |
| Near-Infrared Imaging System | Olympus | MVX10 | The Olympus MVX10 is a macro zoom fluorescence microscope system optimized for near-infrared imaging. It offers high-resolution visualization of large specimens with a wide zoom range, advanced optics for deep tissue penetration, and compatibility with fluorescence techniques in biological and materials research. |
| Vevo lab | \ | Vevo LAB | An imaging analysis software package used for analyzing Vevo imaging data, including measurement, calculation, and report generation. |
Bibliografia
- Zhang, S., Sheng, H., Xu, B., Lao, Y. Acute external iliac artery thrombosis following pelvic fractures: Two case reports. Medicine (Baltimore). 100 (6), e24710(2021).
- Szczesny, G., Olszewski, W. L., Gewartowska, M., Zaleska, M., Gorecki, A. The healing of tibial fracture and response of the local lymphatic system. J Trauma. 63 (4), 849-854 (2007).
- Zheng, Y., et al. A novel therapy for fracture healing by increasing lymphatic drainage. J Orthop Translat. 45, 66-74 (2024).
- Thomas, C., Le, J. T., Benson, E. Managing lymphedema in fracture care: Current concepts and treatment principles. J Am Acad Orthop Surg. 28 (18), 737-741 (2020).
- Jiang, X., Nicolls, M. R., Tian, W., Rockson, S. G. Lymphatic dysfunction, leukotrienes, and lymphedema. Annu Rev Physiol. 80, 49-70 (2018).
- Biswas, L., et al. Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury. Cell. 186 (2), 382-397.e24 (2023).
- Dimitriou, R., Tsiridis, E., Giannoudis, P. V. Current concepts of molecular aspects of bone healing. Injury. 36 (12), 1392-1404 (2005).
- Arslan, H., et al. Effect of lymphedema on the recovery of fractures. J Orthop Sci. 12 (6), 578-584 (2007).
- Cheon, H., Kim, S. A., Kim, B., Jeon, J. Y. Investigation of optimizing indocyanine green solution for in vivo lymphatic research using near-infrared fluorescence indocyanine green lymphangiography. Sci Rep. 13 (1), 14966(2023).
- Polomska, A. K., et al. Minimally invasive method for the point-of-care quantification of lymphatic vessel function. JCI Insight. 4 (4), e126515(2019).
- Wang, F., Weng, Y., Geng, J., Zhu, J. A narrative review of indocyanine green near-infrared fluorescence imaging technique: A new application in thoracic surgery. Curr Challenges Thorac Surg. 3, 35-35 (2021).
- Zheng, Y., et al. Lymphatic platelet thrombosis limits bone repair by precluding lymphatic transporting damps. Nat Commun. 16 (1), 829(2025).
- Kim, K. M., Kim, K. Y. Lymphangiogenesis after nonvascularized lymph node transplantation: Lymphangiographic findings in mice and minipigs. PLoS One. 18 (12), e0295836(2023).
- Zhang, P. H., et al. Efficient pulmonary lymphatic drainage is necessary for inflammation resolution in ARDS. JCI Insight. 9 (1), e173440(2024).
- Kenney, H. M., et al. Persistent popliteal lymphatic muscle cell coverage defects despite amelioration of arthritis and recovery of popliteal lymphatic vessel function in TNF-TG mice following anti-TNF therapy. Sci Rep. 12 (1), 12751(2022).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
