Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Badanie wykazało, że Formuła Shengdu Pingmu łagodzi zaparcia u szczurów poprzez zwiększenie zawartości wody w kałach i napędu jelitowego. Efekty te wiążą się z aktywacją szlaku PI3K/AKT, zwiększaniem wykształcenia AQP3 i AQP8 oraz modulacją składu mikrobioty jelitowej.
Zaparcia to powszechne zaburzenie przewodu pokarmowego, a obecne metody leczenia często mają ograniczenia. Formuła Shengdu Pingmu (SDPF), zmodyfikowana formuła wywodząca się z tradycyjnej medycyny chińskiej, była stosowana klinicznie w leczeniu zaparć, jednak jej mechanizm działania pozostaje niejasny. Badanie to wykorzystało analizę UPLC-Q/TOF-MS do identyfikacji 188 związków w SDPF, z czego 50 zostało jednoznacznie potwierdzonych. W eksperymentach na zwierzętach leczenie SDPF znacząco poprawiło napęd jelit, zwiększyło zawartość wody w kałach i skróciło czas do pierwszego czarnego stolca. Farmakologia sieci i analizy dokowania molekularnego sugerowały udział szlaku PI3K/AKT, co zostało następnie potwierdzone przez obserwowane zwiększenie jego wykształcenia oraz zwiększoną ekspresję AQP3 i AQP8 w odbytnicy. Ponadto sekwencjonowanie genu 16S rRNA wykazało, że SDPF przywraca homeostazę mikrobioty jelitowej poprzez podnoszenie poziomu pożytecznych bakterii, takich jak Lactobacillus i Bacteroides , jednocześnie zmniejszając liczbę bakterii związanych z stanem zapalnym. Łącznie SDPF skutecznie łagodzi zaparcia poprzez mechanizmy regulujące szlak PI3K/AKT i modulujące mikrobiotę jelitową.
Zaparcia to rozpowszechniona choroba przewodu pokarmowego, charakteryzująca się rzadkimi wypróżnieniami, napięciem i twardym stolcem, dotykająca około 20% światowej populacji, z istotnymi konsekwencjami społeczno-ekonomicznymi1. Przewlekłe zaparcia nie tylko powodują fizyczne komplikacje, takie jak hemoroidy, szczeliny odbytu czy zaklęcie kału, ale także przyczyniają się do cierpienia psychicznego, w tym lęku i depresji, co poważnie obniża jakość życia pacjentów2. Terapie konwencjonalne, w tym środki przeczyszczające osmotyczne i suplementacja błonnika pokarmowego, często dają nieoptymalne wyniki ze względu na ograniczoną skuteczność, potencjalne skutki uboczne oraz ryzyko uzależnienia3. Tradycyjna medycyna chińska (TCM) oferuje holistyczne podejście, wykorzystujące preparaty ziołowe i akupunkturę do regulacji ruchliwości jelit poprzez przywrócenie przepływu Qi i homeostazy trzewnej4. Jednak brak ustandaryzowanych protokołów i jasności mechanistycznej ogranicza szersze wdrażanie kliniczne. Nowe badania podkreślają potencjał nowych interwencji, takich jak modulacja mikrobioty jelitowej oraz bioaktywne związki pochodzące z TCM, które mogą synergicznie poprawić funkcjonowanie jelit przy minimalnych skutkach ubocznych5. W związku z tym rozwój opartej na dowodach terapii integracyjnej, łączącej zasady TCM z nowoczesną farmakoterapią, daje nadzieję na rewolucję w leczeniu zaparć.
Zaparcia w wolnym tranzycie (STC) są kluczowym modelem patologicznym w badaniach podstawowych, skutecznie symulującym charakterystyczne zaburzenie ruchliwości ludzkich zaparć — znacząco opóźniony tranzyt jelitagrubego 6. Pełni rolę "dekodera" do wyjaśniania molekularnych mechanizmów zaparć, umożliwiając badaczom bezpośrednie badanie zmian patologicznych w tkance odbytniczej7, układzie nerwowym jelitowym8, komórkach śródmiąższowych Cajal9 oraz kluczowych szlakach sygnalizacyjnych10, łącząc tym samym objawy makroskopowe z nieprawidłowościami komórkowymi i molekularnymi poza zasięgiem badań klinicznych11. Na arenie międzynarodowej ugruntowane metody opracowywania modeli szczurów STC obejmują głównie podejścia indukowane chemicznie12, w szczególności wykorzystanie loperamidu — obwodowego agonisty receptora opioidowego, który hamuje aktywność neuronów i uwalnianie acetylocholiny, aby konsekwentnie wywołać opóźniony tranzyt w ciągu 5–7 dni — oraz strategie naśladujące etiologię13, takie jak długotrwałe podawanie środków przeczyszczających w wysokich dawkach stymulantów, które prowadzi do uszkodzenia nerwu jelita grubego, czerniaka coli oraz późniejszej bezwładności okrężnicy zależnej od środków przeczyszczających. Model szczura STC nie tylko daje wgląd w złożoną etiologię zaparć, ale także stanowi kluczowy most łączący podstawowe mechanistyczne wnioski z zastosowaniami klinicznymi.
Formuła Shengdu Pingmu (SDPF), obejmująca Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) oraz Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian), to zmodyfikowane preparaty szpitalne oparte na teorii tradycyjnej medycyny chińskiej i od dawna stosowane w naszym oddziale w leczeniu pokrewnych schorzeń. Wstępne obserwacje kliniczne z naszego szpitala sugerowały, że SDPF może łagodzić objawy zaparć (niepublikowane dane). Badania wykazały, że szlak sygnalizacyjny PI3K/AKT uczestniczy w regulacji ruchliwości jelita14, w której mikrobiota jelitowa i jej metabolity mogą odgrywać kluczową rolę poprzez modulację aktywności nerwu nerwowego i mięśni gładkich jelitowych15. Niemniej jednak precyzyjne mechanizmy regulacyjne pozostają niedo do końca poznane. Proponujemy, że szlak PI3K/AKT oraz mikrobiota jelitowa razem tworzą niezbędną oś regulującą ruchliwość jelita grubego. Hipoteza zakłada, że terapeutyczne efekty formulacji TCM na dysmotylność jelita grubego mogą być powiązane z modulacją szlaku PI3K/AKT oraz zrównoważeniem osi mikrobiota i jelita. Niniejsze badanie wypełnia tę lukę, proponując i testując nową, zintegrowaną hipotezę: że szlak PI3K/AKT oraz mikrobiota jelitowa pełnią rolę kluczowej, współzależnej osi ruchliwości jelita grubego. Głównym celem tych badań jest ustalenie, czy terapeutyczny efekt SDPF na zaparcia o wolnym przejściu jest pośredniczony poprzez podwójną modulację tej osi. Konkretnie, korzystając z modelu szczura, badaliśmy wpływ SDPF na kluczowe białka sygnalizacyjne PI3K/AKT, zmiany składu mikrobioty jelitowej oraz funkcję ruchliwości jelita. Wyjaśniając ten połączony mechanizm, badania te dostarczają, według naszej wiedzy, pierwsze eksperymentalne dowody na istnienie osi mikrobiota-PI3K/AKT jako jednolitego celu interwencji opartej na TCM, oferując tym samym bardziej kompleksowe podstawy molekularne leczenia zaburzeń ruchliwości jelita grubego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury eksperymentalne były przeprowadzane zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (National Institutes of Health, zaktualizowany w 2011 roku) i zatwierdzone przez Radę Etyczną Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Shandong (numer licencji etyki dobrobytu: SDUTCM20250421238).
Przygotowanie SDPF
Mieszanka zioła składa się z Radix Paeoniae Alba (Baishao) 20 g, Curcuma longa (Jianghuang) 10 g, Rhizoma Cibotii (Tanggouji) 10 g, Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) 30 g oraz Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) 30 g. Ten stosunek kombinacji został określony na podstawie doświadczeń klinicznych. Formuła została wyekstrahowana przez najpierw moczenie w wodzie dejonizowanej w stosunku stałym do cieczy 1:9 (g/mL) przez 30 minut, a następnie gotowanie przez 60 minut. Powstały roztwór był natychmiast filtrowany przez gazę i wirowany w napięciu 4 500 × g przez 5 minut, aby zebrać supernatant. Reszta była następnie dwukrotnie ponownie ekstrahowana w tych samych warunkach (stosunek 1:9, woda dejonizowana) z czasem skracania czasu gotowania o 30 minut przy każdej kolejnej ekstrakcji. Supernatanty ze wszystkich trzech ekstrakcji zostały połączone, skoncentrowane i liofilizowane próżniowo przez 5–7 dni, aby uzyskać proszek SDPF, który przechowywano w lodówce do dalszego użytku.
Analiza składników SDPF
Aby przygotować próbki stałe, odpowiednia ilość ujednoliconego materiału była przenoszona do 2 mL wirówki, mieszana z 1 mL 70% metanolu w wodzie oraz 3 mm kulkami ze stali nierdzewnej, następnie przetwarzana w zautomatyzowanym młynku przez 3 minuty, a następnie przez 10 minut wirowania. Próbki ciekłe rozcieńczano czystym metanolem i wirowano przez 10 minut. Następnie wszystkie próbki były wirowane w 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a powstałe supernatanty filtrowano przez filtr o średnicy 0,22 μm. Przed analizą instrumentalną do filtratu wprowadzono 2-chlorofenyloalaninę (wewnętrzny standard, 100 μg/mL), aby uzyskać końcowe stężenie 1 mg/L. Separację chromatograficzną przeprowadzono na systemie LC-MS wyposażonym w kolumnę C18 (1,8 μm × 2,1 mm × 100 mm), utrzymywaną na poziomie 30 °C, z przepływem 0,3 mL/min. Faza ruchoma składała się z 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (A) oraz acetonitrylu (B). Objętość wtrysku ustawiono na 2 μL, a autopróbkowiec utrzymywano na 4 °C. Detekcja spektrometrią mas była wykonywana zarówno w trybach jonizacji dodatniej, jak i ujemnej w następujących warunkach: temperatura grzejnika 325 °C, gaz powłokowy 45 jednostek dowolnych, gaz pomocniczy 15 arb, gaz zamiatający 1 arb, Napięcie elektronatrysku 3,5 kV, temperatura kapilarna 330 °C, a poziom RF soczewki S 55%. Dane były pozyskiwane w zakresie m/z od 100 do 1500 w trybie pełnego skanowania MS z rozdzielczością 120 000, podczas gdy fragmentacja MS/MS była przeprowadzana w trybie pozyskiwania zależnym od danych (dd-MS2, TopN=5) o rozdzielczości 60 000, stosując wyższą energię dysocjacji kolizyjnej.
Eksperyment na zwierzętach
Siedemdziesiąt dwa samce szczurów Sprague-Dawley (w wieku 6 tygodni, początkowa masa ciała 180–200 g; RRID: IMSR_JAX:000664) były przechowywane w warunkach SPF (24 ± 1 °C, 12-godzinny cykl światła/ciemności) z dostępem do jedzenia i wody. Po tygodniu aklimatyzacji losowo podzielono je na sześć grup (n=12/grupa) w zależności od masy ciała: (1) kontrola bezwyczynna (prawidłowa sól fizjologiczna), (2) grupa modelowa zaparć (10 mg/kg chlorowodorku loperamidu), (3) grupa niskich dawk (SDPF-L)-, (4) średnich (SDPF-M)-, (5) grup SDPF w wysokich dawkach (SDPF-H) (odpowiednio 6, 9 i 12 g/kg) oraz (6) grupa pozytywna (2 mg/kg cytrapian mosaprydu). SDPF przygotowywano świeżo jako zawiesina w wodzie destylowanej w stężeniach 3, 4,5 i 6 g/mL i podawano doustnie w stałej objętości 2 mL/kg, odpowiadającej dawkom odpowiednio 6, 9 i 12 g/kg. Loperamid chlorkowodorek przygotowywano świeżo jako zawiesina w wodzie destylowanej w stężeniu 5 mg/mL i podawano doustnie w stałej objętości 2 mL/kg (równowartość 10 mg/kg). Po tygodniu aklimatyzacji zaparcia były wywoływane w grupach (2) – (6) doustnym podawaniem chlorowodorku loperamidu raz dziennie przez tydzień. Grupa kontrolna z pustą otrzymywała równoważną objętość soli fizjologicznej w normie. Następnie przez kolejny tydzień szczury w grupach (3)–(5) otrzymywały leczenie SDPF doustnie raz dziennie, grupa kontrolna (6) dodatkowo przyjmowała cytrynian mosaprydu (2 mg/kg) jednocześnie, natomiast szczury w grupach (2) – (6) nadal otrzymywały loperamid chlorowodorek (10 mg/kg) raz dziennie, aby utrzymać model zaparć. Grupa kontrolna z pustym ogniem nadal otrzymywała prawidłową sól fizjologiczną. Po zakończeniu okresu leczenia wszystkie szczury były głodzone przez noc z darmowym dostępem do wody. Zwierzęta były następnie znieczulone za pomocą intraperitonealnego zastrzyku sodu pentobarbitalu (40 mg/kg masy ciała). Po głębokiej znieczuleniu potwierdzonej brakiem odruchów pedałowych, szczury zostały uśpione przez zwichnięcie szyjki macicy. Bezpośrednio potem szybko pobrano tkanki odbytu. Do analiz histologicznych i immunohistochemicznych segmenty tkanek były utrwalane w 4% paradehydu. Do analizy ekspresji białek próbki tkanek były mrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
Pierwszy stolec
Czas do wydalenia pierwszego czarnego stolca odnotowano dla trzech szczurów na grupę. Przed eksperymentem wszystkie szczury były głodzone przez 12 godzin z darmowym dostępem do wody. Każde zwierzę otrzymywało następnie podanie dobrzuchadłowej przygotowanej zawiesiny z tuszu (5% węgla aktywowanego i 5% gumy arabskiej) w dawce 10 mL/kg masy ciała, z dokładnym czasem podania. Po przejściu szczury były indywidualnie trzymane w oddzielnych klatkach z dostępem do jedzenia i wody ad libitum. Wygląd pierwszego czarnego stolca każdego szczura był dokładnie obserwowany i rejestrowany, aby obliczyć czas przejścia jelit.
Zawartość wody w kałach
Po pomyślnym ustanowieniu modelu i na końcu zabiegu pobrano świeże próbki kału wydalone w ciągu 2 godzin z każdej grupy szczurów (n = 6) i umieszczono je w wcześniej zważonych suchych probówkach EP. Natychmiast zarejestrowano mokrą masę odchodu. Następnie próbki zostały przeniesione do suszarki i odwodnione w temperaturze 60 °C przez 36 godzin. Po początkowym okresie suszenia próbki były ważone i wracane do pieca, a pomiary wagi powtarzano co 2 godziny, aż osiągnięto stałą wagę (co wskazuje na całkowite odwodnienie). Procent zawartości wody w kałach został następnie obliczony według następującego wzoru:
Zawartość wody w kałach (%) = [(Mokra masa - Sucha masa) / Mokra masa] × 100%
Szybkość napędu jelitowego
Po 12-godzinnym okresie postu (z dostępem do wody) szczury z każdej grupy (n = 6) otrzymały dawkę wewnątrzżołądkową (10 mL/kg) zawiesiny tuszowej zawierającej 5% węgla aktywowanego i 5% gumy arabskiej. Dwadzieścia pięć minut później zwierzęta zostały znieczulone poprzez zastrzyk do otrzewnowej 5% hydratu chloralowego. Obszar brzucha był dezynfekowany przez przetarcie 75% etanolem przed pobraniem tkanek, a kończyny następnie przypięto do deski do sekcji. Jamę brzuszną starannie odsłonięto nożyczkami chirurgicznymi, a przewód jelitowy od odźwiernika do połączenia kręto-krętokątnego został wycięty. Izolowane jelito było prostowane na sterylnym papierze filtracyjnym i rejestrowano dwa pomiary: (1) całkowitą długość jelita cienkiego oraz (2) odległość pokonaną przez przód tuszu. Następnie obliczono współczynnik napędu jelitowego według następującego wzoru:
Tempo napędu jelitowego (%) = (Odległość migracji atramentu / całkowita długość jelit) × 100%
Barwienie HE
Dla grup kontrolnych, modelowych, SDPF-M i Mos (n = 3 na grupę) pobrano i przetworzono próbki odbytnicze pod kątem barwienia hematoksyliny i eozyny (HE). Próbki zostały utrwalone w 4% paradehydu, odwodnione w etanolu oklasyfikowanym i osadzone w blokach parafiny. Cienkie przekroje, o grubości 4–5 μm, były przygotowywane i mocowane do szkiełek przed konwencjonalnym barwieniem hematoksyliną i eozyną. Procedura rozpoczęła się od deparafinizacji za pomocą ksylenu, a następnie od rehydratacji poprzez serię malejących stężeń etanolu. Jądra barwiono przez wystawienie fragmentów na hematoksylinę przez 5–8 minut. Po różnicowaniu w 1% alkoholu kwasowym i niebieskim w wodzie 0,2% amoniaku, cytoplazma i macierz zewnątrzkomórkowa były kontrastowano z eozyną przez 1–2 minuty. Na koniec poplamione fragmenty zostały odwodnione, oczyszczone i zamontowane za pomocą pokrywek do mikroskopowej obserwacji. To podejście umożliwiło szczegółową ocenę morfologii błony śluzowej jelit, w tym struktury kosmków i krypt, stanu komórek nabłonkowych oraz obecności nacieków zapalnych w obrębie błonki proprijowej.
Analiza ścieżki KEGG i wzbogacenia GO
Wykorzystując wcześniej ustalony profil chemiczny SDPF, przeprowadzono przewidywania celowe białek dla każdego składnika za pomocą platformy SwissTargetPrediction. Potencjalne cele istotne dla zaparć zostały przefiltrowane i poddane anotacjom funkcjonalnym za pomocą bazy danych DAVID 6.8, z progiem istotności P < 0,05. Powstały zestaw genów został następnie poddany klasyfikacji GO, aby wyjaśnić jego rolę w procesach biologicznych, funkcjach molekularnych i komponentach komórkowych. Aby jeszcze lepiej wyjaśnić ich udział w patogenezie chorób, cele te zostały następnie zmapowane na szlaki KEGG, ujawniając kilka kaskad sygnalizacji, które były znacząco wzbogacone i potencjalnie miały związek z początkiem i rozwojem zaparć.
Budowa sieci "Component-Target-Pathway"
W Cytoscape (wersja 3.6.1) zbudowano sieć "Komponent-Cel-Szlak" poprzez systematyczną integrację chemicznych składników SDPF, odpowiadających im celów terapeutycznych w przypadku zaparć oraz odpowiednich wzbogaconych szlaków. W tym modelu graficznym zastosowano różne geometrie węzłów do reprezentacji trzech typów danych: okręgi dla złożonych, trójkąty dla celów oraz prostokąty dla ścieżek. Siła połączeń między tymi węzłami została zmierzona za pomocą wagowania krawędzi, co dało holistyczny obraz złożonych, wielowarstwowych interakcji farmakologicznych.
Dokowanie molekularne
Do analizy molekularnej dokowania wybrano cztery związki bioaktywne — mianowicie cyklokurkuminę, albiflorinę, kwas chlorogenowy i kwercetynę — jako cząsteczki ligandu, a ich struktury pobrano z bazy danych PubChem przy użyciu odpowiednich numerów rejestrów CAS. Aby przygotować receptory białkowe, skonsultowano bazę wiedzy UniProt w celu potwierdzenia docelowych białek PI3K i AKT, a ich trójwymiarowe struktury zostały następnie pobrane z RCSB Protein Data Bank. Te struktury białek i związków były następnie przetwarzane w Discovery Studio 2019, gdzie dodawano atomy wodoru, przypisywano ładunki i definiowano typy atomów; Dodatkowo zidentyfikowano potencjalne kieszenie wiążące na receptorach. Przygotowane ligandy i receptory zostały następnie zapisane w formacie PDBQT do symulacji dokowania. Procedura dokowania została przeprowadzona w następującej konfiguracji: promień klastra pozycji 0,5, generowanie 10 losowych konformacji ligandów oraz 10 orientacji udoskonalania. Po zakończeniu przejazdów dokujących oceniono kompleksy kandydatów i uszeregowano je zgodnie z przewidywaną wolną energią wiązania. Ostatecznie wybrano i zobrazowano najbardziej energetycznie korzystne pozy wiązania za pomocą PyMOL, aby zilustrować kluczowe interakcje międzycząsteczkowe.
Immunohistochemia
Preparaty odbytnicze z osadzoną parafiną, przecięte do grubości 4 μm i pobrane z kohort Control, Model i SDPF-M, zostały najpierw oczyszczone z parafiny i stopniowo nawodniane. Miejsca antygenowe zostały odmaskowane przez podgrzewanie preparatów w buforze cytrynianowym dostosowanym do pH 6,0. Aby schłodzić endodogenne nadtlenki, tkanki poddano 3% roztworowi nadtlenku wodoru, a następnie inkubowano z normalną surowicą kozą, aby zmniejszyć wiązanie niespecyficznych przeciwciał. Następnie sekcje były inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z głównymi przeciwciałami skierowanymi do fosforylowanych PI3K i AKT; równoległe sekcje inkubowane z PBS służyły jako kontrolę ujemną. Po dokładnym myciu zastosowano przeciwciała wtórne sprzężone z nadoksydazą chrzanu, a immunobarwienie opracowano przy użyciu chromogenu DAB pod mikroskopową obserwacją w celu kontrolowania czasu reakcji. Na koniec tkanki były lekko odbarwiane hematoksyliną, odwodnione przez alkohole klasyfikowane, oczyszczone i montowane. Poziomy ekspresji p-PI3K i p-AKT zostały jakościowo ocenione przez dwóch niezależnych badaczy niewidzących grupy eksperymentalne, a reprezentatywne obrazy zostały wybrane w celu zilustrowania różnic między grupami.
Western blotting
Próbki tkanki odbytniczej od szczurów były dwukrotnie płukane schłodzoną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym przed ujednoliceniem na lodzie przez 10 minut w odpowiedniej objętości buforu lizy RIVA. Po homogenizacji mieszanina była wirowana w 15 000 × g, a supernatant zachowano do analizy. Ilościowa analiza białek została przeprowadzona metodą kwasu bicynchoninowego. Następnie próbki zostały połączone z buforem SDS i denaturowane przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Równoważne ilości białek zostały następnie rozdzielone za pomocą elektroforezy żelu SDS-poliakrylamidu i przeniesione na membrany poliwinylidenu o porach 0,45 μm. Po transferze błony zostały pozostawione do wyschnięcia na powietrzu, a następnie zablokowane 5% suchym mlekiem beztłuszczowym w TBST przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia. Po tym etapie błony były płukane metodą TBST, a następnie inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z głównymi przeciwciałami skierowanymi do AQP3 (RRID: AB_2837708) i AQP8 (RRID: AB_605941). Następnego dnia, po kolejnych płukaniach TBST, błony były inkubowane odpowiednim przeciwciałem wtórnym sprzężonym z nadksiędksydazą chrzanu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Ostatecznie wykryto i uchwycono pasma immunoreaktywne za pomocą systemu obrazowania.
Immunofluorescencja
Procedurę barwienia immunofluorescencyjnego wykonano na przekrojach tkanek odbytniczych szczurów leczonych metodą kontrolną, modelową i SDPF-M w następujący sposób: po kriosekcji tkanki zostały utrwalone w 4% paraformaldehydu, permeabilizowane 0,1% Tritonem X-100 i zablokowane odpowiednim buforem blokującym, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Następnie sekcje inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C ze zmieszanką przeciwciał pierwotnych przeciwko AQP3 i AQP8, po czym niezwiązane przeciwciała zostały wypłukane, a tkanki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności z mieszaniną przeciwciał wtórnych — konkretnie anty-króliczego IgG sprzężonego z Alexa Fluor 594 (czerwonym) do znakowania AQP3 oraz koziego anty-mysiego IgG skonjugoowanego z Alexa Fluor 488 (zielonym) do znakowania AQP8. Po inkubacji przeciwciał wtórnych i późniejszych płukaniach, jądra komórek były barwione DAPI, a preparaty były pokrywane wodnym nośnikiem montażowym przed wizualizacją i pozyskiwaniem obrazu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego.
Sekwencjonowanie rRNA 16S mikrobioty kałowej
Dla każdej grupy eksperymentalnej (n = 8) DNA genomowe bakterii zostało wyizolowane z kalu szczura za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA gleby, przy czym wszystkie procedury ściśle przestrzegały protokołu dostawcy. Amplifikacja PCR skierowana na hiperzmienne obszary V3–V4 genu 16S rRNA została przeprowadzona na cyklerze termicznym z wykorzystaniem pary primerów 338F/806R. Sekwencjonowanie ampliconu zostało wykonane na platformie Illumina MiSeq zgodnie z wytycznymi producenta, generując wystarczającą głębokość sekwencjonowania do osiągnięcia nasycenia krzywą rzedzenia i zapewnienia wiarygodnej analizy różnorodności mikroorganizmów. Po zakończeniu sekwencjonowania surowe odczyty były filtrowane jakościowo, usuwane przez adapter i łączone za pomocą Trimmomatic i FLASH. Sekwencje wysokiej jakości zostały następnie zgrupowane w operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) z progiem podobieństwa 97% za pomocą UPARSE, a potencjalne sekwencje chimeryczne zostały zidentyfikowane i usunięte za pomocą UCHIME. Taksonomiczne przypisanie reprezentatywnych sekwencji przeprowadzono za pomocą klasyfikatora RDP względem bazy referencyjnej SILVA, z progiem ufności 70%. Aby ocenić różnorodność alfa w społecznościach mikrobiologicznych, obliczono estymator bogactwa Chao1 oraz indeks różnorodności Shannona za pomocą pakietu oprogramowania Mothur (v.1.30.2). W analizie beta-różnorodności wykonano analizę głównych współrzędnych, aby zwizualizować różnice składowe między grupami. Skonstruowano diagram Venna, aby zilustrować rozkład unikalnych i wspólnych OTU w różnych warunkach eksperymentalnych. Identyfikacja różnicowo licznych taksonów między kohortami została przeprowadzona za pomocą liniowej analizy dyskryminacyjnej wielkości efektu. Na koniec przeprowadzono profilowanie predykcyjne funkcji wspólnot mikrobiologicznych za pomocą PICRUSt2, który wnioskował potencjał funkcjonalny na podstawie adnotacji ortologów KEGG.
Statystyki
Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu SPSS 23.0 oraz GraphPad Prism 8.0. Dane przedstawiane są jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Normalność rozkładu danych oceniono za pomocą testu Shapiro–Wilka. Do porównań między dwiema grupami zastosowano test t-Studenta z niezależnymi próbkami dla danych o rozkładzie normalnym, a test Mann–Whitney U dla danych nierozkładających się normalnie. Dla porównań z udziałem trzech lub więcej grup zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test post-hoc Tukeya dla danych rozkładających się normalnie, natomiast test Kruskala–Wallisa, a następnie test post-hoc Dunna stosowano dla danych nierozkładających się normalnie. Do analiz mikrobiomów zidentyfikowano taksony o zróżnicowanej obfitości za pomocą liniowej analizy dyskryminantnej wielkości efektu (LEfSe) z domyślnym progiem (wynik LDA > 2,0), a wielokrotne korekty testowe zastosowano metodą Benjamini–Hochberga wskaźnika fałszywego wykrywania (FDR). Analizy statystyczne mikrobiomu przeprowadzono przy użyciu Mothur (v.1.30.2), LEfSe (narzędzie online, laboratorium Huttenhowera) oraz PICRUSt2 (v.2.5.0). Wartość p poniżej 0,05 uznano za istotną statystycznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ekstrakcja i liofilizacja SDPF
SDPF to wieloziołowe opracowanie obejmujące pięć roślin leczniczych: Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegesbeckia orientalis L. (Xixiancao) oraz Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) (Rysunek 1A). Mieszanina była ekstrahowana wodą oczyszczoną i liofilizowana do proszku do dalszej analizy (Rysunek 1B).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przewlekłe zaparcia to wieloczynnikowe zaburzenie, obejmujące złożone interakcje między dysbiozą mikrobioty jelitowej, zaburzeniami funkcji nerwowo-mięśniowych oraz zmienioną wydzielaniem jelit. Te objawy utrzymują się ponad sześć miesięcy i znacząco pogarszają jakość życia pacjentów19. Zaparcia można podzielić na kilka podtypów, w tym powolne tranzyty, normalne, zaburzenia defekacji oraz mieszane typy20. Chociaż dokładna geneza przewlekłych zaparć pozostaje niedo do końca ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.
Finansowanie: Badania te zostały wsparte przez Program Nauki i Technologii w Shenzhen (grant nr JCYJ20220531092203007).
Jesteśmy głęboko wdzięczni dr Liqun Qu z Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Shandong za udzielenie wskazówek technicznych przy tworzeniu modelu zaparć u szczurów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Automatyczny młynek | Wysokoprzepustowy homogenizator tkanek do mielenia próbek | JXFSTPRP-48 | |
| System LC-MS | Thermo Fisher Scientific | Q System HF LC-MS Exactive | Ultrawydajna chromatografia cieczowa; System spektrometrii mas |
| Spektrometr mas | Thermo Fisher Scientific | P: Aktywny HF | Spektrometr masowy Orbitrap o wysokiej rozdzielczości |
| Kolumna C18 | Agilent Technologies | Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1 & razy; 100 mm, 1,8 μ m) | Kolumna fazowa odwrotna do separacji związków |
| System skanowania obrazowego | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | System obrazowania żelowego i plamowego |
| Thermocycler | Biosystemy stosowane (Thermo Fisher Scientific) | System PCR GeneAmp 9700 | Instrument wzmacniający PCR |
| Zestaw do ekstrakcji DNA gleby | Omega Bio-Tek | D5625 | Zestaw do ekstrakcji DNA mikroorganizmów z próbek kału/gleby |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.