Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie tkanki płucnej pojedynczokomórkowym RNA w modelu szczura z zespołem ostrego niedociągania oddechowego

433 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70491

⸱

7 kwietnia 2026

 ,  , 
1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule przedstawiono ustandaryzowany protokół analizy sekwencjonowania pojedynczokomórkowego RNA (scRNA-seq) tkanki płucnej w modelu szczura z zespołem ostrego niedostatku oddechowego (ARDS). Szczegółowo opisuje etapy od ustanowienia modelu indukowanego przez LPS do analizy bioinformatycznej, identyfikując 21 klastrów komórek i 6 subpopulacji makrofagów oraz podkreślając kluczowe szlaki zapalne zaangażowane w patogenezę ARDS.

Streszczenie

Ostry zespół niedociągania oddechowego (ARDS) to ciężka zapalna choroba płuc o wysokiej śmiertelności, charakteryzująca się zaburzeniami odpowiedzi immunologicznej i uszkodzeniami pęcherzyków płucnych, jednak jego heterogeniczność komórkowa pozostaje niedo do końca poznana. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) oferuje bezprecedensową rozdzielczość mechanizmów specyficznych dla typu komórki, jednak jego zastosowanie w ARDS jest ograniczone przez zmienność techniczną. Przedstawiamy tutaj standaryzowany protokół analizy tkanki płucnej scRNA-seq w modelu ARDS u szczurów indukowanego lipopolisacharydami (LPS). Metoda ta obejmuje zoptymalizowaną dysocjację tkanek, rygorystyczną kontrolę jakości, usuwanie dubletów, korekcję efektu partii oraz kompleksowe bioinformatyczne pipeline'y do klasteryzacji, adnotacji i analizy różnicowej ekspresji. Nasze podejście wiarygodnie identyfikuje 21 odrębnych populacji komórek i ujawnia sześć podpopulacji makrofagów/monocytów z unikalnymi sygnaturami transkrypcyjnymi w ARDS. Specyficzna dla podklastra różnicowa ekspresja genów oraz analiza wzbogacenia funkcjonalnego dodatkowo zidentyfikowały kluczowe geny i szlaki leżące u podstaw patogenezy ARDS. Ten powtarzalny przepływ umożliwia dogłębną charakterystykę różnorodności komórkowej, szlaków zapalnych oraz kandydatów na cele terapeutyczne, zapewniając solidne podstawy do badań mechanistycznych i translacyjnych w ARDS.

Wprowadzenie

Zespół ostrego niedorostu oddechowego (ARDS) to ostra choroba układu oddechowego charakteryzująca się rozproszonym zapaleniem płuc oraz niesercowo-gennym obrzękiem płuc, który objawia się głównie postępującą hipoksemią i niewydolnością oddechową 1,2. Mechanizmy patologiczne ARDS obejmują zaburzenia kaskady zapalne, zaburzenia bariery włosowatej pęcherzykowo-naczyniowatej oraz nieprawidłową aktywację i interakcje wielu typów komórek odpornościowych 3,4. Podczas postępu ARDS komórki odpornościowe w tkance płucnej napędzają kaskady zapalne poprzez wydzielanie mediatorów zapalnych i modulację odpowiedzi immunologicznych, co zaburza śródbłonek płuc, aktywuje kaskadę koagulacji zewnętrznej i pogłębia uszkodzenia płuc 5,6,7. Jednak obecna wiedza na temat mechanizmów patologicznych na poziomie komórkowym w ARDS pozostaje ograniczona, co ogranicza rozwój konkretnych terapii farmakologicznych, podczas gdy obecne strategie leczenia polegają głównie na różnych metodach wsparcia tlenowego i wentylacji mechanicznej1. Dogłębna charakterystyka heterogeniczności komórkowej i dynamicznych zmian podczas patogenezy ARDS ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji nowych celów terapeutycznych oraz opracowania nowych strategii leczenia 8,9,10.

Pojawienie się technologii sekwencjonowania pojedynczych komórek RNA (scRNA-seq) przyniosło rewolucyjne przełomy w badaniach nad sekwencjonowaniem RNA, umożliwiając analizę heterogeniczności komórkowej i funkcjonalnej dynamiki w patogenezie choroby11,12. W porównaniu z tradycyjnym sekwencjonowaniem RNA w masie, technologia scRNA-seq może identyfikować rzadkie, lecz krytyczne podpopulacje komórek, ujawniać dynamiczne procesy przejść między stanami komórkowymi oraz odkrywać złożone sieci interakcji międzykomórkowych, informacje często maskowane w analizach na poziomie populacji 13,14,15. Najnowsze badania scRNA-seq w ARDS przyniosły istotne postępy, w tym identyfikację specyficznych sygnatur ekspresji genów monocytów, odkrycie nieprawidłowych wzorców polaryzacji makrofagów oraz wyjaśnienie sieci komunikacji międzykomórkowej profibrotycznej 16,17,18,19 . Te odkrycia nie tylko pogłębiają naszą wiedzę o mechanizmach patofizjologicznych ARDS, ale także dostarczają nowych informacji na temat rozwoju biomarkerów, stratyfikacji chorób oraz precyzyjnej terapii20,21.

Jednak obecne badania ARDS scRNA-seq napotykają wyzwania, w tym niewystarczającą standaryzację metodologiczną, znaczne różnice w protokołach przetwarzania próbek oraz niespójne procesy analizy danych, które ograniczają powtarzalność wyników badań i ich klinicznych zastosowań translacyjnych22,23. Protokół ten odpowiada na techniczne wyzwania związane z analizą scRNA-seq tkanki płucnej ARDS poprzez optymalizację procedur przetwarzania tkanek, kontroli jakości i analizy danych, tworząc tym samym podstawę dla badań mechanistycznych i rozwoju terapeutycznego. Standaryzowane podejście zapewnia powtarzalność w różnych laboratoriach i ułatwia badania porównawcze w badaniach ARDS nad heterogenicznością komórkową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Dwanaście samców szczurów Sprague-Dawley (SD) wolnych od specyficznych patogenów (SPF), w wieku 6–7 tygodni i ważących 220 g ± 10 g, zostało zakupionych od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (numer licencji zwierzęcej: SCXK (Jing) 2025-0008). Szczury zostały umieszczone w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Szpitala Dongzhimen na Uniwersytecie Medycyny Chińskiej w Pekinie, zgodnie z krajowym standardem "Wymagania dotyczące środowiska i mieszkań zwierząt laboratoryjnych" (GB 14925-2010, wydany przez Narodowy Komitet Techniczny ds. Standaryzacji Zwierząt Laboratoryjnych Chin). Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt i Etyki Szpitala Dongzhimen na Uniwersytecie Medycyny Chińskiej w Pekinie (numer zatwierdzenia: 24-54). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Ustanowienie modelu i zbieranie próbek

UWAGA: Przed eksperymentem poddaj wszystkim szczurom tygodniowy okres aklimatyzacji, aby zminimalizować efekty wywołane stresem.

  1. Rozpuszcz lipopolisacharyd Escherichia coli (LPS) w soli fizjologicznej 0,9%, aby uzyskać roztwór LPS o stężeniu 0,4 mg/mL.
  2. Losowo podziel 12 samców szczurów Sprague-Dawley (SD) z SPF na dwie grupy: grupę kontrolną (n = 6) oraz grupę modelu ARDS (n = 6).
  3. Podawaj 0,9% soli fizjologicznej dookołotchawicowej w dawce 0,5 mL/100g masy ciała grupie kontrolnej.
  4. Podawaj roztwór LPS o stężeniu 0,4 mg/mL poprzez wstrzyknięcie wewnątrztrachealnie w tej samej objętości (0,5 mL/100g) grupie modelowej ARDS, a po 16 godzinach znieczulaj szczury za pomocą izofluranu (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
  5. Pobieraj krew przez aortę brzuszną, a następnie wiruj (4 °C, 1000 × g, 30 min), aby uzyskać surowicę.
  6. Otwórz jamę piersiową i usuń tkankę płucną.
  7. Wykonaj płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe przez kikut oskrzela za pomocą strzykawki, aby uzyskać płyn plawający oskrzelowo-pęcherzykowy (BALF)24,25.
  8. Pobierz prawy płat płuca i przepłukaj go PBS do dalszego badania patologicznego.
  9. Pobierz lewy płat płuca i przepłucz go PBS do kolejnych eksperymentów sekwencjonowania pojedynczych komórek oraz biologii molekularnej26,27.

2. Histopatologiczna ocena tkanki płucnej

  1. Zanurz pobraną tkankę prawego płuca szczurów w 4% paraformaldehydu w celu utrwalenia przez 12 godzin.
  2. Po utrwaleniu odwodnij tkankę przez stopniowo uporządkowaną serię etanolu (70%, 80%, 90%, 95%, 100% i 100%), z uwzględnieniem 2 godzin w każdym stężeniu.
  3. Traktuj odwodnioną tkankę ksylenem aż stanie się przezroczysta.
  4. Infiltruj przezroczystą tkankę stopioną parafiną w piekarniku o temperaturze 60 °C przez 2 godziny.
  5. Włóż blok tkanki do formy wsadowej, wlej świeżą parafinę i pozwól jej ostygnąć oraz stwardnieć w blok parafinowy.
  6. Podziel blok parafiny na plasterki o grubości 4 μm za pomocą mikrotomu, unieś je na wodzie w kąpieli wodnej 45 °C, aby je rozprowadzić, a następnie zbieraj za pomocą szkiełek pokrytych poli-L-lizyną.
  7. Piecz szkiełki w piekarniku w 60 °C, aby zapewnić solidne przyleganie kawałków do tych preparatów.
  8. Odparaffiniuj te fragmenty przez zanurzenie w ksylenie i nawilżanie je poprzez opadający gradient etanolu (100%, 95%, 90%, 80% i 70%).
  9. Przepłucz fragmenty PBS, wykonaj barwienie hematoksylyną i eozyną (HE) oraz zamontuj pokrywki żywicą neutralną.
  10. Oceń uraz płuc na całych preparatach skanowanych przez całe szkiełko, stosując standaryzowany system oceniania oparty na infiltracji neutrofili, zapaleniu śródmiąższowym, obrzęku i zatkaniu nosu.
    UWAGA: Każdy parametr był oceniany od 0 do 4 na podstawie stopnia zamieszania patologicznego: 0 (brak); 1 (≤25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 (>75%)28,29.

3. Test immunosorbentny związany z enzymami

UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C, jeśli analiza nie może zostać przeprowadzona bezpośrednio po pozyskaniu.

  1. Rozpuszczaj standardy i pozwól im stać w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie wykonaj seryjne rozcieńczanie zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przygotuj biotynowo-biotynowy roztwór roboczy przeciwciał, enzymatyczny sprzężony roztwór roboczy oraz bufor do płukania zgodnie z instrukcjami instrukcji.
  3. Dodaj 100 μL każdej próbki lub 100 μL seryjnie rozcieńczonych standardów do dołków pokrytych przeciwciałami i inkubuj w 37 °C przez 90 minut.
  4. Umyj płytkę 4 razy za pomocą podkładki do podkładania płyt, dodaj 100 μL biotinylowanego roztworu roboczego przeciwciał i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  5. Umyj płytkę 4 razy, dodaj 100 μL enzymatycznego sprzężenia roboczego i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  6. Dodaj 100 μL roztworu substratu na dołek, inkubuj chroniony przed światłem w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  7. Dodaj 100 μL roztworu stopowego na dołek, delikatnie wymieszaj i zmierz gęstość optyczną (OD) na 450 nm za pomocą czytnika mikropłyt.
  8. Wygeneruj krzywą standardową, renderując wartości OD względem standardowych stężeń za pomocą zaprojektowanego oprogramowania.
  9. Określ stężenia próbek na podstawie zmierzonych wartości przedawkowania i krzywej standardowej.

4. Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do sekwencjonowania

UWAGA: Po pozyskaniu tkanki płucnej należy ją umieścić na lodzie i szybko przetworzyć, aby utrzymać żywotność komórek.

  1. Przemyj tkankę płucną 3 razy za pomocą PBS schłodzonej do 4 °C.
  2. Dodaj 2 mL wcześniej schłodzonego PBS i dalej pokrój je na mniejsze kawałki sterylnymi nożyczkami na około 0,5 mm3 cale.
  3. Użyj pipety Pasteura, aby przenieść posiekaną tkankę razem z PBS do probówki wirówki o pojemności 15 mL.
  4. Dodaj dodatkowy 1 ml PBS schłodzonego do 4 °C do naczynia hodowniczego, przepłucz i ponownie zawiesij pozostałe fragmenty tkanki, a następnie przelej zawiesinę do tej samej probówki.
  5. Dostosuj objętość do 6,5 mL przy PBS schłodzonym do 4 °C, trawimy fragmenty tkanek w roztworze enzymatycznym zawierającym kolagenazę I (100 U/mL) i Dispazę II (1 U/mL), a następnie inkubuj delikatnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  6. Gdy fragmenty tkanek stają się przezroczyste i nie pozostaną wyraźne stałe fragmenty, przefiltruj strawioną tkankę przez sita komórkowe o pojemności 70 μm i 40 μm, następnie wiruj (4°C, 500 × g, 5 min) i wyrzucaj supernatant.
  7. Natychmiast ponownie zawiesić pellet w 3 mL buforu lizy czerwonych krwinek (RBC), delikatnie wymieszać pipetowaniem i lizować na lodzie przez 10 minut.
  8. Gdy supernatant wydaje się bladożółty lub prawie bezbarwny, dodaj 7 mL PBS, aby zakończyć reakcję, odwiąć (4 °C, 500 × g, 5 min) i wyrzucić supernatant.
  9. Dodaj 3 mL PBS, aby ponownie zawiesić komórki i określić stężenie oraz żywotność komórek za pomocą barwienia trypanowego na niebiesko.
    UWAGA: Jeśli żywotność komórek spadnie poniżej 70%, wykonaj zabieg usunięcia martwych komórek.
  10. Przemyj komórki dwukrotnie buforem płuczącym zawierającym 0,04% surowicowej albuminy (BSA) przygotowanej w DPBS.
  11. Ponownie zawiesijcie komórki do liczenia i dostosowuję stężenie do 1 000 komórek/μL do dalszego obciążenia i wykrywania.

5. Kontrola jakości danych sekwencjonowania pojedynczych komórek

UWAGA: Biblioteki RNA pojedynczych komórek zostały przygotowane z zawiesin komórkowych przy użyciu metody budowy bibliotek pojedynczych komórek opartej na kroplach. Biblioteki były sekwencjonowane na platformie o wysokiej przepustowości, wykorzystując chemię sekwencjonowania opartą na nanokulkach DNA. Na bibliotekę załadowano około 21 000 komórek, co dążyło do tempa odzyskiwania komórek na poziomie ~60%. Sekwencjonowanie generowało łącznie 5,0 × 108 odczytów na bibliotekę, ze średnią głębokością 30 000–40 000 odczytów na komórkę. Surowe dane sekwencjonowania były przetwarzane przy użyciu odpowiadającego pociągu analizy RNA pojedynczej komórki, aby stworzyć macierz ekspresji genów dla każdej próbki.

  1. Zbuduj bibliotekę Oligo za pomocą PCR i oznaczania kodów kreskowych, zapewniając stężenie >10 ng/μL i szczytowy rozmiar 180 bp ±10 bp.
  2. Zbuduj bibliotekę cDNA poprzez fragmentację, naprawę końców, ligację adaptorów i PCR, zapewniając stężenie >10 ng/μL i szczytowy rozmiar 350–550 bp.
  3. Wygeneruj obiekt Seurat dla każdej próbki z macierzy ekspresji genów za pomocą funkcji Read10X w pakiecie Seurat (v4.3.0) w oprogramowaniu R (v4.2.0).
  4. Usuwanie komórek niskiej jakości poprzez filtrowanie tych z udziałem genów mitochondrialnych >10% lub hemoglobiną >5%.
  5. Normalizuj dane metodą "LogNormalize" z współczynnikiem skalowania 10 000.
  6. Zidentyfikuj cechy o wysokiej zmienności za pomocą metody "VST" i zachowaj 2000 najważniejszych genów do dalszej analizy.
  7. Przeprowadzaj punktację cyklu komórkowego z wykorzystaniem wbudowanych genów markerów cyklu komórkowego Seurat i cofaj się do efektów cyklu komórkowego (G2M). Score i S.Score) podczas skalowania danych.
  8. Wykrywanie i usuwanie potencjalnych dubletów za pomocą DoubletFinder (v2.0.3) z pN = 0,25, pK = 0,09 i oczekiwanym wskaźnikiem dubletów 0,06, a następnie wykluczenie ich z dalszego przetwarzania.
  9. Poprawne efekty wsadowe między samplami za pomocą pakietu Harmony (v0.1.1) z theta = 2 i max.iter.harmony = 20.
  10. Dodaj kolumny informacyjne dla nazw poszczególnych próbek oraz szczegóły grupowania grup modeli ARDS i grupy kontrolnej do metadanych w obiekcie Seurat.

6. Redukcja wymiarowości, klasteryzacja i adnotacja typów komórek

  1. Przeprowadz analizę głównych składowych (PCA) na genach o wysokiej zmienności z wykorzystaniem funkcji RunPCA w Seurat.
  2. Określ optymalną liczbę głównych komponentów za pomocą wizualizacji ElbowPlot.
  3. Zidentyfikuj główne klastry komórek, stosując algorytm Leiden za pomocą funkcji FindClusters i FindNeighbors firmy Seurat z rozdzielczością 0,1.
  4. Przeprowadz redukcję wymiarowości UMAP przy użyciu wybranych głównych komponentów.
  5. Anotuj typy komórek, identyfikując geny markerowe za pomocą funkcji FindAllMarkers.
  6. Wizualizuj ekspresję genów markerowych między typami komórek za pomocą funkcji DotPlot.
  7. Dodaj nową kolumnę informacji z wynikami adnotacji komórek do metadanych i wizualizuj adnotację typu komórki za pomocą Umap.
  8. Oblicz proporcje każdej grupy eksperymentalnej w każdym zidentyfikowanym typie komórek za pomocą funkcji dplyra do liczenia komórek i obliczania procentów.
  9. Wygeneruj ułożone wykresy słupkowe za pomocą ggplot2, aby zilustrować skład grup dla typu komórek, w tym etykiety procentowe i porównania statystyczne między grupami.

7. Analiza subpopulacji

  1. Wyodrębnij podpopulację komórek docelowych za pomocą funkcji podzbioru i stwórz odpowiadający mu obiekt Seurat do analizy na poziomie podpopulacji w dalszej fazie.
  2. Ponownie normalizować i skalować dane subpopulacji, jednocześnie cofając geny mitochondrialne, geny hemoglobiny, liczbę UMI oraz wyniki cyklu komórkowego.
  3. Wykonaj wtórną analizę PCA i zastosuj korekcję wsadową Harmony specjalnie dla subpopulacji.
  4. Przeprowadz ponowne klasteryzowanie za pomocą funkcji FindNeighbors i FindClusters, aby zidentyfikować odrębne podtypy w ramach podpopulacji komórek docelowych.
  5. Generuj nowe osadzenia UMAP i wizualizuj klastry podpopulacji z adnotacjami typów komórek, stosując tę samą wcześniej opisaną metodę.

8. Różnicowa analiza ekspresji genów

  1. Zidentyfikuj geny różnicowo ekspresyjne (DEG) pomiędzy grupą modelową ARDS a grupą kontrolną dla każdego podklastra za pomocą metody statystycznej MAST.
  2. Włącz regresję zmiennych utajonych do kontroli efektów głębokości sekwencjonowania podczas testów różnicowych ekspresji.
  3. Filtruj DEG na podstawie zdefiniowanych progów zmien log fold oraz skorygowanych wartości p za pomocą funkcji FindMarkers.
  4. Generuj wykresy wulkanów z funkcją ggplot dla każdego podklastra, aby zwizualizować różnice wzorców ekspresji genów z oznakowaniem istotności.
  5. Eksportuj wyniki DEG i twórz kompleksowe tabele podsumowujące, aby ułatwić wzbogacenie funkcjonalne i inne analizy dalsze.

9. Analiza wzbogacenia

  1. Przypisuj symbole genów do identyfikatorów ENTREZ za pomocą org. Rn.eg.db baza danych adnotacji dla kompatybilności analizy ścieżek.
  2. Połącz DEG ze wszystkich podklastrów i filtruj istotne geny na podstawie progów zmiennych log fałdów oraz skorygowanych wartości p (test sumy rangi Wilcoxona, logfc.threshold = 0,25, p_val < 0,05).
  3. Wykonaj analizę wzbogacenia ontologii genów (GO) z wykorzystaniem funkcji wzbogacenia GO z kategoriami procesów biologicznych, funkcji molekularnych, ontologii komponentów komórkowych oraz metodą korekcji Benjamini-Hochberga.
  4. Przeprowadz analizę wzbogacenia szlaków w Encyklopedii Genów i Genomów w Kioto (KEGG) z wykorzystaniem funkcji wzbogacania KEGG w bazę danych organizmów szczurów oraz zastosuj progi istotności statystycznej.
  5. Generuj wykresy krorowe dla wyników wzbogacania GO i KEGG za pomocą funkcji wykresu punktowego, pokazując 15 najwyżej wzbogaconych składników o stosunkach genów i skorygowanych wartościach p.
  6. Eksportuj wyniki wzbogacania w postaci plików CSV i zapisuj wykresy wizualizacyjne do kompleksowej analizy ścieżek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Barwienie HE tkanki płucnej szczura wykazało wyraźne struktury pęcherzyków z minimalnym stanem zapalnym u kontroli, podczas gdy grupa modelowa ARDS wykazywała zniekształcone jamki pęcherzykowe pęcherzykowe, pogrubione ściany oraz znaczącą infiltrację komórek zapalnych, co wykazują odpowiednie wyniki urazów płuc (Rysunek 1A–E). Podwyższone poziomy IL-6, TNF-α i IL-1β w BALF i surowicy potwierdziły skuteczne modelowanie oraz ogólnoustrojową odpowiedź zapalną (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten przedstawia standaryzowane podejście do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek tkanki płucnej w modelu szczura z zespołem ostrego niedołączenia oddechowego (ARDS). Wyniki te pokazują pomyślne ustanowienie modelu ARDS indukowanego LPS, co potwierdzają badania histopatologiczne, podwyższone wyniki urazów płuc oraz podwyższone poziomy cytokin zapalnych w BALF i surowicy. Analiza transkryptomii pojedynczych komórek ujawniła 21 odrębnych populacji komórek, z zauważalnym wzrostem makrofagów/monocytów, n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować wsparciu ze strony Projektu Poziomego Szpitala Dongzhimen, Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie (HX-DZM-202114).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,4% roztwór Trypan BlueGibco, USA15250061
4% paraformaldehyduServicebio, ChinyG1101
Albumina surowicy bydła (BSA)Sangon Biotech, ChinyA600332-0005
Kolagenaza IYEASEN, Chiny40507ES60
CurveExpertHyams Developmentv1.4
Dispase IIYEASEN, Chiny40104ES60
Escherichia coli lipopolisacharyd (LPS)  Sigma, USAL6511
Barwienie hematoksyliny i eozyny (HE)Solarbio, ChinyG1120
Sekwencjoner genów o wysokiej przepustowości MGI Tech Co., LtdMGISEQ-2000RS
Inhibitor fosfatazyBeyotime Biotechnology, ChinyP1081
Roztwór buforowany fosforanemSolarbio, ChinyP1020
PMSFSolarbio, ChinyR0010
R software Lucent Technologies, USAv4.2.0
rat IL-1β Zestaw ELISA4abio, ChinyCRE0006
zestaw rat IL-6 ELISA4abio, ChinyCRE0005
szczur TNF-α Zestaw ELISA4abio, ChinyCRE0003
Bufor lizy czerwonych krwinek (RBC)Solarbio, ChinyR1010
Bufor lizy czerwonych krwinekTiangen Biotech, ChinyRT122-1
Woda wolna od RNazAmbion, USAAM9937
Bufor TE, pH 8,0Ambion, USAAM9858
Bufor transferowy Tris-GlycineServicebio, ChinyG2017

Bibliografia

  1. Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S. Acute respiratory distress syndrome. Lancet. 398 (10300), 622-637 (2021).
  2. Gragossian, A., Siuba, M. T. Acute respiratory distress syndrome. Emerg Med Clin North Am. 40 (3), 459-472 (2022).
  3. Bos, L. D. J., Ware, L. B. Acute respiratory distress syndrome: causes, pathophysiology, and phenotypes. Lancet. 400 (10358), 1145-1156 (2022).
  4. Huang, Q., Le, Y., Li, S., Bian, Y. Signaling pathways and potential therapeutic targets in acute respiratory distress syndrome (ARDS). Respir Res. 25 (1), 30(2024).
  5. Cutolo, M., Campitiello, R., Gotelli, E., Soldano, S. The role of M1/M2 macrophage polarization in rheumatoid arthritis synovitis. Front Immunol. 13, 867260(2022).
  6. Scozzi, D., Liao, F., Krupnick, A. S., Kreisel, D., Gelman, A. E. The role of neutrophil extracellular traps in acute lung injury. Front Immunol. 13, 953195(2022).
  7. Zheng, J., Li, Y., Kong, X., Guo, J. Exploring immune-related pathogenesis in lung injury: providing new insights into ALI/ARDS. Biomed Pharmacother. 175, 116773(2024).
  8. Qiao, Q., Liu, X., Yang, T., Cui, K., Kong, L., Yang, C., Zhang, Z. Nanomedicine for acute respiratory distress syndrome: The latest application, targeting strategy, and rational design. Acta Pharm Sin B. 11 (10), 3060-3091 (2021).
  9. Bonaventura, A., et al. Endothelial dysfunction and immunothrombosis as key pathogenic mechanisms in COVID-19. Nat Rev Immunol. 21 (5), 319-329 (2021).
  10. Yıldırım, F., Karaman, İ, Kaya, A. Current situation in ARDS in the light of recent studies: classification, epidemiology and pharmacotherapeutics. Tuberk Toraks. 69 (4), 535-546 (2021).
  11. Huminiecki, Ł Bulk and single-cell RNA sequencing elucidate the etiology of severe COVID-19. Int J Mol Sci. 25 (6), 3280(2024).
  12. Riemondy, K. A., et al. Single cell RNA sequencing identifies TGF-β as a key regenerative cue following LPS-induced lung injury. JCI Insight. 5 (8), e123637(2019).
  13. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: a brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
  14. Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. Int J Oral Sci. 13 (1), 36(2021).
  15. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970(2023).
  16. Zhang, F., Wei, K., Slowikowski, K. Defining inflammatory cell states in rheumatoid arthritis joint synovial tissues by integrating single-cell transcriptomics and mass cytometry. Nat Immunol. 20 (7), 928-942 (2019).
  17. Mulder, K., Patel, A. A., Kong, W. T. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaau0964(2019).
  19. Kang, Z. Y., et al. Heterogeneity of immune cells and their communications unveiled by transcriptome profiling in acute inflammatory lung injury. Front Immunol. 15, 1382449(2024).
  20. Wang, H. P., et al. Single-cell transcriptome analysis of the mouse lungs during the injury and recovery periods after lipopolysaccharide administration. Inflamm Res. 73 (12), 2087-2107 (2024).
  21. Yao, C., et al. Cell-type-specific immune dysregulation in severely ill COVID-19 patients. Cell Rep. 34 (1), 108590(2021).
  22. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970(2023).
  23. Su, M., et al. Data analysis guidelines for single-cell RNA-seq in biomedical studies and clinical applications. Mil Med Res. 9 (1), 68(2022).
  24. Yang, Q., et al. The interaction of macrophages and CD8 T cells in bronchoalveolar lavage fluid is associated with latent tuberculosis infection. Emerg Microbes Infect. 12 (2), 2239940(2023).
  25. Zheng, L., et al. Single-cell transcriptome sequencing reveals the immune microenvironment in bronchoalveolar lavage fluid of checkpoint inhibitor-related pneumonitis. Cancer Immunol Immunother. 74 (4), 128-145 (2025).
  26. Shi, X. Y. Single-cell transcriptomic analysis of radiation-induced lung injury in rat. Biomol Biomed. 24 (5), 1331-1349 (2024).
  27. Huang, H., et al. Single-cell RNA sequencing uncovered the involvement of an endothelial subset in neutrophil recruitment in chemically induced rat pulmonary inflammation. Int J Med Sci. 19 (4), 669-680 (2022).
  28. Kosaka, J., et al. Effects of biliverdin administration on acute lung injury induced by hemorrhagic shock and resuscitation in rats. PLoS One. 8 (5), e63606(2013).
  29. Hassan, N. H., El-Wafaey, D. I. Histopathological scoring system role in evaluation of electronic cigarette's impact on respiratory pathway in albino rat: Biochemical, histo-morphometric and ultrastructural study. Tissue Cell. 79, 101945(2022).
  30. Wang, P., et al. Single-cell suspension preparation from Nile Tilapia intestine for single-cell sequencing. J Vis Exp. (192), e64321(2023).
  31. Wang, F., et al. Integrating bulk and single-cell sequencing reveals the phenotype-associated cell subpopulations in sepsis-induced acute lung injury. Front Immunol. 13, 981784(2022).
  32. Zi, S. F., et al. Endothelial cell-derived extracellular vesicles promote aberrant neutrophil trafficking and subsequent remote lung injury. Adv Sci Weinh. 11 (38), e2400647(2024).
  33. Zi, S. F., Wu, X. J., Tang, Y., Liang, Y. P. Endothelial cell-derived extracellular vesicles promote aberrant neutrophil trafficking and subsequent remote lung injury. Adv Sci Weinh. 11 (38), e2400647(2024).
  34. Hurskainen, M., et al. Single cell transcriptomic analysis of murine lung development on hyperoxia-induced damage. Nat Commun. 12 (1), 1565(2021).
  35. Zhou, X., Zhang, C., Yang, S. Macrophage-derived MMP12 promotes fibrosis through sustained damage to endothelial cells. J Hazard Mater. 461, 132733(2024).
  36. Zhao, C. Q., et al. Heterogeneity of T cells and macrophages in chlorine-induced acute lung injury in mice using single-cell RNA sequencing. Inhal Toxicol. 34 (13-14), 399-411 (2022).
  37. Liu, D., Zhang, Y., Bai, B., Xiong, X. Integration of single-cell RNA sequencing and network pharmacology to elucidate the effect of Yantiao Formula on alleviating ALI by regulating the polarization of alveolar macrophages. J Ethnopharmacol. 343, 119436(2025).
  38. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1826299(2022).
  39. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong Recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  40. Dun, Y., et al. PTTG1 promotes CD34+CD45+ cells to repair the pulmonary vascular barrier via activating the VEGF-bFGF/PI3K/AKT/eNOS signaling pathway in rats with phosgene-induced acute lung injury. Biomed Pharmacother. 162, 114654(2023).
  41. Liu, Z., Wei, J., Sun, H., Xu, L. Plumbagin ameliorates LPS-induced acute lung injury by regulating PI3K/AKT/mTOR and Keap1-Nrf2/HO-1 signalling pathways. J Cell Mol Med. 28 (13), e18386(2024).
  42. Guo, Y., Zhang, H., Lv, Z., Du, Y. Up-regulated CD38 by daphnetin alleviates lipopolysaccharide-induced lung injury via inhibiting MAPK/NF-κB/NLRP3 pathway. Cell Commun Signal. 21 (1), 66(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model ARDS u szczuradysocjacja tkanekkontrola jako cikorekcja efektu seriiklastrowanie kom rekr nicowa ekspresja gen wszlaki zapalne

Powiązane artykuły