Artykuł metodologiczny

Ocena sferoidów 3D w badaniach nad transdukcją AAV

81 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70517

⸱

14 sierpnia 2026

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

W tym artykule

Podsumowanie

Trójwymiarowe systemy hodowli sferoidów stanowią udoskonalenie konwencjonalnych modeli 2D w rozwoju terapii genowej z wykorzystaniem AAV. Metodologia ta umożliwia czułą detekcję transdukcji AAV przy niskich dawkach, zwiększoną istotność fizjologiczną oraz stabilne monitorowanie długoterminowe. Platforma ta wspiera ocenę potencji, wysokoprzepustowy screening oraz optymalizację wektorów w różnych liniach komórkowych i serotypach AAV.

Streszczenie

Wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV) są silnymi wektorami stosowanymi do dostarczania genów w produktach terapii genowej. Ich opracowanie wymaga systemów in vitro , które potrafią wiarygodnie wykrywać różnice w konstrukcji wektora, wydajności serotypów, sile elementów regulacyjnych oraz kinetyce ekspresji. Systemy te muszą również wspierać takie zastosowania, jak ocena potencji i optymalizacja wektorów. W niniejszej pracy opisujemy usprawnioną trójwymiarową platformę sferoidalną, zoptymalizowaną pod kątem oceny potencji AAV, kinetyki ekspresji transgenu oraz wydajności transdukcji specyficznej dla serotypu w różnych liniach komórkowych. Jednorodne sferoidy są generowane z wykorzystaniem płytek o ultra-niskiej adhezji i utrzymywane w warunkach zapewniających stabilną architekturę oraz długoterminowe obrazowanie. Po transdukcji AAV odczyty fluorescencyjne lub luminescencyjne są monitorowane w czasie rzeczywistym przy użyciu systemów obrazowania żywych komórek. Umożliwia to ilościową ocenę sygnału raportującego, odpowiedzi na dawkę, aktywności elementów regulacyjnych oraz czasu wystąpienia efektu poprzez ciągłe obrazowanie kinetyczne. Platforma ta skutecznie rozróżnia silne i słabe konstrukcje genomu wektora, a także poszczególne serotypy AAV. Metoda ta wykazuje wysoką wydajność zarówno w liniach komórkowych wolno, jak i szybko dzielących się. Wyniki te potwierdzają jej przydatność jako skalowalnego i fizjologicznie istotnego systemu do przedklinicznej oceny i rozwoju terapii genowych.

Wprowadzenie

Wektory AAV stały się jednym z preferowanych systemów dostarczania genów do zastosowań in vivo ze względu na ich profil bezpieczeństwa oraz zdolność do zapewnienia trwałej ekspresji genów1. Terapia genowa z użyciem AAV odnosi sukcesy w leczeniu wielu rzadkich schorzeń, a w procesie rozwoju znajduje się setki produktów2. Ponadto nowe zastosowania obejmują dostarczanie in vivo komponentów do edycji genomu, takich jak Cas9, co daje ogromny potencjał w leczeniu wskazań trudnych do terapeutycznego opanowania3. Kluczowe wyzwania rozwojowe obejmują wysokie koszty produkcji oraz ograniczoną zdolność prognostyczną obecnych testów in vitro w określaniu jakości produktu i skuteczności klinicznej4.

Postęp w terapii z wykorzystaniem AAV jest zasadniczo ograniczony przez brak predykcyjnych, zestandaryzowanych testów aktywności, które mogłyby dokładnie przewidzieć wyniki kliniczne4,5. Testy te stanowią krytyczny element procesu rozwoju, ponieważ są wykorzystywane w wielu celach, w tym do przesiewania bibliotek zmodyfikowanych wektorów, optymalizacji modyfikacji kapsydów w celu poprawy celowania oraz oceny tropizmu specyficznego dla tkanek. Służą one również do charakterystyki wpływu sekwencji regulacyjnych na ekspresję transgenu6. Poza wyborem kandydatów, testy transdukcji AAV wspierają również kluczową kontrolę jakości produkcji poprzez testy potencji stosowane podczas uwalniania partii, badań porównawczych partii oraz ocen stabilności6,7.

Wyzwanie naukowe polega na opracowaniu testów, które oddają złożoność interakcji między wektorem a gospodarzem, zachowując jednocześnie praktyczną wykonalność w rutynowym zastosowaniu7,8. Obecne podejścia obejmują wykorzystanie unieśmiertelnionych linii komórkowych reprezentujących organ docelowy w tradycyjnych dwuwymiarowych (2D) kulturach monowarstwowych. Warunki hodowlane te nie posiadają odpowiedniej istotności fizjologicznej i wymagają stosowania wysokich dawek leków. Tworzy to znaczną lukę między przewidywaniami laboratoryjnymi a możliwością przełożenia wyników na praktykę kliniczną. Nowoczesne, modyfikowane linie komórkowe, takie jak systemy z nadekspresją AAVR lub aktywowane za pomocą CRISPR, stanowią istotny postęp, lecz nie odtwarzają trójwymiarowej architektury oraz interakcji z macierzą pozakomórkową charakterystycznych dla tkanek natywnych9,10,11. Modele następnej generacji, które lepiej symulują mikrośrodowiska in vivo, mogłyby zniwelować tę lukę translacyjną12,13,14.

Opracowaliśmy niedawno system sferoid 3D zoptymalizowany pod kątem transdukcji AAV, aby poprawić translacyjność testów transdukcji AAV. System ten znacząco zwiększa wydajność transdukcji AAV w wielu liniach komórkowych i serotypach AAV w porównaniu do standardowych testów 2D. Oprócz poprawionej czułości i mniejszego zużycia produktu wykorzystywanego w analizie, modele te stanowią udoskonalenie względem monowarstw 2D, zapewniając realistyczne oddziaływania międzykomórkowe, które zmieniają się w zależności od lokalizacji komórki w obrębie sferoidy. Umożliwiają one również rzetelne badanie przenikania leków, które symuluje rzeczywiste warunki w organach11,15,16. Co więcej, podejście wykorzystujące sferoidy oferuje praktyczne zalety w stosunku do bardziej złożonych systemów organoidów lub kokultur, ponieważ wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i nie wymaga specjalistycznych pożywek ani rusztowań. Ta prostota zapewnia powtarzalność i skalowalność, dzięki czemu system jest odpowiedni do rutynowych testów terapii genowej i procesów opracowywania wektorów17.

Ta platforma sferoidów 3D jest szczególnie odpowiednia do zastosowań wymagających czułej detekcji transdukcji AAV przy niskich dawkach oraz porównawczej oceny projektów genomów wektorowych. Wspiera ona również ocenę tropizmu zależnego od serotypu. Jest ona szczególnie korzystna dla linii komórkowych o stosunkowo niskiej wydajności transdukcji, które wymagają wysokich dawek AAV w konwencjonalnych kulturach 2D. W takich kontekstach zwiększona czułość i lepsza relewancja fizjologiczna platformy 3D mają krytyczne znaczenie. Jednak system ten może być mniej odpowiedni dla badań wymagających komponentów odpornościowych, dostarczania naczyniowego lub pełnej złożoności tkankowej. Wynika to z faktu, że sferoidy nie odtwarzają w pełni środowiska in vivo .

Przedstawiamy zatem prosty protokół tworzenia sferoid 3D zoptymalizowany pod kątem testów transdukcji AAV, z dwoma krytycznymi i komplementarnymi parametrami pomiarowymi: wydajnością transdukcji (zdefiniowaną tutaj jako całkowity sygnał reportera na sferoidę) oraz kinetyką transdukcji. Metoda ta stanowi efektywną kosztowo, fizjologicznie istotną i informacyjną platformę do oceny potencjału AAV, projektowania wektorów oraz testów neutralizacji.

Protokół

W badaniu tym wykorzystano uznane ludzkie linie komórkowe (HEK293T, HeLa, Huh7, HEP3B, HEPG2 oraz A375) pozyskane z komercyjnych źródeł lub źródeł opisanych w poprzednich publikacjach. Nie wykorzystano próbek pierwotnych od ludzi ani zwierząt, w związku z czym nie było wymagane uzyskanie zgody komisji etycznej.

1. Sterylne przygotowanie stanowiska doświadczalnego i wstępne przygotowanie dygestorium

  1. Uruchom komorę bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Włącz komorę bezpieczeństwa mikrobiologicznego z laminarnym przepływem powietrza klasy II na 15 min przed rozpoczęciem pracy, aby zapewnić odpowiedni czas na stabilizację przepływu powietrza.
  3. Spryskaj wszystkie wewnętrzne powierzchnie komory 70% (v/v) etanolem.
  4. Przygotuj w 500 mL zlewce szklanej 5% (v/v) roztwór odkażający z wybielacza do utylizacji supernatantu komórkowego i szczątków komórkowych.
  5. Wyczyść sprzęt, dokładnie odkażając wszystkie mikropipety i pudełka z końcówkami przy użyciu 70% (v/v) etanolu.

2. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowej

  1. Przygotować 500 mL podstawowej pożywki DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) z wysoką zawartością glukozy.
  2. Uzupełnić pożywkę podstawową o 10 mL inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1 mL roztworu penicyliny/streptomycyny (100 jednostek/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny) oraz 5 mL 2 mM L-glutaminy.
    UWAGA: Podczas wszystkich procedur należy zachować zasady aseptyki. Dla każdego eksperymentu wymagane jest przygotowanie świeżej pożywki. Szczegółowe specyfikacje sprzętowe znajdują się w Tabeli materiałów.

3. Przygotowanie sferoidów

  1. Przygotować kompletną pożywkę DMEM zgodnie z powyższym opisem.
  2. Podgrzewać pożywkę hodowlaną w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 10–15 min.
  3. Wyjąć interesujące linie komórkowe z pojemnika z ciekłym azotem.
  4. Szybko rozmrozić kriokonserwowane komórki HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 i HeLa, umieszczając je w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
  5. Natychmiast wyjąć z kąpieli wodnej w momencie rozpuszczenia ostatniego kryształku lodu.
  6. Rozcieńczyć 1 mL rozmrożonych komórek w 9 mL kompletnej pożywki DMEM.
    UWAGA: Wszystkie linie komórkowe użyte w tym protokole są utrzymywane w tej samej pożywce DMEM i w tych samych warunkach hodowli.
  7. Wirować komórki przy 350 × g. przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  8. Odlać supernatant.
  9. Resuspender osad w 5 mL kompletnej pożywki DMEM.
  10. Zasiać komórki do kolby hodowlanej T75.
  11. Umieścić zasiane kolby w inkubatorze do hodowli komórkowych utrzymywanym w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 95% wilgotności.

4. Monitorowanie wzrostu komórek

  1. Co 3 dni dodawać 15 mL pożywki hodowlanej.
  2. Pasażować komórki HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 oraz HeLa po osiągnięciu przez nie 70% konfluencji; odessać kompletną pożywkę DMEM z kolb T75. 
  3. Przemyć komórki, dodając 5 mL PBS do kolb T75 zawierających komórki. 
  4. Odessać 5 mL PBS po 30 s od dodania do kolb T75. 
  5. Powtórzyć ten etap płukania jeszcze raz.  
  6. Poddać komórki trypsynizacji, dodając 5 mL 0,05% trypsyny-EDTA na 5 min. 
  7. Inkubować kolby w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 5 min, aby zapewnić całkowite odłączenie się komórek.  
  8. Dodać 5 mL kompletnej pożywki DMEM w celu neutralizacji trypsyny. 
  9. Odwirować komórki przy 350 × g przez 5 min, aby usunąć trypsynę. 
  10. Resuspendować osad komórkowy w 5 mL DMEM. 
  11. Rozdzielić komórki w rozcieńczeniu 1:10 podczas rutynowego pasażowania. 
    UWAGA: Zaleca się dwukrotne pasażowanie komórek przed przeprowadzeniem eksperymentów, aby umożliwić im wejście w fazę logarytmiczną i osiągnięcie aktywności metabolicznej. 
  12. Kontynuować inkubację w tych kontrolowanych warunkach, aż komórki osiągną 70% konfluencji, a następnie przejść do kolejnych procedur eksperymentalnych.
    UWAGA: Należy regularnie monitorować morfologię i wzorce wzrostu komórek. Należy zapewnić prawidłowe ustawienie kolb w celu optymalnej wymiany gazowej. Przez cały okres inkubacji niezbędne jest zachowanie warunków sterylnych.

5. Zbieranie komórek i wstępne przygotowanie komórek

  1. Usuń pożywkę hodowlaną, aspirując istniejącą pożywkę z kolbek T75.
  2. Przemyj komórki HEK293T, Huh7, HEP3B, A375,  HEPG2 i HeLa 3 razy za pomocą PBS, aby usunąć resztki pożywki i zanieczyszczenia.
  3. Dodaj 5 mL uprzednio ogrzanej roztworu trypsyny 1× do komórek, aby odlepić komórki adherentne od powierzchni kolbek.
    UWAGA: Upewnij się, że trypsyna została uprzednio ogrzana, aby zachować optymalną aktywność enzymatyczną. Umieść kolbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 min, aby umożliwić całkowite odlepienie komórek. Ściśle monitoruj czas trypsynizacji, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu.
  4. Dodaj 5 mL pełnej pożywki hodowlanej, aby inaktywować enzym trypsynę.
  5. Pipetuj mieszaninę w górę i w dół, aby uhomogenizować roztwór.
  6. Zbierz każdą zawiesinę komórkową, przenosząc całą zawiesinę do osobno oznakowanych probówek do wirowania.
    UWAGA: Podczas resuspensji należy obchodzić się z komórkami delikatnie, aby zachować ich żywotność.
  7. Odwirowuj komórki przy 350 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.
  8. Odlej nadsącz i delikatnie resuspenduj osad komórkowy w 5 mL świeżej pożywki hodowlanej.

6. Liczenie komórek i ocena żywotności przy użyciu licznika komórek

  1. Ujednorodnić zawiesinę, delikatnie pipetując ją w górę i w dół, aby zapewnić równomierny rozkład komórek w całej probówce do wirowania.
  2. Przygotować probówki do liczenia dla komórek HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 oraz HeLa.
  3. Przygotować 1:10 rozcieńczenie próbki w pełnym podłożu hodowlanym DMEM. Na przykład 40 µL zawiesiny komórkowej dodać do 360 µL pełnego podłoża DMEM.
  4. Delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół cztery razy, aby zapewnić homogeniczne rozcieńczenie.
  5. Opisać próbkę w rejestrze, przypisując użyty typ komórek, rozcieńczenie i nazwę próbki.
  6. Wprowadzić próbkę do licznika komórek i umieścić probówkę zawierającą rozcieńczoną zawiesinę komórkową w przypisanym numerze.
    UWAGA: Licznik komórek to zautomatyzowane urządzenie, które aspiruje próbki komórkowe i miesza je z błękitem trypanu, co redukuje zmienność zależną od operatora.
  7. Pozostawić zawiesinę komórkową na 1 min przed przystąpieniem do liczenia próbki.
  8. Przed liczeniem równomiernie resuspenderć komórki, aby uzyskać dokładne wyniki.
  9. Obliczyć całkowitą liczbę komórek.
  10. Wykorzystać całkowite stężenie żywych komórek do określenia liczby komórek do wysiania w eksperymentach.
  11. Użyć żywych komórek o żywotności > 90%.
  12. Odróżnić komórki żywe (niezbarwione) od komórek martwych (zbarwionych na niebiesko).
    UWAGA: Należy zachować spójne kryteria liczenia dla wszystkich próbek.

7. Wysiew sferoidów i optymalizacja rozmiaru

  1. Wielokrotnie pipetuj zawiesinę komórkową, aby uhomogenizować roztwór.
  2. Zasiać komórki HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2 lub HeLa o różnych gęstościach.
  3. Zacznij od zasiania 1 x 104 komórek w 200 µL w 96-dołkowej płytce o okrągłym dnie i ultra-niskiej adhezji (ULA).
  4. Wykonaj rozcieńczenia seryjne z 1 x 104 komórek / dołek, stosując dwukrotne rozcieńczenia, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości komórek dla eksperymentów.
  5. Dodaj 1 objętość pełnej pożywki do wszystkich rzędów (1B-1H), z wyjątkiem górnego rzędu.
  6. Dodaj 2 objętości 1 x 104 komórek / dołek w rzędzie 1A (górny rząd).
  7. Wykonaj rozcieńczenia seryjne rzędu 1A, dodając 1 objętość z rzędu 1A do 1B i tak dalej. Przykład układu eksperymentalnego znajduje się poniżej w Supplementary Figure 1.
    UWAGA: Aby zapewnić równomierne resuspensowanie, delikatnie postukaj w boki płytki.
  8. Wirować płytkę ULA w wirówce przy 350 × g przez 5 min, aby skupić komórki w centrum i promować kontakt międzykomórkowy.
    UWAGA: W przypadku stosowania innych linii komórkowych niż wymienione tutaj, może być konieczna optymalizacja parametrów, ponieważ różne linie wykazują różne tempo wzrostu i tworzenia sferoidów.
  9. Unikać niepokojenia płytek przez pierwsze 24–48 h, aby umożliwić początkowe tworzenie sferoidów. Pozostawić sferoidy do dojrzewania przez 3 dni, aż osiągną średnicę ok. 400 µm.
  10. Sprawdzić jednolitość rozmiaru sferoidów. Upewnić się, że komórki zostały resuspensowane jednorodnie i że płytki nie są odkształcone.
    Uwaga: Nie używać płytek z sferoidami o niespójnych rozmiarach. Upewnić się, że sferoidy w każdym dołku mają względnie jednolitą średnicę.
  11. Monitorować morfologię sferoidów.
    Uwaga: Prawidłowo uformowane sferoidy mają kształt okrągły z wyraźnymi krawędziami.
  12. Przygotować dojrzałe sferoidy wykazujące silną adhezję międzykomórkową, a nie luźne agregaty komórkowe.
  13. Zwiększyć gęstość siewu lub wydłużyć czas formowania. Jeśli sferoidy nie są zwarte, należy zwiększyć gęstość siewu lub wydłużyć czas formowania.
  14. Zminimalizować liczbę wielu małych agregatów poprzez zmniejszenie gęstości siewu lub wydłużenie etapu wirowania.

8. Monitorowanie sferoidów w czasie rzeczywistym na żywych komórkach

  1. Po odwirowaniu zawiesin komórkowych przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C (5% CO2, 95% wilgotności), w którym znajduje się urządzenie do obrazowania żywych komórek, w celu zautomatyzowanego obrazowania.
  2. Ustaw parametry obrazowania żywych sferoidów zgodnie z wymaganiami eksperymentu:
    UWAGA: Poniższe parametry zastosowano dla wszystkich badanych linii komórkowych.
  3. Zaloguj się do oprogramowania akwizycyjnego.
  4. Wybierz następujące polecenia:|Schedule To Acquire | Launch Add Vessel | Scan On Schedule | Create Vessel: New.
  5. |Select Scan Type|: Spheroid. |Select the channels of interest|: Fazowy + Brightfield (do monitorowania wzrostu sferoidów), Green/Red (do monitorowania transdukcji AAV, czas akwizycji odpowiednio 300 ms lub 400 ms).
  6. Wybierz pożądane powiększenie: 10x.
  7. Wybierz model płytki oraz jej pozycję w wysuwie.
  8. Wybierz pozycję studni do obrazowania oraz liczbę obrazów wymaganych dla każdej studni.
  9. Wprowadź opis eksperymentu: nazwę, typ komórek, liczbę komórek.
  10. W ustawieniach analizy wybierz Defer Analysis Until Later.
  11. Kliknij prawym przyciskiem myszy na osi czasu i wybierz opcję Set Selected Scan Group Interval.
  12. Ustaw skanowanie co 6 h i skanowanie w trybie ciągłym. Ustaw pożądany czas rozpoczęcia (co najmniej 1 h po inkubacji w zautomatyzowanym urządzeniu do obrazowania).
  13. Codziennie sprawdzaj wzrost sferoidów, logując się do oprogramowania do obrazowania.
  14. Wybierz opcję View Recent Scans i dwukrotnie kliknij wybrany eksperyment. |Wybierz Brightfield w panelu kanałów obrazowania| , a następnie użyj narzędzia |Measure image| w sekcji features , aby zmierzyć średnicę sferoidów.
    UWAGA: Aby uzyskać kompaktowe sferoidy z badanych komórek, może być konieczne zoptymalizowanie czasu dojrzewania.
  15. Wyjmij płytkę w dniu optymalnego uformowania sferoidów i wykorzystaj ją do transdukcji AAV.

9. Transdukcja AAV

  1. Należy zakupić lub wytworzyć serotypy AAV3 oraz interesujące transgeny.
  2. Przygotować pożywkę DMEM uzupełnioną 2% FBS do transdukcji AAV, dodając 10 mL FBS do 490 mL pożywki DMEM.
    UWAGA: Do przesiewania kapsydów lub genomowych elementów regulacyjnych bardzo skuteczny jest transgen GFP, co wykazano w sekcji z reprezentatywnymi wynikami. Należy rozcieńczyć wybrany AAV w pożywce DMEM uzupełnionej 2% FBS, bez dodatku antybiotyków.
  3. Rozcieńczać w odpowiedniej okrągłej płytce 96-dołkowej do rozcieńczeń seryjnych.
  4. Przygotować rozcieńczenia 1:10, zaczynając od początkowego MOI, aby miareczkować AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 i AAV9.
  5. Przykładowy układ eksperymentalny przedstawiono poniżej na Ryc. uzupełniającej 2. Obliczyć MOI niezbędne do transdukcji AAV, zgodnie z opisem w sekcji Dyskusja.
  6. Dodać 33 µL roztworu zapasowego AAV do 297 µL pożywki, aby otrzymać łącznie 330 µL o MOI 1 × 106.
  7. Wykonać 10-krotne rozcieńczenia seryjne, zaczynając od MOI 1 × 106, poprzez dodanie 33 µL do 297 µL pożywki DMEM uzupełnionej 2% FBS.
    UWAGA: Zaleca się unikanie wysokich wartości MOI, aby zapobiec zmniejszeniu żywotności komórek. Dla każdego typu komórek i serotypu AAV może być konieczna optymalizacja warunków eksperymentalnych, ponieważ mogą one znacząco wpływać na optymalne MOI. Nie wszystkie genomy wirusowe są zakaźne; miana funkcjonalne mogą różnić się od wartości vg/mL.

10. Dawkowanie AAV

  1. Odssać całe medium z wcześniej przygotowanej płytki ze sferoidami za pomocą pipety wielokanałowej.
  2. Dodać 100 µL pożądanej MOI, przenosząc tę objętość z płytki z rozcieńczeniami do płytki z próbami za pomocą pipety wielokanałowej.
  3. Umieścić płytki z powrotem w urządzeniu do obrazowania i rozpocząć monitorowanie transdukcji poprzez śledzenie intensywności fluorescencji zielonej przez 72 h.
  4. Jeśli monitorowanie trwa dłużej niż 3 dni, co 3 dni dodawać 100 µL pełnego medium DMEM na studzienkę w celu uzupełnienia składników odżywczych.

11. Obrazowanie żywych komórek, monitorowanie transdukcji i analiza danych

  1. Umieść płytkę z powrotem w urządzeniu po dodaniu odpowiedniego AAV i MOI do grupy badawczej.
  2. Rozpocznij rejestrację wydajności transdukcji co 6 h.
    UWAGA: Osiągnięcie optymalnej ekspresji GFP zajmuje zazwyczaj od 3 do 5 dni. Zależy to od zastosowanego promotora i konfiguracji genomu.
  3. Przeanalizuj dane, tworząc definicję analizy specyficzną dla badanych komórek i genów reporterowych.
    UWAGA: Alternatywnie można przechowywać płytkę w standardowym inkubatorze w temperaturze 37 °C i oceniać wydajność transdukcji za pomocą qPCR, western blotting lub testu ELISA.
  4. Zdefiniuj parametry analizy, wykonując analizę w polu jasnym (Brightfield Analysis) w celu detekcji głównych sferoidów.
  5. Zoptymalizuj parametry segmentacji w następujący sposób:
    1. Typ analizy: "Spheroid Brightfield."
    2. Metoda segmentacji: "Adaptive Threshold."
    3. Zakres progu: 0.3–0.8 (początkowo zalecana automatyczna regulacja)
    4. Filtr Top-hat: 200–500 µm (usuwa nierównomierne oświetlenie)
  6. Zoptymalizuj parametry pola jasnego w następujący sposób:
    1. Wczytaj reprezentatywne obrazy z różnych punktów czasowych.
    2. Przetestuj zakres progu (0.2–0.9), aby znaleźć optymalną detekcję.
    3. Dostosuj filtry wielkości na podstawie oczekiwanego zakresu wielkości sferoidów.
    4. Zwaliduj segmentację poprzez wizualną inspekcję nałożonych masek.
  7. Zoptymalizuj kanał zielony dla oceny transdukcji AAV w następujący sposób:
    1. Określ poziomy tła w niepoddanych działaniu wirusa studzienkach (MOI=0).
    2. Ustaw próg na poziomie 2–3× powyżej szumu tła.
    3. Przeprowadź test na próbce poddanej działaniu najwyższego MOI.
  8. Zoptymalizuj czas ekspozycji , aby uniknąć nasycenia, zachowując jednocześnie sygnał
    UWAGA: W przypadku transdukcji AAV jako miarę wydajności transdukcji przyjmij całkowity sygnał fluorescencji na sferoid.

12. Analiza danych

  1. Wybierz odpowiednie parametry, dostosowując filtry i maski w taki sposób, aby zaznaczyć komórki na obrazie, a nie szum tła.
  2. Wybierz reprezentatywny obraz do przeszkolenia oprogramowania.
  3. Zastosuj zoptymalizowane parametry do wszystkich obrazów w badaniu.
  4. Wyeksportuj dane jako wartości indywidualne lub zgrupowane i przenieś je do systemu analizy statystycznej w celu dalszej prezentacji danych.

13. Obliczanie czasu wystąpienia

  1. Obliczyć czas potrzebny na wykrycie pierwszego sygnału GFP dla każdego MOI.
  2. Przeprowadzić interpolację na poziomie średniej z nieleczonych studni (MOI = 0) + 3 odchylenia standardowe (SD).
  3. Skopiować intensywność zielonej fluorescencji każdego sferoidu w każdym punkcie czasowym z oprogramowania do obrazowania żywych komórek do oprogramowania statystycznego.
  4. Wyznaczyć średnią z powtórzeń.
  5. Obliczyć średnią i SD sygnałów dla wszystkich studni z nieleczonymi sferoidami (MOI = 0).
  6. Użyć dopasowania krzywej asymetrycznej sigmoidalnej 5PL do interpolacji czasu rozpoczęcia dla każdego MOI.
  7. Na przykład w Tabeli 1 zastosowano następujące wartości interpolacji:
    1. Dla scGFP: 254,955 (średnia) + 3 × 288,055 (SD) = 1,412,120 (sygnał interpolacyjny)
    2. Dla ssGFP: 2,417,941 (średnia) + 3 × 26,093  (SD) =  3,200,746 (sygnał interpolacyjny)

14. Pomiar fluorescencji za pomocą czytnika płytek z funkcją detekcji fluorescencji.

  1. Uruchom oprogramowanie czytnika płytek fluorescencyjnych na komputerze podłączonym do czytnika.
  2. Nawiguj Proszę podać tekst źródłowy w języku angielskim, który mam przetłumaczyć na język polski. Plik > Otwórz Protokół; należy wybrać typ płytki (np. 96-dołkową, 384-dołkową) i upewnić się, że wybrano właściwy układ dołków. 
  3. Ustaw czas integracji dla detekcji fluorescencji, który określa, jak długo czytnik zbiera sygnał fluorescencyjny z każdej studzienki.
  4. Dostosować Wprowadź tekst do tłumaczenia. wzmocnienie lub czułość ustawienia
    jeśli ten / ta / to analiza wymaga wyższy lub niższy sygnał wykrywanie
  5. Ustaw parametry fluorescencji dla GFP w następujący sposób: wzbudzenie: 485 nm i emisja: 528 nm.
  6. Kliknij Run w oprogramowaniu, aby rozpocząć pomiar.
  7. Pomiar fluorescencja z każdy studnia
    UWAGA – Po zakończeniu pomiaru oprogramowanie wyświetla surowe wartości fluorescencji, które mogą posłużyć do wygenerowania wykresów poprzez obliczenie średnich i odjęcie tła.
  8. Eksport wyniki w the preferowany format dla dalej analiza lub sprawozdawczość
    UWAGA: Jeśli zmodyfikowano protokół próbki, należy użyć Pliku > Użyj funkcji „Zapisz jako”, aby utworzyć osobną wersję, zachowując oryginał do późniejszego wykorzystania.

15. Transdukcja luminescencyjnego transgenu

  1. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem wysiewania i dawkowania AAV, który opisano powyżej.
  2. Do 100 µL sferoidów HeLa, wyhodowanych już na płytkach ULA, dodaj 100µL wektorów AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 oraz AAV9 niosących transgen nanolucyferazy z różnymi MOI w zakresie od 0–106.
  3. Inkubuj płytki w standardowym inkubatorze w temperaturze 37 °C i oceń wydajność transdukcji po 3 dniach od przeprowadzenia transdukcji.

16. Przygotowanie zewnątrzkomórkowego inhibitora luminescencji oraz substratu luminescencyjnego do detekcji w badaniu żywych komórek

  1. Wyjmij płytki analityczne z inkubatora w 3. dniu (punkt końcowy).
  2. Dodaj inhibitor luminescencji zewnątrzkomórkowej oraz substrat bezpośrednio do komórek.
    UWAGA: Nie ma potrzeby usuwania pożywki.
  3. Wyjmij inhibitor zewnątrzkomórkowy z przechowywania w −20 °C i pozwól mu rozmrozić się w temperaturze pokojowej.
  4. Odwiruj krótko, aby zebrać ciecz z zakrętki i ścianek probówki.
  5. Przygotuj żądaną ilość zrekonstytuowanego 15X inhibitora luminescencji zewnątrzkomórkowej, łącząc 1 objętość inhibitora zewnątrzkomórkowego z 14 objętościami pełnej pożywki DMEM.
    1. Na przykład, jeśli eksperyment wymaga 1,0 mL odczynnika, dodaj 67 µL inhibitora do 933 µL DMEM. Dla 1 płytki przygotuj 1 mL DMEM i dodaj 67 µL inhibitora.
  6. Przenieś przygotowany inhibitor z kroku 16.5 do sterylnego dozownika na odczynniki.
  7. Użyj pipety wielokanałowej, aby nanieść 10 µL inhibitora do studni poddanych transdukcji AAV.
  8. Wyjmij substrat do żywych komórek (Live Cell Substrate) z przechowywania w −20°C i wymieszaj.
  9. Odwiruj krótko, aby zebrać ciecz z zakrętki i ścianek probówki.
  10. Przygotuj żądaną ilość zrekonstytuowanego 3,6X odczynnika do żywych komórek.
  11. Dla 1 płytki przygotuj 4 mL DMEM i dodaj 144 µL substratu.
  12. Przenieś przygotowany substrat z kroku 16.11 do sterylnego dozownika na odczynniki.
  13. Użyj pipety wielokanałowej, aby nanieść 50 µL substratu do tych samych studni poddanych transdukcji AAV.
    UWAGA: Objętość odczynników może wymagać korekty w przypadku jednoczesnego analizowania wielu płytek.
  14. Wstrząsaj płytką przy 300 rpm przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  15. Odczytaj płytkę za pomocą systemu obrazowania in vivo w ciągu 2 h od dodania odczynników do detekcji luminescencji.
    UWAGA: Intensywność luminescencji będzie stopniowo spadać w ciągu 2 h.

17. Obrazowanie bioluminescencyjne

  1. Włącz system obrazowania bioluminescencyjnego co najmniej 30 min przed obrazowaniem, aby kamera CCD mogła się schłodzić (−90 °C).
  2. Upewnij się, że płytki są przygotowane do obrazowania (np. dodano podłoże do obrazowania żywych komórek dla odczytu bioluminescencji).
  3. Zdejmij pokrywę płytki, aby uniknąć odbicia i rozproszenia światła.
  4. Oczyść spód płytki, jeśli obrazowanie odbywa się od dołu.
  5. Umieść płytkę w komorze obrazującej na stole.
  6. Ustaw płytkę centralnie pod kamerą.
  7. Ustaw parametry obrazowania dla luminescencji: automatyczna ekspozycja lub ustaw czas ekspozycji (zazwyczaj 1–60 s), binning (zalecany średni), przysłona f/stop (1 dla maksymalnej czułości).
  8. Wykonaj zdjęcie do referencji anatomicznej.
  9. Przechwyć obraz luminescencyjny.

18. Analiza danych obrazowania bioluminescencyjnego

  1. Użyj narzędzi ROI do zaznaczenia okrągłymi obszarami studni lub interesujących regionów.
  2. Zapewnij spójny rozmiar ROI dla wszystkich próbek w celu umożliwienia porównania.
  3. Zmierz całkowity strumień (fotony/sekundę) dla bioluminescencji.
  4. Zmierz wydajność promieniowania.
  5. Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia analizy statystycznej.
  6. Zapisz pliki obrazów oraz wyniki analizy.
  7. Wyeksportuj obrazy w formacie TIFF lub JPEG do prezentacji.

Wyniki

W niniejszej pracy wykazujemy, że sferoidy 3D mogą służyć jako narzędzie do oceny transdukcji AAV, rozróżniania projektów genomów wektora, takich jak samouzupełniające (sc) i jednoniciowe (ss), oraz oceny kinetyki transdukcji. Przegląd całego procesu przedstawiono na Ryc. 1. W skrócie, komórki są najpierw namnażane w hodowlach 2D, a następnie wysiewane na płytki o ultra-niskim przywieraniu (ULA) w celu utworzenia zwartych sferoidów (Ryc. 1A). Następnie płytki są wirowane w celu promowania agregacji (Ryc. 1B) i przenoszone do systemu obrazowania żywych komórek w celu monitorowania tworzenia sferoidów w czasie rzeczywistym (Ryc. 1C). W 3. dniu sferoidy są transdukowane AAV przy różnych wartościach MOI (Ryc. 1D). Kinetyka transdukcji jest śledzona podłużnie przy użyciu obrazowania żywych komórek (Ryc. 1E), a analiza końcowa jest przeprowadzana przy użyciu pomiarów fluorescencji lub luminescencji na płytkach (Ryc. 1F).

Rysunek 2 przedstawia morfologię sferoidów z 6 różnych linii komórkowych, wykazując różnice w gęstości, okrągłości i kształcie. Wszystkie linie komórkowe były hodowane w pełnej pożywce DMEM przez kilka pasaży przed wykorzystaniem w jakimkolwiek doświadczeniu. Po osiągnięciu fazy logarytmicznej komórki HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 i Huh7 zostały zebrane i rozcieńczone seryjnie w płytkach ULA o okrągłym dnie, zaczynając od gęstości 10 000 komórek na studnię, z dwukrotnym rozcieńczeniem seryjnym (układ płytki znajduje się w Uzupełniającym Rysunku 1, a reprezentatywne wyniki przedstawiono w Uzupełniającym Rysunku 2). Sferoidy mogą mieć rozmiar nawet 50 µm, zachowując przy tym strukturę sferoidalną i doskonałą podatność na transdukcję. Po wysianiu komórek płytkę ULA o okrągłym dnie wirowano przy 350 × g przez 5 min, co pozwoliło komórkom zgromadzić się w centrum studni i samoorganizować w sferoidy. Krok ten jest szczególnie korzystny dla komórek, które nie agregują w sposób naturalny. Czas wirowania można wydłużyć z 5 do 15 min w przypadku komórek wykazujących wysoką oporność, takich jak limfocyty. Dobrze uformowane sferoidy wykazują okrągły i zwarty fenotyp, taki jak zaobserwowano w przypadku komórek HEK293T i Huh7, natomiast sferoidy słabo uformowane są luźno zagregowane i podatne na dezintegrację podczas wymiany pożywki.

Następnie płytkę przenosi się do inkubatora o temperaturze 37 °C wyposażonego w urządzenie do monitorowania żywych komórek. Płytki są monitorowane codziennie w odstępach 6 h w celu oceny tworzenia się sferoidów dla każdej z opisanych tutaj linii komórkowych. Większość linii komórkowych wymaga 3 dni na samoorganizację w sferoid. Jak pokazano na Rysunku 2, każda linia komórkowa wykazała odrębne cechy morfologiczne i różny stopień zagęszczenia po 3 dniach od wysiania. Linie komórkowe wątroby (Huh7, HEPG2 i HEP3B) utworzyły bardziej zwarte i gęste sferoidy niż pozostałe linie. HEK293T utworzyła bardzo okrągłą strukturę sferyczną z wyraźnym rdzeniem nekrotycznym, podczas gdy A375 utworzyła nieregularnie kształtowany agregat komórkowy (opisany wcześniej jako zdeformowany sferoid)18,19. Uważa się, że różnice te w morfologii są wskaźnikami patofizjologicznych stanów choroby, co dodatkowo potwierdza użyteczność modeli 3D w porównaniu z systemami hodowli 2D18,19. Protokół tworzenia sferoidów jest wysoce powtarzalny dla wszystkich sześciu badanych linii komórkowych i został zastosowany do wszystkich przedstawionych tutaj transdukcji.

Po optymalizacji stężenia komórek, czasu formowania sferoidów oraz stanu zielonej/czerwonej autofluorescencji (pokazanej na Rysunku uzupełniającym 3), przystąpiono do testowania transdukcji AAV w sferoidach z wykorzystaniem systemu obrazowania żywych komórek oraz czytnika płytek (przykład układu płytki dla miareczkowania AAV pokazano na Rysunku uzupełniającym 4). Rysunek 3  przedstawia zoptymalizowany protokół tworzenia sferoidów zastosowany w czterech różnych liniach komórkowych (HEK293T, Huh7, HEP3B i HEPG2). W 3. dniu formowania sferoidów, sferoidy poddano transdukcji dwoma wektorami AAV2 o różnych konstrukcjach genomu wektorowego, znakowanymi GFP, przy różnych wielokrotnościach infekcji (MOI). Te dwie konstrukcje transgenów AAV reprezentują warianty GFP o wysokiej sile ekspresji (scGFP) i niskiej sile ekspresji (ssGFP). Po transdukcji komórek płytki umieszczono w systemie obrazowania żywych komórek w celu monitorowania transdukcji AAV w czasie rzeczywistym. W punkcie czasowym 72 h intensywność fluorescencji zielonej była wykrywana za pomocą oprogramowania do obrazowania żywych komórek. Na Rysunku 3, linie niebieskie reprezentują genomy sc-GFP, natomiast linie czerwone reprezentują genomy ss-GFP. Sferoidy wykazały wysoką podatność na transdukcję AAV, przy czym w przypadku scGFP silną transdukcję wykryto przy bardzo niskich mianach AAV i w różnych liniach komórkowych. Reprezentatywne filmy z transdukcji AAV w różnych liniach komórkowych i przy różnych MOI, zarejestrowane w czasie rzeczywistym, przedstawiono w Filmach uzupełniających 1, 2, 3, 4, 5 oraz Filmie uzupełniającym 6. Z drugiej strony, transdukcja sferoidów AAV ssGFP była obserwowana na niższych poziomach, co odzwierciedla oczekiwaną słabszą/wolniejszą transdukcję tego typu elementu regulacyjnego20,21. Dowodzi to użyteczności sferoidów 3D w badaniu silnej i słabej transdukcji AAV, a także w rozróżnianiu genów o silnej transdukcji, takich jak sc-GFP, od genów o mniejszej sile ekspresji, takich jak ss-GFP. Zaobserwowano 100-krotną różnicę w względnej fluorescencji między transgenami sc a ss przy MOI 106 w komórkach HEK293T oraz 3-krotną różnicę w liniach komórkowych trudniejszych do transdukcji, takich jak HEP3B.

Następnie przystąpiono do przetestowania transdukcji AAV różnych serotypów w sposób zależny od dawki zarówno w sferoidach HEK293T, jak i sferoidach Huh7. Jak pokazano na Rysunku 4, sferoidy 3D były podatne na transdukcje AAV-scGFP czterech różnych serotypów. Po 72 h transdukcji poziom scGFP zmierzono za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek (Rysunek 4A,B) oraz oprogramowania do obrazowania żywych komórek (Rysunek 4C,D)). Wszystkie 4 serotypy zostały pomyślnie wykryte przy użyciu tych dwóch urządzeń. System obrazowania żywych komórek wykazał wyższy zakres stosunku sygnału do szumu niż fluorescencyjny czytnik płytek, choć znormalizowany sygnał nie wykazał istotnych różnic. Stwierdzono, że AAV2 wykazał najwyższą skuteczność transdukcji w obu liniach komórkowych, następnie AAV1, podczas gdy AAV5 i AAV9 wykazały znacznie niższą transdukcję.

Następnie oceniono transdukcję luminescencyjną z wykorzystaniem protokołu dla sferoidów. Aby to sprawdzić, komórki HeLa wyhodowano w formie trójwymiarowych sferoidów zgodnie z zoptymalizowanym protokołem opisanym w niniejszym opracowaniu. W 3. dniu sferoidy HeLa poddano transdukcji przy użyciu 5 różnych serotypów AAV kodujących gen reporterowy nanolucyferazy. Po 72 h od transdukcji AAV komórki potraktowano substratem Live Cell i inkubowano przez 5 min w temperaturze pokojowej. Następnie zmierzono luminescencję i wykonano obrazowanie przy użyciu systemu obrazowania bioluminescencyjnego (Ryc. 5A). W tym systemie zaobserwowano wydajną transdukcję dla wszystkich serotypów AAV. Odnotowano czułe rozróżnienie między skutecznością transdukcji różnych serotypów AAV, co wskazuje, że protokół nie ogranicza się do odczytów fluorescencyjnych. Zgodnie z trendami zaobserwowanymi na Ryc. 5, transdukcja AAV-nanolucyferazy w komórkach HeLa wykazała, że AAV2 jest najsilniejszym serotypem, co było widoczne również w przypadku wektorów AAV-GFP. Podobnie, najniższą skuteczność transdukcji zaobserwowano dla serotypu AAV9, co potwierdziły zarówno wektory fluorescencyjne, jak i luminescencyjne (Ryc. 4 i 5). Reprezentatywny obraz transdukcji AAV-nanolucyferazy przedstawiono na Ryc. 5B.

Oprócz intensywności transdukcji, protokoły z wykorzystaniem sferoidów 3D umożliwiają monitorowanie kinetyki transdukcji. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywne wyniki kinetyki transdukcji sferoidów 3D HEK293T za pomocą AAV2-scGFP i AAV2-ssGFP przy zastosowaniu różnych MOI (0-106) (Rysunek 6A-G). Stwierdzono, że transdukcja AAV2-scGFP jest wykrywalna przy MOI tak niskich jak 101, a wzrost sygnału GFP jest zauważalny po około 34 h w porównaniu z komórkami nieleczonymi, przy zastosowaniu systemu obrazowania żywych komórek. Sygnał AAV2-ssGFP jest znacznie słabszy i pojawia się wolniej niż sygnał AAV2scGFP. Aby dodatkowo porównać szybkość transdukcji, obliczono czas rozpoczęcia, w którym sygnał GFP staje się wykrywalny. Zaobserwowano, że scGFP transdukuje komórki średnio 4 razy szybciej niż ssGFP. Indywidualne czasy rozpoczęcia podano w Tabeli 1. Te pomiary kinetyczne ukazują dodatkowy aspekt skuteczności transdukcji, który jest przydatny w optymalizacji testu.

Schemat przepływu pracy hodowli komórkowej; tworzenie sferoidów, transdukcja i analiza przy użyciu systemu IncuCyte.
Rycina 1: Przegląd transdukcji AAV z wykorzystaniem hodowli 3D. (A) Komórki są namnażane w hodowli 2D, a następnie wysiewane na płytki o ultraniskiej adhezji (ULA) w celu utworzenia sferoidów. (B) Płytki są wirowane w celu wspomagania agregacji, a następnie przenoszone do (C) systemu IncuCyte S3 w celu monitorowania tworzenia sferoidów w czasie rzeczywistym. (D) W 3. dniu sferoidy są poddawane transdukcji AAV przy różnych wartościach MOI. (E) Kinetyka transdukcji jest śledzona wzdłużnie za pomocą obrazowania żywych komórek, a (F) analiza końcowa może być przeprowadzona przy użyciu pomiarów fluorescencji lub luminescencji na płytkach. Aby zobaczyć tę figurę w powiększeniu, kliknij tutaj.

Porównanie sferoidów kultur komórkowych; obraz mikroskopowy sześciu różnych linii komórkowych w układzie doświadczalnym.
Rysunek 2: Charakterystyka morfologiczna sferoidów w wielu liniach komórkowych. Reprezentatywne obrazy sferoidów wygenerowanych z komórek HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 i Huh7 wykazują zmienność rozmiaru, morfologii i zwartości, zapewniając jednocześnie wysoką powtarzalność między powtórzeniami (pasek skali, 50 µm). Wszystkie linie komórkowe wysiano w zagęszczeniu 1 x 104 komórek/studzienkę na 3 dni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza ekspresji genów w komórkach oznakowanych GFP; MOI a fluorescencja, wiele linii komórkowych, wykres, obrazy.
Rycina 3: Porównanie wydajności transdukcji AAV między wektorami samouzupełniającymi (scGFP) a jednoniciowymi (ssGFP) w różnych liniach komórkowych. Sferoidy 3D z linii (A>) HEK293T, (B>) Huh7, (C>) HEP3B oraz (D>) HEPG2 zostały samoorganizujące i poddane transdukcji przy różnych MOI AAV2-scGFP (niebieski) i AAV2-ssGFP (czerwony). Całkowita intensywność fluorescencji zielonej została zmierzona 72 h po transdukcji. Reprezentatywne obrazy sferoidów traktowanych najwyższym MOI dla każdego AAV, wykonane w punkcie czasowym 72 h przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek. Paski skali reprezentują 200 µm. Słupki błędów reprezentują SD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy intensywności fluorescencji dla serotypów AAV w komórkach HEK293T i Huh7; zmienne: MOI i czas.
Rycina 4: Transdukcja AAV w sferoidach 3D pozwala na rozróżnienie aktywności różnych serotypów AAV. Sferoidy 3D z komórek (A,C) HEK293T oraz (B,D) Huh7 zostały poddane transdukcji wirusami AAV1, AAV2, AAV5 i AAV9 z transgenem scGFP w zakresie różnych wartości MOI. Jednostki intensywności fluorescencji zmierzono po 72 h przy użyciu fluorescencyjnego czytnika płytek (A,B) oraz systemu obrazowania żywych komórek (C,D). Słupki błędów reprezentują SD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres i mapa ciepła wydajności transdukcji AAV; MOI vs całkowity strumień; analiza wektora wirusowego.
Rycina 5: Transdukcja AAV w sferoidach 3D z reporterami luminescencyjnymi. Sferoidy HeLa poddano transdukcji wektorami AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 i AAV9 kodującymi transgen reporterowy nanolucyferazy przy zwiększających się wartościach MOI. Luminescencję zwizualizowano i zmierzono za pomocą odczytu końcowego (Endpoint readout) w systemie obrazowania luminescencyjnego 72 h po transdukcji. (A) Wartości całkowitego strumienia (Total Flux). (B) Reprezentatywny odczyt końcowy z obrazami luminescencyjnymi płytek ze sferoidami wykazujący rozkład sygnału w zależności od MOI i serotypów. Każdy wektor AAV analizowano w dwóch powtórzeniach poziomych. Słupki błędu reprezentują SD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ekspresji genów; wykresy MOI w funkcji czasu; intensywność fluorescencji sgGFP; wyniki eksperymentalne.
Rysunek 6: Ocena kinetyki transdukcji w sferoidach 3D. Sferoidy HEK293T poddano transdukcji AAV2-scGFP (kolor niebieski) i AAV2-ssGFP (kolor czerwony) w zakresie 7 wartości MOI (A–G). Całkowitą intensywność zielonej fluorescencji mierzono w okresie 72 h w odstępach 6 h, wykorzystując system Monitor spheroid formation/growth. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

MOI (Krotność Zakażenia)scGFP (godz.)ssGFP (godz.)
1>72 h>72
1034.2>72
10016.554.2
10005.623.1
100003.313
1000001.98

Tabela 1: Czas rozpoczęcia detekcji GFP.

Rycina uzupełniająca 1: Układ płytki dla miareczkowania sferoidów. (A) Reprezentatywny układ płytki przedstawiający schemat rozcieńczeń dla sferoidów HEK293T, Huh7, HEP3B i HEPG2, wygenerowany z początkowych gęstości wysiewu w zakresie od 10 000 do 78 komórek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Tworzenie sferoidów przy różnych gęstościach wysiewu. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe sferoidów HEK293T i Huh7 wytworzonych z początkowych gęstości wysiewu w zakresie od 10 000 do 78 komórek w dniu 3. Pasek skali reprezentuje 50 µm.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Informacje o liniach komórkowych do tworzenia sferoidów 3D.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 4: Układ płytki dla rozcieńczeń seryjnych AAV. (A) Reprezentatywny układ płytki przedstawiający schemat rozcieńczeń seryjnych AAV zastosowany dla AAV1, AAV2, AAV5 i AAV9, rozpoczynający się od MOI wynoszącego 106. Kontrolę negatywną pokazano w rzędzie H, reprezentującym nieleczone sferoidy.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 1: Obrazowanie komórek na żywo w czasie rzeczywistym podczas transdukcji AAV2-scGFP w sferoidach HEK293T przy MOI 106.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 2: Obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym podczas transdukcji AAV2-scGFP w sferoidach Huh7 przy MOI 106.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 3: Obrazowanie komórek na żywo w czasie rzeczywistym transdukcji AAV2-scGFP w sferoidach HEP3B przy MOI 106.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 4: Obrazowanie komórek żywych w czasie rzeczywistym podczas transdukcji AAV2-scGFP w sferoidach HEK293T przy MOI 106, jako część badania zależności od dawki.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 5: Obrazowanie komórek żywych w czasie rzeczywistym podczas transdukcji AAV2-scGFP w sferoidach HEK293T przy MOI 104.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 6: Obrazowanie komórek żywych w czasie rzeczywistym podczas transdukcji AAV2-scGFP w sferoidach HEK293T przy MOI 101.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Obliczenie MOI niezbędnego do transdukcji AAV.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiamy usprawnioną platformę 3D in vitro do rozwoju AAV oraz testowania ich aktywności. Platforma ta wykorzystuje zwiększoną transdukcję, wysoką czułość i lepszą przewidywalność translacyjną dzięki zastosowaniu trójwymiarowej hodowli komórkowej, która bardziej przypomina architekturę ludzkich tkanek. System ten pozwala skutecznie zróżnicować wydajność transdukcji dla poszczególnych serotypów AAV i elementów regulacyjnych, w tym wektorów jednoniciowych i samouzupełniających, w wielu liniach komórkowych. Zauważamy, że w przeciwieństwie do konwencjonalnych testów 2D, w których wydajność transdukcji jest często definiowana jako procent komórek wykazujących obecność transgenu, system sferoidów 3D nie umożliwia łatwego ilościowego określenia wyników z rozdzielczością pojedynczych komórek. W związku z tym wydajność transdukcji w niniejszej pracy zdefiniowano jako całkowitą intensywność sygnału reporterowego (fluorescencyjnego lub luminescencyjnego), która odzwierciedla połączony wkład proporcji komórek transdukowanych oraz poziomu ekspresji transgenu w każdej komórce. Wysoka czułość sferoidów znacznie ogranicza zapotrzebowanie na duże ilości produktu, co czyni tę metodę kosztowo efektywną, wszechstronną i fizjologicznie istotną w badaniach oraz rozwoju AAV.

Podejście to rozwiązuje kluczowe problemy związane z tradycyjnymi testami hodowli komórkowych 2D, które opierają się na adhezji do sztucznych powierzchni i charakteryzują się brakiem organizacji komórkowej, co może prowadzić do błędnych przewidywań dotyczących wydajności wektora w warunkach klinicznych. System sferoid 3D lepiej naśladuje strukturę tkanki i wzorce dystrybucji leków, dostarczając danych o zachowaniu wektora, które w większym stopniu odpowiadają rzeczywistym warunkom biologicznym22,23. Protokół wykorzystuje proste płytki o ultra-niskim stopniu adhezji, co sprawia, że jest on łatwo powtarzalny w standardowych warunkach laboratoryjnych.

Ten wszechstronny system może być wykorzystany w testach neutralizacji AAV, do badania penetracji AAV oraz do opracowywania bardziej złożonych eksperymentów z kokulturą w celu zbadania wpływu różnych środowisk komórkowych na transdukcję AAV. Ponadto platformy do wysokoprzepustowego przesiewania leków i wektorów mogą być łatwo zintegrowane z platformą sferoidową, co umożliwia automatyzację i redukcję kosztów w procesach odkrywania wektorów na potrzeby opracowywania bardziej ukierunkowanych produktów.

Główną praktyczną zaletą sferoidów jest ich zdolność do ciągłego wzrostu przez wiele tygodni bez konieczności pasażowania komórek, co umożliwia prowadzenie długoterminowych badań nad aktywnością AAV. Ten stabilny system hodowli utrzymuje istotne oddziaływania międzykomórkowe oraz komponenty macierzy, unikając przerw spowodowanych koniecznością wielokrotnego zbierania komórek, co jest wymagane w hodowlach 2D24. Zachowane środowisko komórkowe wspiera naturalną organizację białek oraz struktury błonowe, które są niezbędne do oceny wiązania AAV i ich wnikania do komórek25.

Choć sferoidy 3D wykazują duży potencjał w ocenie transdukcji AAV, wykazują one również pewne braki translacyjne w porównaniu z modelami in vivo , co wynika przede wszystkim z ich uproszczonej struktury w stosunku do tkanek natywnych. Sferoidom brakuje kluczowych komponentów fizjologicznych, takich jak układ naczyniowy umożliwiający dostarczanie wektorów, komórki odpornościowe do oceny immunogenności oraz bariery specyficzne dla tkanek, np. bariera krew-mózg, które mogą znacząco wpływać na skuteczność AAV26. Ograniczenia te wskazują, że sferoidy, mimo zapewnienia pośredniego poziomu złożoności między konwencjonalnymi kulturami 2D a modelami zwierzęcymi in vivo, pozostają niewystarczające do pełnego odtworzenia mikrośrodowiska fizjologicznego niezbędnego do kompleksowej oceny AAV.

Przedstawiony tutaj protokół tworzenia sferoidów opisuje pojedynczy typ komórek. Protokół ten można rozwinąć tak, aby obejmował 2–3 dodatkowe typy komórek, które agregują w podstawową strukturę trójwymiarową. Bardziej złożone modele 3D, takie jak organoidy lub układy mikroprzepływowe, są systemami wielokomórkowymi, które odtwarzają różnorodność komórkową i organizację konkretnych narządów, zawierając 10 lub więcej różnych typów komórek ułożonych w wzory przypominające tkankę. Tak zaawansowane organoidy 3D mogą obejmować wiele komórek27, kultury osadzone w hydrożelu, techniki wiszącej kropli oraz platformy mikroprzepływowe11,27,28. Chociaż metody te zapewniają bardziej złożoną architekturę tkanki, co mogłoby pomóc w pogłębieniu zrozumienia biologii AAV, zazwyczaj wymagają one bardziej specjalistycznych odczynników, sprzętu oraz znacznej wiedzy technicznej. Z drugiej strony sferoidy 3D tworzone na płytkach o ultra-niskim przywieraniu są znacznie prostsze i odpowiednie dla wielu laboratoriów ze względu na ich opłacalność i powtarzalność.

Kluczowe kroki dla skutecznej realizacji tego protokołu obejmują utrzymanie wysokiej żywotności komórek, ponieważ uszkodzone komórki mogą upośledzić tworzenie sferoidów i wydajność transdukcji. Stosowanie płytek o ultra-niskiej adhezji oraz optymalizacja wirowania są również krytyczne dla uzyskania zwartości sferoidów. Optymalizacja MOI dla każdego typu komórek i serotypu AAV jest niezbędna, aby uniknąć słabych sygnałów lub nasycenia. Wybór odpowiedniej metody detekcji jest również kluczowy, szczególnie w przypadku analiz kinetycznych, gdzie wymagana jest kompatybilność z systemami do ciągłego obrazowania żywych komórek. Istotne dla dokładnej interpretacji transdukcji AAV w sferoidach 3D są również następujące kwestie techniczne.

Słaby lub brak sygnału transdukcji może wynikać z niskiego miana wirusa, nieoptymalnego MOI lub niewystarczającego czasu inkubacji; można temu zaradzić poprzez weryfikację mian wirusa, optymalizację MOI oraz wydłużenie czasu inkubacji (zazwyczaj 3–5 dni). Słabe sygnały fluorescencyjne lub luminescencyjne mogą odzwierciedlać niską ekspresję transgenu lub ograniczoną penetrację odczynników wewnątrz struktury 3D, co można poprawić poprzez optymalizację ustawień ekspozycji lub zapewnienie dodatkowego czasu na dyfuzję substratu. Poważnym wyzwaniem w niektórych liniach komórkowych, takich jak komórki HeLa, jest autofluorescencja, która może prowadzić do wysokiego sygnału tła i zmniejszonej czułości w testach opartych na fluorescencji. Aby wyeliminować to ograniczenie, zastosowaliśmy system reporterowy nanolucyferazy oparty na luminescencji, który zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu i umożliwia dokładniejszą detekcję transdukcji w tle autofluorescencyjnym. Ponadto sygnał tła może wynikać z niewłaściwego progu odcięcia lub fluorescencji związanej z medium i powinien być kontrolowany przy użyciu studzienek niepoddanych działaniu wirusa (MOI = 0) w celu określenia poziomów bazowych. Wreszcie, przy wysokich wartościach MOI może wystąpić nasycenie sygnału z powodu nadmiernej ilości wprowadzonego wirusa lub ograniczeń detektora; można to zniwelować poprzez zmniejszenie zakresu MOI i optymalizację ustawień ekspozycji detektora, aby utrzymać pomiary w liniowym zakresie dynamicznym.

Podsumowując, ta metodologia sferoidów 3D stanowi usprawniony i powtarzalny system oceny transdukcji, potencji i kinetyki AAV. Dzięki wypełnieniu luki między konwencjonalnymi analizami 2D a badaniami in vivo, metoda ta umożliwia bardziej świadome opracowywanie wektorów i wspiera rozwój istotnych klinicznie strategii terapii genowej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Mortenowi Seirupowi i Trish Hoang za dostarczenie plazmidu do produkcji nanolucyferazy AAV oraz odczynników do substratu żywego. Projekt ten został wsparty poprzez udział w Programie Udziału w Badaniach ORISE w CBER, U.S. Food and Drug Administration, zarządzanym przez Oak Ridge Institute for Science and Education na mocy umowy międzyagencyjnej pomiędzy Departamentem Energii USA a FDA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inkubator 37°CThermoFisher Scientific#51025983Standardowe warunki hodowli
Komórki A375ATCCCRL-1619Linia komórkowa
Plazmid AAV1Addgene112862Plazmid AAV
Plazmid AAV2Addgene104963Plazmid AAV
Plazmid AAV5Addgene104964Plazmid AAV
Plazmid AAV8Addgene112864Plazmid AAV
Plazmid AAV9Addgene112865Plazmid AAV
Czytnik płytek BioTek GEN5Agilent TechnologiesNAPomiar końcowy fluorescencji lub luminescencji
WirówkaThermoFisher Scientific#TSO-MX1RUtrzymanie zawiesiny sferoidów
Corning™ roztwór soli fizjologicznej w buforze fosforanowym do hodowli komórkowych (1X)Fisher Scientific#MT21040CMXPBS do płukania komórek
DMEM z wysoką zawartością glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronianThermoFisher Scientific#10569010Kompletna pożywka wzrostowa
Zewnątrzkomórkowy inhibitor NanoLuc PromegaN235BWygasza sygnał Nanoluc® pochodzący ze środowiska zewnątrzkomórkowego  
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mLDostarczanie czynników wzrostu
Komórki HEK293TATCCCRL-3216Linia komórkowa
Komórki HeLaATCCCRM-CCL-2Linia komórkowa
Komórki HEP3BATCCHB-8064Linia komórkowa
Komórki HEPG2ATCCHB-8065Linia komórkowa
Komórki Huh7ABMT8973Linia komórkowa
Odwrócony mikroskop IncuCyte S3SartoriusNAMonitorowanie tworzenia i wzrostu sferoidów
Obrazownik IVIS SpectrumSpectralinvivoNAPomiar końcowy luminescencji
Test Nano-Glo® Live Cell Assay PromegaN2013Luminiscencyjny odczynnik podłoża do detekcji żywych komórek
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122Zapobieganie kontaminacji bakteryjnej
Kolby do hodowli tkankowej T75 z wentylacjąFisher Scientific#NC0509296 Kolby do hodowli komórek
Trypsyna-EDTA (0,05%)ThermoFisher Scientific#25300120Enzymatyczne odrywanie komórek
Płytki o ultra-niskiej adhezjiCorning#7007Zapobieganie adhezji komórek w celu wspomagania tworzenia sferoidów

Bibliografia

  1. Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.
  2. Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.
  3. Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.
  4. Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.
  5. Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.
  6. Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/
  7. Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products
  8. Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.
  9. Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.
  10. Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.
  11. Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.
  12. Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.
  13. Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.
  14. Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.
  15. Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.
  16. Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.
  17. Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.
  18. McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.
  19. Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.
  20. Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.
  21. Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.
  22. El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.
  23. Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.
  24. Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.
  25. Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.
  26. Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.
  27. Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.
  28. Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sferoidy 3Ddostarczanie gen wplatforma sferoidalnaekspresja transgenuwydajno serotypuocena aktywno ciobrazowanie ywych kom reksygna reporterowyoptymalizacja wektora
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.