Izolacja i charakterystyka małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z tłuszczowych poduszek podrzępowych u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów

Podsumowanie

PODSUMOWANIE: Ten protokół przedstawia ustandaryzowany sposób pracy izolowania i charakteryzowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) z tkanek tłuszczowych poduszek podrzępkowych pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), szczególnie małe pęcherzyki zewnętrzne (sEV) definiowane jako pęcherzyki mniejsze niż 200 nm, pełnią rolę niezbędnych mediatorów komunikacji międzykomórkowej i są uwalniane przez niemal wszystkie typy komórek do różnych płynów biologicznych. Poduszka tłuszczowa podrzępkowa (IPFP) jest ściśle powiązana z rozwojem i postępem choroby zwyrodnieniowej stawów kolana (OA). Jednak standaryzowane metody izolacji sEV bezpośrednio z roślin IPFP pozostają ograniczone. Przedstawiamy powtarzalny protokół izolacji i charakteryzacji sEV pochodzących z tkanek IPFP pobranych od pacjentów z OA. Warunkowane medium zebrane z hodowli tkanek IPFP jest sekwencyjnie usuwane z komórek i zanieczyszczeń przez niskoprędkościową wirówkę, a następnie następuje ultrawirowanie w celu wzbogacenia pęcherzyków w zakresie wielkości sEV. Powstałe pęcherzyki są charakteryzowane na podstawie minimalnych informacji do badań rekomendacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (MISEV2023), wykorzystując zestaw reprezentatywnych markerów białek w różnych kategoriach funkcjonalnych: CD63 jako tetraspanina związana z błoną, ALIX i TSG101 jako białka cytosolowe zaangażowane w biogenezę pośredniczone przez mechanizmy Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT) oraz Calnexin jako białko rezydencyjne w siatkówce endoplazmatycznej do monitorowania potencjalnego zanieczyszczenia niepęcherzykowego. Ten proces prowadzi do dobrze zdefiniowanych preparatów sEV odpowiednich do dalszych zastosowań, takich jak testy funkcjonalne czy profilowanie proteomiczne w badaniach nad chorobą zwyrodnieniową stawów.

Wprowadzenie

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV) to heterogeniczny podtyp pęcherzyków zewnętrznych, które według klasyfikacji operacyjnej zaproponowanej przez Międzynarodowe Towarzystwo Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV) w wytycznych dotyczących minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (MISEV2023), są definiowane jako pęcherzyki zazwyczaj mniejsze niż 200 nm średnicy¹. sEV są uwalniane przez praktycznie wszystkie typy komórek do płynów biologicznych i przyciągają coraz większą uwagę ze względu na swoją kluczową rolę mediatorów komunikacji międzykomórkowej zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i patologicznym ^2,3.

Błona sEV jest wzbogacona o wiele białek funkcjonalnych. Wśród nich tetraspaniny, takie jak CD63, są powiązane z organizacją błony pęcherzyków i fuzją⁴. Ponadto białka cytosolowe związane z kompleksem sortującym endosomami niezbędnymi do transportu (ESCRT), takie jak ALIX i TSG101, są integralne dla biogenezy i wydzielania sEV. W związku z tym służą jako wiarygodne markery potwierdzające endosomalne pochodzenie izolowanych pęcherzyków ^5,6.

Tłuszczowa poduszka podrzępkowa (IPFP) została uznana za aktywną tkankę związaną ze stawem, ściśle powiązaną z inicjacją i postępem choroby zwyrodnieniowej stawów (OA)^7,8. W warunkach zapalnych i zwyrodnieniowych przypuszcza się, że sEV pochodzące z IPFP przenoszą mediatory zapalne i sygnały patogenne, przyczyniając się tym samym do zapalenia maziowego i degradacji chrząstki⁹. Scharakteryzowanie sEV uwalnianych przez tkanki IPFP u pacjentów z OA może zatem dostarczyć kluczowych informacji na temat sieci komunikacji międzykomórkowej powiązanej z chorobą.

Biorąc pod uwagę rosnące zainteresowanie sEV jako mediatorami molekularnymi i potencjalnymi lekami terapeutycznymi, niezbędne jest wdrożenie podejścia izolacji o wysokiej wydajności, wysokiej czystości i powtarzalności. Chociaż różnicowa ultrawirówka pozostaje jedną z najczęściej stosowanych strategii oczyszczania¹⁰, protokoły zoptymalizowane pod supernatanty hodowli komórkowej lub biopłyny mogą nie być bezpośrednio stosowane w tkankach pochodzenia tłuszczowego, takich jak IPFP. Wysoka zawartość lipidów, gęsta macierz zewnątrzkomórkowa oraz zmienne warunki trawienia enzymatycznego mogą wpływać na regenerację pęcherzyków i czystość.

Kultura roślin tkankowych zapewnia podejście istotne fizjologicznie, które zachowuje rodzimą architekturę komórkową i interakcje międzykomórkowe, minimalizując jednocześnie nadmierne zakłócenia enzymatyczne, umożliwiając tym samym zbieranie sEV uwalnianych w warunkach bliskich naturalnym. Jednak obecnie brakuje ustandaryzowanego workflow specjalnie dostosowanego do izolowania sEV z hodowli roślin IPFP.

Tutaj opisujemy krok po kroku protokół izolowania i charakteryzowania małych pęcherzyków zewnętrznych z hodowli tłuszczowych pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów za pomocą różnicowej ultrawirowania, zapewniając powtarzalne ramy metodologiczne dla dalszych badań funkcjonalnych i translacyjnych.

Protokół

Wykorzystanie tkanek IPFP od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów w tym badaniu zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Pierwszego Szpitala Uniwersytetu Medycznego Hebei (Aprobata nr [2024] 018). Pobranie próbki przeprowadzono w zatwierdzonym okresie, a wszyscy uczestnicy uzyskali pisemną świadomą zgodę przed pobraniem tkanek.

1. Przygotowanie podłoża i roztworów

1. Przygotuj 500 mL penikoliny z wyniszczonym przez egzosomy kompletnego medium DMEM/F12, mieszając 445 mL podstawowego DMEM/F12, 50 mL bezegzosomowego surowicy płodowej bydła (10%) oraz 5 mL penicyliny/Streptomycyny/Amfocerycyny B (odpowiednio 100 U/mL, 100 μg/mL i 0,25 μg/mL). Filtruj przez filtr 0,22 μm.
2. Przygotuj bufor działający western blot, mieszając 950 mL wody destylowanej (dH₂O) z 50 mL buforu 20x działającego (Tris/MOPS/SDS).
3. Przygotuj bufor transferowy western blot, mieszając 800 mL_dH2Oze 100 mL buforu transferowego 10x i 100 mL etanolu absolutnego.
   UWAGA: Ten szybki bufor transferowy został specjalnie zoptymalizowany pod kątem wysokiego prądu mokrego transferu (400 mA) w temperaturze pokojowej. Ze względu na niską ilość ciepła, kąpiel lodowa nie jest wymagana przy transferze krótszym niż 45 minut, co wykazuje wysoką efektywność transferu dla białek w zakresie 10–250 kDa.
   UWAGA: Absolutny etanol jest łatwopalny. Obchodz się z nim w dobrze wentylowanym miejscu i trzymaj się z dala od źródeł ciepła.
4. Przygotuj bufor do mycia, mieszając 50 mL 20 ml łyżek 20 x TBS (200 mM Tris i 3 M NaCl przy pH 7,5–7,6) oraz 2 mL Tween-20 z 950 mL dH₂O.
5. Przygotuj chemiluminescencyjny roztwór roboczy, mieszając równe ilości roztworu luminolu/wzmacniacza oraz buforu nadtlenkowego (potrzebne jest około 0,1 mL roztworu roboczego na centymetr kwadratowy membrany).
   UWAGA: Podłoża chemiczne mogą być drażniące. Zakładaj rękawiczki i chronij oczy. Uwalniaj odpady chemiczne zgodnie z lokalnymi przepisami instytucjonalnymi.

2. Przygotowanie tkanki IPFP i pobranie podłoża kondycjonowanego

1. Świeżo pobraną tkankę IPFP (ok. 10 g) myj trzy razy 50 mL wstępnie schłodzonego PBS na każde płukanie, delikatnie ręcznie mieszając w rurce wirówki, aby dokładnie usunąć pozostałą krew.
2. Posiekaj tkankę IPFP na kawałki o wymiarach około 2mm x 2mm x 2mm, używając sterylnych nożyczek lub skalpela.
3. Przenieś fragmenty tkanek IPFP do kolb T175. Dodaj 50 mL kompletnego medium DMEM/F12 z ubogą egzosomów. Inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 48 godzin z delikatnym mieszaniem.
4. Zbierz pełne medium DMEM/F12 (czyli podłoże kondicjonowane) w probówkach 50 mL na lodzie. Przefiltruj przez sitko o średnicy 70 μm, aby usunąć zanieczyszczenia tkanki.

3. Izolacja sEV za pomocą różnicowej ultrawirowania

UWAGA: Wszystkie poniższe kroki wykonuj w temperaturze 4 °C lub na lodzie.

1. Początkowa wirowanie z niską prędkością w celu usunięcia zanieczyszczenia tkanek
   1. Wiruj podłoże kondycjonowane w 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zbieraj supernatant i przelewaj go do nowych rurek wirówek o pojemności 50 mL.
   2. Wiruj supernatant w 3000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zbieraj supernatant i przelewaj go do nowych rurek, upewniając się, że granulka nie zostanie zakłócona.
2. Wirowanie pośrednie i filtracja.
   1. Wiruj supernatant w 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Zbierz supernatant i przefiltruj go przez filtr próżniowy o średnicy 0,22 μm, aby usunąć większe pęcherzyki i zanieczyszczenia.
3. Pierwsza ultrawirowanie: granulacja sEV.
   1. Przelej przefiltrowany supernatant do rurek poliwęglanowych do wirówek o pojemności 40 mL.
   2. Próbki należy ultrawirować w 110 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C, używając rotora o stałym kącie (współczynnik k = 70). Ostrożnie usuń supernatant pipetą.
   3. Ponownie zawiesić pellet w 10 mL wcześniej schłodzonego, sterylnego PBS. Przefiltrować ponownie zawiesowany roztwór przez filtr strzykawkowy o pojemności 0,22 μm, aby usunąć pozostałe kruszywa.
4. Druga ultrawirówka: oczyszczanie sEV
   1. Ponownie ultrawiruj zawieszenie w 110 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C, używając wirnika o stałym kącie (współczynnik k = 70).
   2. Ostrożnie wyrzuć supernatant, zostawiając pellet sEV na dnie rurki. Ponownie zawiesz ostatni pellet sEV w 200 μL sterylnego PBS.
   3. Podziel zawieszenie sEV na 20 μL aliquotów, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym powtarzającymi się cyklami zamarzania i rozmrażania. Przechowuj aliquoty w temperaturze -80 °C do długotrwałego użytkowania.

4. Charakterystyka sEV za pomocą analizy western blot

1. Przygotuj próbki białka sEV.
   1. Zmieszaj pellet sEV (od kroku 3.5.2) z 80–120 μL buforu lizy RIPA wzbogaconym o inhibitory proteazy.
      UWAGA: Celuj w stosunek około 1 μL buforu RIPA na 0,5–1,0 μg szacowanego białka. Zaleca się końcowe stężenie białka co najmniej 1,0 μg/μL, aby zapewnić efektywne rozdzielenie elektroforetyczne i wysokiej jakości detekcję sygnału podczas analizy western blot.
      UWAGA: Bufor RIPA zawiera detergenty i środki drażniące. Używaj środków ochrony osobistej.
   2. Krótko zawiruj mieszankę i inkubuj próbki na lodzie przez 15–30 minut, delikatnie kołysząc się.
      UWAGA: Dokładne mieszanie na tym etapie jest kluczowe dla całkowitego uszkodzenia błony i optymalnego uwalniania białek. Niewystarczające wirowanie może prowadzić do niepełnej lizy i nieregularnych stężeń białek w replikacjach.
   3. Wiruj lizat w stężeniu 12 000–14 000 x g przez 10–15 minut. Ostrożnie zbieraj supernatant.
   4. Określ całkowite stężenie białka w lizacie sEV za pomocą testu białka z kwasem bicynchoninowym (BCA) o wysokiej czułości.
      UWAGA: Zaleca się test BCA o wysokiej czułości zamiast standardowego testu BCA dla próbek pęcherzyków zewnętrznych ze względu na niższy zakres detekcji (0,5–20 μg/mL), co umożliwia dokładne ilościowe określenie zazwyczaj niskich stężeń białek uzyskanych z oczyszczonych preparatów sEV. Wykonaj test zgodnie z protokołem zestawu.
2. Analiza Western Blot.
   1. Zmieszaj próbki białkowe z 5 x SDS-PAGE buforem ładowania próbek.
      UWAGA: Do wykrywania CD63 przygotuj próbki za pomocą nieredukującego się bufora 5x ładunkowego (bez β-merkaptoetanolu) i inkubuj w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Warunki te zachowują epitopy konformacyjne i zapobiegają agregacji tego białka tetraspaniny wywołanej przez ciepło. Dla innych markerów, w tym ALIX (białko X oddziałujące z ALG-2), TSG101 (gen podatności na guz 101) oraz Calnexin, przygotuj próbki za pomocą buforu redukującego 5x ładowania zawierającego 10% β-merkaptoetanolu i podgrzewanego w 95 °C przez 5 minut, aby zapewnić całkowitą denaturację białka.
   2. Przygotowane próbki (zazwyczaj 20–40 μg całkowitego białka) należy załadować do prefabrykowanego żelu gradientowego (4%–12%).
   3. Załaduj marker masy cząsteczkowej białka do przydzielonego dołku zgodnie z zaleceniami producenta.
   4. Przepuszczaj żel w buforze przy stałym napięciu 100 V.
   5. Kontynuuj proces przez 1–1,5 godziny lub aż barwnik ładujący dotrze do dna żelu.
      UWAGA: Czas pracy może się różnić w zależności od systemu elektroforezy oraz procentu żelu.
   6. Przenieś białka z żelu do membran PVDF za pomocą mokrego systemu transferu przy 400 mA przez 30 minut.
      UWAGA: Czas transferu może się różnić w zależności od marki używanego bufora transferowego.
   7. Zablokuj błony w buforze blokującym bez białek przygotowanym w soli fizjologicznej z buforem tris-buforowanym zawierającym 0,2% Tween-20 (TBS-T) przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Bufor blokujący jest formułowany bez białek surowicowych, biotyny ani fosforylowanych białek, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie i interferencje tła.
   8. Inkubuj błonę specyficznymi przeciwciałami pierwotnymi rozcieńczonymi w buforze rozcieńczającym przeciwciała bezsurowiczym, zawierającym stabilizatory białkowe i składniki zachowujące przeciwciała, w temperaturze 4 °C przez noc (12–16 godzin) z delikatnym mieszaniem.
   9. Umyj membrany w buforze do mycia (TBST zawierający 0,2% Tween-20) pod delikatnym poruszeniem na wstrząsaczce.
   10. Inkubuj błony odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, delikatnie mieszając z użyciem pomieszania.
   11. Ponownie umyj membrany w buforze do mycia pod delikatnym poruszeniem na shakerze.
   12. Wizualizuj pasma białkowe za pomocą podłoża chemiluminescencyjnego.
       UWAGA: Podłoża chemiczne mogą drażnić skórę i oczy. Noszę odpowiednie rękawiczki i okulary ochronne. Podłoże utylizuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi niebezpiecznych odpadów instytucjonalnych.

5. Charakterystyka sEV za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA)

1. Włącz analizator śledzenia nanocząstek oraz moduł pompy strzykawkowej zgodnie z instrukcjami producenta i pozwól systemowi się wyrównać przez co najmniej 30 minut przed pomiarem.
2. Delikatnie rozmroz próbki EV na lodzie i rozcieńcz je w sterylnej, wolnej od cząstek fosforanowych soli fizjologicznej (PBS), aby osiągnąć optymalne stężenie cząstek w zalecanym zakresie pomiarowym (około 1 x 10^do 10⁹ cząstek/mL).
3. Załaduj 1 mL rozcieńczonej próbki do sterylnej strzykawki i powoli wstrzykuj próbkę do komory pomiarowej, upewniając się, że nie pojawią się pęcherzyki powietrza.
4. Reguluj poziom i ostrość kamery, aby wyraźnie zobaczyć poszczególne cząstki wykazujące ruch Browna.
5. Nagraj trzy filmy o długości 60 sekund dla każdej próbki przy stałym przepływie, używając pompy strzykawkowej, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie cząstek.
6. Analizuj nagrane filmy za pomocą oprogramowania NTA z progiem wykrywania ustawionym na 12, rozmiarem rozmycia ustawionym na Auto i maksymalnym dystansem skoku na Auto.
7. Generuj profile rozkładu rozmiarów cząstek i koncentracji za pomocą zautomatyzowanej funkcji analizy oprogramowania.
8. Eksportuj surowe dane, wykresy rozkładu rozmiarów cząstek oraz pomiary stężenia do dalszej analizy statystycznej.
9. Dokładnie wyczyść komorę pomiarową sterylną wodą wolną od cząstek, następnie nałożyć 70% etanolu i ponownie przepłukać sterylną wodą wolną od cząstek, aby zapobiec krzyżowemu zanieczyszczeniu między próbkami.

6. Charakterystyka sEV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)

1. Używaj miedzianych siatek o średnicy 200 siatek pokrytych węglem. Wykonaj wyładowanie żarowe na siatkach przez 30 sekund, używając systemu wyładowania żarownego, jeśli jest dostępny.
2. Na siatkę należy nałożyć 10 μL zawiesiny sEV (ponownie zawiesowanej w sterylnym, filtrowanym PBS) i inkubować przez 2–5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Usuń nadmiar płynu, delikatnie dotykając krawędzi kratki papierem filtracyjnym.
4. Przemyj siatkę, kolejno umieszczając powierzchnię załadowaną próbką na trzech oddzielnych kroplach ultraczystej wody.
5. Nałóż 10 μL roztworu 2% kwasu fosforungstycznego (pH 7,0) na siatkę i inkubuj przez 1–2 minuty w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Kwas fosforungstyczny to żrący kwaśny odczynnik, który może powodować podrażnienia skóry, oczu i dróg oddechowych. Postępuj zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa instytucjonalnego, nosząc odpowiedni sprzęt ochronny, w tym rękawiczki i ochronę oczu. Usuwaj odpady zabarwiające i zanieczyszczone materiały zgodnie z zatwierdzonymi procedurami dotyczącymi niebezpiecznych odpadów chemicznych.
6. Usuń nadmiar plamy za pomocą papieru filtracyjnego i pozwól kratce całkowicie wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut.
7. Zbadaj siatki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego pracującego przy napięciu przyspieszającym 80 kV.
8. Wykonaj reprezentatywne obrazy przy odpowiednich powiększeniach, aby ocenić morfologię pęcherzyków.

Wyniki

Skuteczna izolacja małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) z tkanek tłuszczowych podkładów podrzępkowych (IPFP) została potwierdzona dzięki charakteryzacji multimodalnej.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) wykazała, że izolowane pęcherzyki wykazywały charakterystyczną morfologię kubka z wyraźnie określonymi błonami dwuwarstwowymi lipidów, zgodną z cechami strukturalnymi sEV (Rysunek 1)¹¹.

Dyskusja

Protokół ten zapewnia powtarzalny i praktyczny sposób izolowania małych pęcherzyków zewnętrznych (sEV) z tkanek tłuszczowych podkładek podrzępowych (IPFP) za pomocą hodowli roślin, a następnie różnicowej ultrawirówki. Wyizolowane pęcherzyki zostały zweryfikowane metodami komplementarnej charakteryzacji, w tym mikroskopią transmisyjną elektronową (TEM), analizą śledzenia nanocząstek (NTA) oraz detekcją Western blot ustalonych markerów EV¹. TEM potwierdził obecność pęcherzyków otoczonych błoną o cha...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurki do wirówek PET o pojemności 40 mL	himac (Eppendorf Himac Technologies)	5720411148	Polietylen-tereftalan, 26 x 90 mm
70 & mikro; m Cetarz komórkowy	Technologia Lanjieke w Pekinie	560049	Do usuwania zanieczyszczeń tkanek
Przeciwciała anty-Alix	Biotechnologia Shanghai Abways	CY7215	Dodatni marker sEV
Przeciwciało przeciw Calnexinie	Biotechnologia Shanghai Abways	CY5839	Negatywny marker (zanieczyszczenie ER)
Przeciwciało przeciw CD63	Nauki pokrewieństwa	DF2305	Marker tetraspanina
Przeciwciało przeciw TSG101	Biotechnologia Shanghai Abways	CY5985	Dodatni marker sEV
Zestaw do testowania białek BCA	Shanghai YaMei Biotechnology	ZJ102	Dla ilościowej ilościowości białek
Kolba do hodowli komórek (T175)	NEST Biotechnology	560229	Dla kultury roślin IPFP
Rurka wirówki (50 mL)	BIOFIL	560041	Dla początkowych kroków przy niskiej prędkości
Serum bydła z wyczerpanym egzosomem	Cyagen Biosciences	FBSNE-01061	Do hodowli tkanek
HRP Goat anti-Rabbit IgG	Biotechnologia Shanghai Abways	AB0101	Przeciwciało wtórne przeciwko WB
Natychmiastowy bufor ładowania białek (denaturujący, redukując, 5& razy;)	Shanghai YaMei Biotechnology	LT101	Dla denaturacji białek
Zestaw do testów białek Micro BCA	Thermo Scientific	23235	Dla ilościowej ilościowości białek
Jednostka filtrująca Millex-GP (0,22 & mikro; m)	Technologia Lanjieke w Pekinie	560360	Sterylny, do filtracji pęcherzyków
Analizator śledzenia nanocząstek	Malvern Panalytical	NanoSight NS300	Do analizy rozmiaru i koncentracji
Bufor szybkiego transferu Omni-Flash Wolny od Lodu	Shanghai YaMei Biotechnology	PS201S	Dla transferu białka Western blot
Kwas fosforungstyczny (2%)	Sigma-Aldrich	P4006	Dla barwienia TEM ujemnego
Bufor obciążający białkiem (denaturujący, nieredukujący, 5& razy;)	Shanghai YaMei Biotechnology	LT103	Dla denaturacji białek
Wolny od białek bufor szybko blokujący (5& razy;)	Shanghai YaMei Biotechnology	PS108	Dla blokuj membrany
Bufor lizy RIPA	Pekinska Solarbio Nauka & Technologia Spółka, Ltd	R0010	Do ekstrakcji białka sEV
TBS (20 razy;)	Pekinska Solarbio Nauka & Technologia Spółka, Ltd	T1080	Do przygotowania bufora do prania
Transmisyjny mikroskop elektronowy	Hitachi	HT7800	Do charakterystyki morfologicznej
Bufor elektroforezy Tris/MOPS/SDS	Shanghai YaMei Biotechnology	PS120	Do separacji białek
Tween-20	Pekinska Solarbio Nauka & Technologia Spółka, Ltd	T8220	Do przygotowania bufora do prania
Ultrawirówka	himac (Eppendorf Himac Technologies)	CP100NX	System izolacji dużych prędkości
Ultraczuły zestaw do wykrywania chemiluminescencji	Shanghai YaMei Biotechnology	SQ201	Do wizualizacji pasm białkowych
Uniwersalny Bufor Rozcieńczający Przeciwciał	Shanghai YaMei Biotechnology	PS119L	Dla przeciwciał pierwotnych/wtórnych