Artykuł metodologiczny

Przeprogramowanie indukowanych pluripotentnych linii komórek macierzystych z próbek zamrożonego płaszcza Buffy

DOI:

10.3791/70522

⸱

10 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół szczegółowo opisuje kroki rozwiązywania problemu z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) z obwodowych komórek monojądrowych (PBMC) z próbek pacjentów, które trudno było przeprogramować zgodnie z instrukcjami producenta. Protokół ten jest specyficzny dla mrożonych próbek Buffy Coat, ale może być również stosowany do przeprogramowania oczyszczonych PBMC.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pluripotentne komórki macierzyste (hPSC) są cennym narzędziem do modelowania chorób. Dalsze komórki macierzyste mogą być przeprogramowane z dorosłych komórek somatycznych, zwanych indukowanymi pluripotentnymi komórkami macierzystymi (iPSC). Technologia iPSC umożliwia ocenę konkretnych uczestników i populacji oraz wchodzi w medycynę spersonalizowaną. Krew jest rutynowo pobierana i krioprezerwowana do celów badawczych. Próbki te są przetwarzane albo jako powłoki buffy, czyli próbki krwi zawierające białe krwinki i płytki krwi, albo jako obwodowe komórki monojądrowe (PBMC), które stanowią bardziej oczyszczoną populację białych krwinek bez eozynofilów, bazofilów, płytek krwi czy czerwonych krwinek. Oba są łatwo dostępnym i stosunkowo nieinwazyjnym źródłem programowalnych komórek somatycznych. Kilka raportów opisuje przeprogramowanie z PBMC, podczas gdy tylko jeden opisuje ten proces z zamrożonych płaszczy buffy. Najnowsze doświadczenia wykazały, że protokoły reprogramowania PBMC dostępne w literaturze i od producentów okazały się nieskuteczne przy stosowaniu do mrożonych próbek buffy coat, co wymagało adaptacji i strategii rozwiązywania problemów opisanych tutaj. Dla wielu badaczy korzystających z technologii iPSC niezbędne jest posiadanie szczegółowych protokołów o wysokiej skuteczności, zwłaszcza w przypadkach, gdy próbki pacjentów mogą zawierać tylko kilka komórek, są pozyskiwane w szerokich odstępach czasowych, pochodzą z ograniczonej grupy uczestników lub są w inny sposób bardzo wartościowe. Tutaj wyznaczane są punkty kontrolne i strategie rozwiązywania problemów, aby zwiększyć szansę na przeprogramowanie ludzkich zamrożonych płaszczy buffy coat lub oczyszczonych PBMC. Ostatecznie protokół ten pozwoli badaczom zidentyfikować predyktory sukcesu przeprogramowania oraz opracować alternatywne podejścia zwiększające szanse na skuteczne wyprowadzenie iPSC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych (hPSC) to łatwo skalowalne i odnawialne źródło ludzkich komórek, które można różnicować w dowolny typ komórek w organizmie, co pozwala badaczom badać typy komórek i tkanek trudno dostępnych lub niedostępnych u pacjentów. Ponadto indukowane pluripotentne komórki macierzyste (iPSC) mogą być pozyskiwane bezpośrednio z komórek somatycznych pacjenta1. Pozwala to na zróżnicowanie specyficznych dla pacjenta typów komórek, które są nieocenionym narzędziem do modelowania chorób i odkrywania leków. Dlatego kluczowe są rygorystyczne, powtarzalne i skuteczne metody przeprogramowania komórek somatycznych w iPSC.

Fibroblasty, komórki moczu oraz krwinki 2,3, każda z własnymi ograniczeniami, są jednymi z najczęściej używanych źródeł somatycznych komórek do wyprowadzania iPSC. Fibroblasty, historycznie najpopularniejszy wybór do przeprogramowania3, nie są łatwe do uzyskania i wymagają dość inwazyjnej biopsji skóry. Komórki programowalne można uzyskać z próbek moczu, które są łatwe do pobrania i nieinwazyjne, ale proces przeprogramowania musi rozpocząć się od świeżych próbek do 48 godzin po pobraniu4. Krew stanowi doskonałe źródło komórek programowalnych, ponieważ jest mało inwazyjna do pozyskania i łatwo dostępna. Istnieje wiele dostępnych protokołów przeprogramowywania z jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC), komórek krwi z jednym jądrem, w tym limfocytów, monocytów oraz naturalnych komórek zabójczych5. Ponieważ PBMC są mniej gęste niż inne komórki krwi, można je izolować/oczyścić ze świeżo wyizolowanych próbek pełnej krwi poprzez wirowanie gradientu gęstości5. Alternatywnie, po wirowaniu cała krew rozdziela się na trzy wyraźne warstwy: osocze, buffy coat i czerwone krwinki6. Płaszcze Buffy zawierają PBMC, a także płytki krwi i niektóre erytrocyty. Jednak PBMC są mniej dostępne w większości biobanków, podczas gdy pełnokrwiste lub białe sierści są liczne i dostępne7. Pomimo dostępności płaszczy buffy w biobankach i obecności programowalnych PBMC w tych próbkach, bardzo niewiele protokołów szczegółowo opisuje przeprogramowanie z mrożonych płaszczy buffy8, pozostawiając to niewykorzystane źródło.

Obecnie opublikowano wiele protokołów 1,8,9 oraz komercyjnie dostępnych zestawów10, które usprawniają przeprogramowanie; Jednak nie analizują dogłębnie sposobów na maksymalizację sukcesu komórek dawcy pacjentów, które trudno przeprogramować. Powszechnie przyjmuje się, że niektóre komórki po prostu nie chcą się przeprogramować, a gdy tak się dzieje, wielu badaczy może próbować z innym typem komórek dawcy lub innym pacjentem. Jednak dla wielu badaczy lub pacjentów może to nie być realna opcja. W przeciwieństwie do wcześniej opublikowanych protokołów 8,9, protokół ten zawiera przewodnik z punktami kontrolnymi i kryteriami, na podstawie których można przewidywać sukces przeprogramowania, oraz stosuje unikalne podejście, oczyszczając zamrożone futrole buffy za pomocą wirowania gradientu gęstości po rozmrażeniu.

Proces rozpoczyna się od pobrania krwi od wybranych osób i izolacji PBMC lub buffy coats. W przypadku nowych eksperymentów prawdopodobnie będzie to obejmowało rekrutację nowych dawców, którzy zostaną pobrani świeżą krwią za zgodą IRB i z odpowiednim formularzem zgody. Kolejnym krokiem jest ekspansja komórek somatycznych, w której zamrożone krwinki są rozmrażane i hodowane w warunkach sprzyjających proliferacji hematopoetycznych komórek macierzystych i erytroidowych progenitorów, czyli tych komórek krwi będących najlepszymi kandydatami do przeprogramowania11. Po 10–14 dniach komórki powinny być gotowe do przeprogramowania, co potwierdza wyraźna morfologia, która nie była omawiana w poprzednich protokołach, a następnie są transdukowane przez inokulację wirusem Sendai zawierającym czynniki Yamanaka Oct4, Sox2, c-Myc i Klf41. Po transdukcji komórki zaczynają wyrażać czynniki transkrypcyjne Yamanaka i wracają do stanu pluripotentnego, ponownie oznaczonego wyraźną zmianą morfologiczną i proliferacją w kolonie komórek macierzystych. Kolonie wyłaniające się są następnie indywidualnie zbierane, rozszerzane i kriopkonserwowane. Po dziesięciu przejściach charakterystyka poprzez potwierdzenie ekspresji markerów łodygi i potencjału różniczkowania w trzech warstwach zarodkowych potwierdza pomyślnie przeprogramowaną linię iPSC.

Ten protokół najlepiej sprawdza się w krioprezerwacji powłok buffy, które przechowywano przez < 1 miesiąc, lub w krioprezerwacji PBMC przechowywanych do 2 lat z co najmniej milionem żywotnych komórek po rozmrożeniu. Jednak opisane punkty kontrolne mogą pomóc w przeprogramowaniu rozwiązywania problemów z dowolnej dobrej jakości próbki krwi. Dodatkowo, szczegóły dotyczące adaptacji przeprogramowanych iPSC do warunków wolnych od podawania mogą być przydatne w każdym procesie przeprogramowania iPSC, niezależnie od typu komórki somatycznej na początku.

Protokół ten, ustanowiony poprzez praktyczne rozwiązywanie problemów, szczegółowo opisuje przeprogramowanie iPSC z zamrożonych białych futroli i identyfikuje morfologiczne wskaźniki sukcesu reprogramowania, dostarczając praktycznego przewodnika po reprogramowaniu trudnych próbek. Ostatecznie wdrożenie tych strategii prowadzi do oszczędności czasu, pieniędzy, odczynników i próbek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten jest zgodny z wytycznymi komisji etyki badań na ludziach Uniwersytetu Georgii. Wszystkie badania na ludziach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej Światowego Towarzystwa Medycznego. Na podstawie samooceny ochotnicy nie cierpieli na następujące choroby: mukowiscydozę, przewlekłą obturacyjną chorobę płuc, gruźlicę, astmę, cukrzycę ani ostre infekcje dróg oddechowych. Rekrutowano ochotników w wieku od 18 do 50 lat, osób obu płci. Kobiety w ciąży zostały wykluczone z badania.

1. Ekstrakcja i krioprezerwacja Buffy coat lub PBMC

Kryteria decyzyjne: Jeśli próbki będą przechowywane przez długi czas, najlepiej wybrać opcję 2. Jeśli odczynniki do oczyszczania PBMC nie są dostępne lub próbki będą przechowywane przez krótki czas, odpowiednia jest opcja 1.

  1. Opcja 1: Ekstrakcja płaszcza Buffy
    1. Wykonaj flebotomię (nakłucie żyły w celu pobrania krwi) zgodnie z zasadami WHO12 i pożyj 7–10 ml pełnej krwi do probówek pokrytych antykrzepnią. Trzymaj próbki na lodzie.
    2. Przelej 7–10 mL pełnej krwi do stożkowej probówki o pojemności 15 mL. Krew odkręca się za pomocą obrotowej wirówki z wiadrem o stężeniu 200 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, bez hamulców. Powinno to tworzyć 3 warstwy z żółtą plazmą na górze, białą warstwą błędowej sierści pośrodku, a czerwonymi erytrocytami na dole.
    3. Zbieraj osocze za pomocą sterylnej pipety serologicznej, nie naruszając warstwy buffy coat. Usuń plazmę. Przenieś białą warstwę białego płaszcza do świeżej stożkowej rurki o pojemności 15 mL (około 1–2 mL).
      UWAGA: Utylizuj plazmę do odpowiedniego pojemnika na odpady biologicznie niebezpieczne.
      UWAGA: Pewne zanieczyszczenie osoczem w buffy coat jest w porządku, ponieważ pomaga w regeneracji po rozmrożeniu.
    4. Dodaj DMSO do buffy coat tak, aby ostateczny skład to 10% DMSO v/v i natychmiast zamroz w kriovialu (1 mL/fiolka) w temperaturze -80 °C. Następnego dnia przenieś fiolki do ciekłego azotu do długoterminowego przechowywania.
      UWAGA: Na przykład, do 2 ml Buffy Coat dodaj 200 μl DMSO, dobrze wymieszaj, a następnie połącz aliquoty do 2 fiolek. Zazwyczaj skutkuje to 1–3 zamrożonymi fiolkami na próbkę.
  2. Opcja 2: Oczyszczanie PBMC
    1. Wykonaj flebotomię (nakłucie żyły w celu pobrania krwi) zgodnie z najlepszymi praktykami WHO12 i zabierz 7–10 ml pełnej krwi do probówek powlekających antykrzep. Trzymaj próbki na lodzie.
    2. Dodaj 4 mL roztwór gradientu gęstości 1 do świeżej stożkowej rurki o pojemności 15 mL. Ostrożnie nałóż 4 mL krwi na roztwór gradientu gęstości 1.
    3. Wirówka z wahającym się wiadrkiem w wirówce 400 x g na RT przez 30 minut, wyłączając hamulce. To spowoduje powstanie osocza w warstwie górnej, PBMC w warstwie środkowej, a reszta krwi w dolnej.
    4. Zbierz frakcję PBMC do świeżej stożkowej rurki o pojemności 15 mL, a następnie przemyj ją 2–3 razy 1x PBS, wirując w wirówce z obrotowym wiadrem o stężeniu 350 x g w RT przez 5 minut z zaciśniętym hamulcem. Usuń nadmiar. Aby pominąć krioprezerwację i natychmiast rozpocząć przeprogramowanie, przejdź do kroku 2.3.4.
      UWAGA: Uśmieć supernatant do odpowiedniego pojemnika na odpady biologiczne.
    5. Ponownie zawiesz granulki w pożywce kriokonserwacyjnej (90% surowicy i 10% DMSO) i natychmiast zamroz w kriojografii (1 mL/fiolka) w temperaturze -80 °C. Następnego dnia przenieś fiolki do ciekłego azotu do długoterminowego przechowywania.
      UWAGA: Zamiast wirowania gradientu gęstości do oczyszczania PBMC z krwi świeżej mogą być stosowane izolujące probówki do pobierania krwi PBMC. Możliwe jest także kriokonserwowanie przy użyciu dostępnych komercyjnie alternatywnych środków zamrażających. Typowa wydajność to 1–4 mrożone fiolki na próbkę.

2. Przygotować próbki do rozszerzania komórek somatycznych

  1. Przygotowanie medialne
    1. Przygotuj Medium Expansion Media (EM)9 , alicytując 45 mL bazy EM. Dodaj 127,8 μL kwasu L-askorbinowego (50 μg/mL z 100 mM zapasów) oraz 450 μL penicylin-streptomycyny (100x zapas).
    2. Przygotuj EM + cytokiny13 do 4 ml EM, dodaj 2 μL czynnika komórek macierzystych (SCF) (50 ng/mL z 100 μg/ml), 2 μL interleukiny-3 (IL-3) (10 ng/mL z zapasu 20 μg/mL), 16 μL erytropoetyny (EPO) (2 U/mL z zapasu 500 U/mL), 4 μL czynnika wzrostu insulinopodobnego 1 (IGF1) (40 ng/mL z zapasu 40 μg/ml), oraz 4 μL deksametazonu (1 μM z 1 mM zapasu). Używaj EM + cytokin tego samego dnia, w którym jest przygotowany.
      UWAGA: Można stosować alternatywne komercyjne systemy medium ekspansyjne.
  2. Opcja 1: Oczyszczanie PBMC z Frozen Buffy Coat
    Kryteria decyzyjne: jeśli wybrano opcję 1 w kroku 1 (np. ekstrakcja Buffy Coat), wybierz opcję 1 w kroku 2 (czyli oczyszczanie PBMC z mrożonego Buffy Coat).
    1. Pobierz rozwiązanie gradientu gęstości 2 i pozwól osiągnąć temperaturę pokojową. Wymieszaj dokładnie, odwracając butelkę. Aseptycznie przenieś 3 mL roztwór gradientu gęstości 2 do stożkowej rurki o pojemności 15 mL.
    2. Przygotuj kolejną stożkową probówkę o pojemności 15 mL z 12 mL soli buforowej fosforanu Dulbecco (DPBS).
    3. Wyciągnij fiolkę z mrożonym Buffy Coat z ciekłego azotu. Trzymaj na lodzie aż do rozmrażenia. Delikatnie rozmroz próbkę, mieszając w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Usuwaj, gdy zostaje tylko mały kryształ lodu.
    4. Ostrożnie (krople) przelej zawartość fiolki do stożkowej rurki zawierającej DPBS. Przepłucz fiolkę 1 ml DPBS i dodaj do stożkowej probówki z pobranymi komórkami.
    5. Wirówka z użyciem obrotowej wirówki kubełowej o pojemności 200 x g w RT przez 10 minut. Ostrożnie usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet komórkowy w 4 mL DPBS z 1% surowicy bydła płodu (FBS).
    6. Delikatnie nakładaj mieszankę buffy coat na roztwór gradientu gęstości, uważając, by nie dopuścić do mieszania. Wirówka w wirówce z łyżką obrotową z ciśnieniem 800 x g przez 20 minut w trybie RT bez hamulca.
    7. Za pomocą pipety usuń i wyrzuć górną warstwę plazmy, nie naruszając interfejsu plazma:gradient. Za pomocą pipety usuń warstwę PBMC na interfejsie (rysunek 1A) i przenieś ją do czystej rurki 15 mL.
      UWAGA: Pozostałe warstwy należy wyrzucać do odpowiedniego pojemnika na odpady biologiczne.
    8. Przemyj PBMC 3 mL EM, wirując w 200 x g przez 10 minut w RT. Ostrożnie usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 2 mL EM + cytokiny. Płyta w 1 dołku z płytą 12-dołkową.
    9. Umieść talerz w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5%CO2 i 20%O2.
  3. Opcja 2: Rozmrażanie mrożonych PBMC
    Kryteria decyzyjne: jeśli wybrano opcję 2 w kroku 1 (czyli oczyszczanie PBMC), lub jeśli istnieje obawa, że mrożone płaszcze buffy będą miały niską żywotność (np. przechowywane dłużej niż 1 miesiąc) (Rysunek 1B), wybierz opcję 2 w kroku 2 (np. rozmrażanie mrożonych PBMC).
    1. Przygotuj stożkową probówkę o pojemności 15 mL z 12 mL DPBS.
    2. Pobierz fiolkę z zamrożonymi PBMC z ciekłego azotu. Trzymaj na lodzie, aż do rozmrozu. Delikatnie rozmroz próbkę, mieszając ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Usuwaj, gdy zostanie tylko mały kryształ.
    3. Ostrożnie (krople) przelej zawartość fiolki do stożkowej rurki. Pamiętaj, aby pobrać wszystkie komórki z fiolki, płucząc fiolkę 1 mL DPBS.
    4. Wiruj w wirówce z łyżką wahającą się na 200 x g przy RT przez 10 minut. Ostrożnie usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet (Rysunek 1C) w 2 mL EM, następnie weź 10 μL do wykonania testu wykluczenia trypanowego niebieskiego na żywotność komórek, aby uzyskać liczbę komórek14.
      UWAGA: Uśmieć supernatant do odpowiedniego pojemnika na odpady biologiczne.
    5. Płytka 1,0 x 106–2,0 x 106 komórek/ mL w 2 mL EM + cytokiny w jednym dołku płyty 12-dołowej. Umieść talerz w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5%CO2 i 20%O2.

3. Rozszerzanie komórek somatycznych (1 dzień po rozmrożaniu)

  1. Ostrożnie usuń 1 ml zużytego medium z każdego dołku. Zużyte media można zebrać w innej studni lub rurce wirówki i sprawdzić, czy nie utracono żadnych komórek.
  2. Zamień zużyte medium na 1 mL świeżego EM + cytokiny.
  3. Powtarzaj kroki 3.1 i 3.2 i rób zdjęcia PBMC co drugi dzień, aż zaobserwujemy znaczącą zmianę morfologii, z jasnymi i okrągłymi komórkami dużych i małych rozmiarów (Rysunek 2A, odpowiednio pomarańczowa i niebieska strzałka), które są erytroblastami, typem komórek do reprogramowania. Zajmie to około 10–14 dni.
    UWAGA: Komórki, które nie wykazują tych morfologii, zazwyczaj nie posiadające większych, okrągłych komórek (rysunek 2B), raczej nie przeprogramują się pomyślnie i mogą być martwe (rysunek 2C).

4. Transdukcja (10–14 dni po rozmrożaniu)

  1. Przygotuj wirusa Sendai
    1. Korzystając z wartości miany specyficznej dla serii, oblicz objętość każdego wirusa potrzebną do transdukcji 2,0 × 105 komórek za pomocą KOS: c-Myc: Klf4 z wielokrotnością zakażeń (MOI) 5:5:3, zgodnie z zaleceniami producenta. Równanie do tego obliczenia można znaleźć w dokumentach produktowych dostarczonych przez producenta.
    2. Pobierz wirusy z zamrażarki, trzymając je w lodzie do czasu rozmrażenia. Jeden po drugim delikatnie rozmrażaj wirusy, mieszając je w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
    3. Przygotuj aliquoty, w których wszystkie trzy wirusy są wymieszane w odpowiedniej objętości do transdukcji 2,0 × 105 komórek przy MOI 5:5:3. Zamrażaj aliquoty w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do użycia.
      UWAGA: Pamiętaj, aby dokładnie wybielić wszystkie odpady, które zaraziły wirusa Sendai.
      UWAGA: Instrukcje producenta zalecają rzeczywistą liczbę komórek z obliczeniami MOI w celu określenia objętości dodanego wirusa, ale przybliżenie 2,0 × 105 okazało się skuteczne dla tego protokołu. Alicytowanie może być bardziej opłacalne i zmniejsza liczbę cykli zamrożenia i rozmrażania wirusów.
  2. Dzień Transdukcji (d0)
    1. Jeśli PBMC nie były podawane dzień wcześniej, usuń 1 mL zużytego medium i zamień go na 1 mL świeżych EM + cytokin. Rozmroz wirusa aliquot na lodzie, a następnie dodaj bezpośrednio do studni, mieszaj media.
    2. Owiń płytę w parafilm i wiruj w wirówce kubełowej z wahaniem o pojemności 350 x g w RT przez 90 minut. Umieść talerz w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5%CO2 i 20%O2 przez noc.
      UWAGA: Pamiętaj, aby dokładnie wybielić wszystkie odpady, które zaraziły wirusa Sendai.
  3. 1 dzień po transdukcji (d1)
    1. Zbierz komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mL. Dobrze opłucz 2 mL EM i sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie komórki zostały pobrane. Ogniwa w wirówce z 300 x g w RT przez 10 minut.
    2. Ostrożnie usuń supernatant i ponownie zawiesij w 2 mL EM + cytokiny. Umieść płytkę w świeżej dołce z 12 dołkami i zwróć ją do inkubatora w temperaturze 37 °C, 5%CO2 i 20%O2.
      UWAGA: Pamiętaj, aby dokładnie wybielić wszystkie odpady, które miały kontakt z wirusem Sendai.

5. Ponowna pokrycie komórek transdukowanych na komórki zasilające

  1. Przygotuj komórkę zasilającą
    1. Do 43,5 mL zmodyfikowanego medium Eagle (DMEM) Dulbecco dodaj 5 mL FBS (końcowe stężenie 10%), 0,5 mL minimalnego medium nieistotnego roztworu aminokwasów nieistotnych (MEM-NEAA) (z 100x zapasu), 50 μL 2-merkaptoetanolu (55 μM z 55 mM zapasów) oraz 0,5 mL antymikotyku antymykotycznego (z 100x zapasu).
    2. Przygotuj płytki z 6 dołkami pokrytymi żelatyną, dodając 600 μL żelatyny (0,1% z zapasu 2%) do 12 mL DPBS i rozprowadzając 2 mL na odwiert. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    3. Pobierz zamrożoną fiolkę z napromieniowanymi fibroblastami embrionalnymi myszy (MEF) i delikatnie rozmroz, mieszając w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
    4. Dodaj kroplą do stożkowej probówki 15 mL zawierającej 10 mL DPBS i płucz fiolkę dodatkowym 1 mL DPBS. Wirówka 200 x g na RT przez 5 minut.
    5. Ostrożnie usuń supernatant i ponownie zawiesij osad komórkowy w 1 mL ośrodka fibroblastowego. Usunąć 10 μL, aby przeprowadzić test wykluczenia trypanowego niebieskiego dla żywotności komórek i uzyskać liczbę komórek14.
    6. Usuń roztwór żelatyny z płytek 6-dołkowych i naświetl napromieniowane MEF w wysokości 2,5 × 104 komórek/cm 2. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5%CO2 i 20%O2 przez 6–48 godzin.
      UWAGA: Płytki komórek zasilających muszą być przygotowane przed ponownym pokryciem komórek transdukcyjnych. Najlepsze wyniki obserwowano, gdy napromieniowane MEF są inkubowane przez około 2 dni przed ponownym powlekaniem, ale inkubacja trwająca co najmniej 6 godzin może być wystarczająca.
  2. Ponowne nakładanie komórek transdukowanych
    1. Przygotuj nośniki iPSC 90 mL DMEM/F12 z 10 mL FBS (10% końcowe stężenie), 1 mL MEM-NEAA (z 100x zapasu), 1 mL L-glutaminy (2 mM z zapasu 200 mM), 1 ml penicylin-streptomycyny (z 100x zapasu), 100 μL 2-merkaptoetanolu (55 μM z 55 mM zapasów) oraz 100 μL czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF2) (10 ng/mL z 10 μg/mL zapasu). Przy każdym karmieniu dodaj świeży kwas L-askorbinowy (50 μg/mL).
    2. Trzeciego dnia po transdukcji pobierz wszystkie media i komórki z przetworzonej studni do stożkowej rurki o pojemności 15 mL. Dobrze przepłucz co najmniej dodatkową 1 ml EM i wiruj w wirówce z łyżką obrotową o stężeniu 300 x g przy RT przez 10 minut.
    3. Ponownie zawiesić granulki w nośniku iPSC o pojemności 6 mL. Aspiruj medium z 3 dołków płyty z napromieniowanymi MEF.
    4. Komórki z płytką transdukowały się na te 3 dołki napromieniowanego MEF (2ml/studnia). Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5%CO2 i 20%O2.

6. Utrzymanie do czasu powstania kolonii

  1. W dniach 4, 5 i 6 po transdukcji dodaj codziennie 1 mL świeżego medium iPSC do każdego odwiertu. Ogranicza to niepotrzebne zakłócenia świeżo przeprogramowanych komórek podczas ich osiedlania się na karmiących, a jednocześnie dostarcza im świeżych składników odżywczych.
  2. 7. dnia po transdukcji usuń wszystkie stare media i zamień je na 2 mL świeżego nośnika iPSC na odwiert. Kontynuuj karmienie mediami iPSC co drugi dzień, aż zaczną się pojawiać kolonie.
  3. Przygotuj medium hES 78 mL DMEM/F12 z 20 mL suplementu FBS wolnego (20%), 1 mL MEM-NEAA (100x), 1 mL L-glutaminy (2 mM z 200 mM zapasu), 1 mL penicylin-streptomycyny (100x), 100 μL 2-merkaptoetanolu (55 μM z 55 mM zapasu) oraz 100 μL FGF2 (10 ng/mL z 10 μg/ml zapasu). Przy każdym karmieniu dodaj świeży kwas L-askorbinowy (50 μg/mL).
  4. Gdy małe kolonie zaczną się wykluwać, kontynuuj utrzymywanie przetworzonych komórek, karmiąc co drugi dzień podłożem hES (Rysunek 3A).
    UWAGA: Kolonie zaczynają pojawiać się już 7 dni po transdukcji. Jeśli do trzech tygodni po transdukcji nie wykłębą się żadne kolonie, mało prawdopodobne, by kiedykolwiek się pojawiły.

7. Zbieraj kolonie, gdy urosną do większych rozmiarów (Rysunek 3B)

UWAGA: Czasami komórki transdukowane przechodzą zmiany morfologiczne, które nie skutkują powstaniem kolonii podobnej do komórek macierzystych (Rysunek 3C). Nie jest to uznawane za kolonię, która mogłaby prowadzić do udanej linii iPSC.

UWAGA: Od momentu wyklucia kolonii linie iPSC będą musiały być dostosowane do preferowanych warunków hodowli hPSC w laboratorium. Protokół ten pokaże, jak linie iPSC były adaptowane do warunków wolnych od podawania, hodowane na płytkach pokrytych witronektyną (VTN), zasilane chemicznie zdefiniowanymi i komercyjnie dostępnymi ośrodkami hPSC. Jeśli kolonie nie adaptują się dobrze do nowych warunków, mogą potrzebować łagodniejszego przejścia, na przykład pobierania się na komórkach pożywczych z ośrodkiem hES.

  1. Przygotuj talerze pokryte VTN przez rozmrażanie i dokładne mieszanie VTN. Dla płyty 24-dołowej przygotuj 12 mL DPBS z 120 μL VTN (5 μg/mL z zapasu 500 μg/mL) i rozprowadz 0,5 mL roztworu/dołku. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  2. Przygotuj podłoże hPSC, rozmrażając jedną butelkę suplementu hPSC w 4°C przez noc. Po rozmrożeniu dodaj 10 mL suplementu hPSC do jednej butelki 500 mL bazowego medium hPSC.
  3. Przygotuj płytki do wybiórki, usuwając roztwór VTN z dołków płyty 24-dołowej i dodając do każdego odwiertu 0,5 mL hPSC o pojemności 0,5 μL Y-27632 (10 μM z materiału 10 mM).
  4. Przynieś nową płytkę, 6-dołek zawierający przetworzone komórki/kolonie, sterylne igły do strzykawek oraz pipetę i końcówki P200 pod mikroskop rozcinający w warunkach sterylnych.
  5. Umieść płytkę zawierającą przetworzone komórki i wyklęte kolonie na mikroskopie rozcinającym, a użyj mikroskopu, aby zlokalizować jedną kolonię do zerwania. Podnieś pokrywkę talerza, aby odsłonić dołek.
  6. Aseptycznie otwórz strzykawkę i odsłonić igłę. Pod kierunkiem mikroskopu użyj końcówki igły do odłączenia kolonii od otaczających komórek pokarmowych, śledząc igłą kontur kolonii.
  7. Użyj końcówki igły, aby pokroić kolonię na kilka kawałków o równych rozmiarach. Jeśli kawałki kolonii jeszcze się nie odłączyły od talerza, użyj bocznej igły, aby nabierać lub zeskrobać je z talerza, żeby unosiły się na powierzchni.
    UWAGA: Wyrzuć igłę do odpowiedniego pojemnika na ostre przedmioty.
  8. Przy p200 użyj mikroskopu, aby przenieść zebraną kolonię. Aspiruj pływającą kolonię pipetą i przelej do studni przygotowanej płyty 24-dołkowej. Staraj się wprowadzić całą kolonię do studni bez innych kolonii czy komórek zażywających.
  9. Umieść talerz w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5%CO2 i 20%O2.
  10. Karm zebrane kolonie codziennie 1 mL podłoża hPSC, aż się zjednoczą.
    UWAGA: Kolonie mają potencjał, by genetycznie się od siebie różnić. Każda studnia na 24-dołowej płycie może zawierać tylko jedną wybraną kolonię. Każda wybrana kolonia otrzymuje odrębny identyfikator i od tego momentu traktowana jest jako inna linia komórkowa niż inne zebrane kolonie. Dla rygorystycznej rundy przeprogramowania wybierz co najmniej 24 kolonie i rozbuduj oraz scharakteryzuj co najmniej 3.

8. Rozwiń

  1. Konserwacja hPSC
    1. Zebrane kolonie są gotowe do rozszczepienia, gdy są duże i okrągłe z świecącymi krawędziami (Rysunek 4A). Kolonie rozpadają się na wiele kawałków po zebraniu. Jeśli w jednej studni jest wiele kolonii, podziel je zanim urosną na tyle, by mogły się ze sobą stykać i zacząć się różnicować.
    2. Przygotuj płytkę 6-dołową pokrytą VTN: Dla płyty 6-dołowej przygotuj 12 mL DPBS z 120 μL VTN (5 μg/mL z zapasu 500 μg/mL) i rozprowadz 1 mL roztworu/dołku. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Roztwór VTN można zastąpić DPBS i przechowywać w temperaturze 37 °C, 5%CO2 przez miesiąc. W odwiertach, na które zostaną podzielone, zasysaj DPBS i zamień go na medium o pojemności 1 mL hPSC.
    3. Aspiruj medium z dołka do rozszczepienia, a następnie raz przepłucz 1 mL DPBS. Aspiruj DPBS i dodaj 500 μL 0,5 mM bufora dysocjacyjnego EDTA (przygotowanego w 500 mL DPBS z 0,9 g NaCl i filtra sterylizowanego)15. Inkubuj w temperaturze 37 °C, 5%CO2 przez 2 minuty, aż kolonie zaczną się rozluźniać, a komórki w każdej kolonii zaokrąglać i odłączać od siebie.
    4. Wyjmij płytkę z inkubatora, zasysaj bufor dysocjacyjny EDTA. Używając pipety p1000, zbieraj komórki za pomocą 1 mL podłoża hPSC, delikatnie pipetując w górę i w dół, aż kolonie całkowicie się odłączą i lekko rozbiją. Przelej 1 mL pożywki i komórek do nowego 6-dołka zawierającego 1 mL świeżego pożywki hPSC. Pierwsze rozszczepienie odbywa się w stosunku 1:1, wszystkie komórki z oryginalnej płyty są przenoszone na nową płytę.
    5. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5%CO2 i 20%O2. Codziennie zasilaj iPSC, aż studnia się zjednoczy i będzie gotowa do rozszczepienia.
      UWAGA: Słaba morfologia komórek macierzystych (Rysunek 4B) może być złagodzona poprzez dostosowanie protokołu podziału, na przykład wcześniejsze rozdzielanie, krótsze tempo inkubacji EDTA lub dostosowanie stosunku rozdzielania.
    6. Rozwiń do talerza o średnicy 10 cm.
      1. Gdy komórki zbiegną się w każdej dołce z płyt 6-dołkowych, pokryj naczynie o średnicy 10 cm VTN (7 mL DPBS z 70 μL VTN (5 μg/mL z zapasu 500 μg/mL), inkubowane przez 1 godzinę w RT).
      2. Powtarzaj protokół rozszczepiania, tym razem rozszerzając się z 6-dołka do 10 cm podziału na hodowlę tkanek (stosunek podziału 1:1). Użyj 7–10 ml medium hPSC na naczynie o średnicy 10 cm.
      3. Gdy komórki w 10-cm naczyniu się zbiegną, powtórz ten proces rozszczepienia (passageing). W każdym fragmencie zwróć uwagę na numer fragmentu. Współczynnik rozszczepienia zależy od morfologii i gęstości komórek. Typowy stosunek to 1:10, gdzie jedna dziesiąta komórek z oryginalnej płyty jest przenoszona na nową płytę.
  2. Zamrożenia i przygotowania zapasów
    1. Po około 3 przejściach rozszerzyć się na cztery naczynia do hodowli tkanek o średnicy 10 cm dla wczesnych zapasów przejściowych. Gdy komórki w naczyniach o średnicy 10 cm się zbiją, są gotowe do zamrożenia.
    2. Przygotuj krioviale i umieść je w zamrażarce, aby ostygły. Upewnij się, że etykieta zawiera linię komórkową, klon, numer przejścia oraz datę zamrożenia.
    3. Przygotuj medium do zamrażania: 90% hPSC medium i 10% DMSO, będziesz potrzebować 1 mL/fiolka (3 mrożone fiolki na miskę o pojemności 10 cm).
    4. Wykonaj protokół rozdzielania jak zwykle, używając 4 mL 0,5 mM bufora dysocjacyjnego EDTA dla każdej anteny o średnicy 10 cm.
    5. Po inkubacji EDTA zachłyś EDTA. Delikatnie dodaj 10 ml medium hPSC do dania.
    6. Delikatnie zmyj komórki z naczynia, pipetując medium. Komórki łatwo odchodzą od podłogi naczynia i mieszają się z podłożem. Pipetować tylko 2–5 razy, aby delikatnie rozbić kolonie, ale uniknąć dysocjacji na pojedyncze komórki.
    7. Wiruj przez 5 minut w stężeniu 200 x g w RT. Aspiruj supernatant i ponownie zawiesij pellet komórkowy w medium zamrażającym.
    8. Izoluj i zamroź natychmiast w temperaturze -80 °C. Przelej zamrożone fiolki do zbiornika z ciekłym azotem w celu długoterminowego przechowywania.
    9. Zamrażaj więcej akcji w ten sam sposób po zakończeniu charakterystyki.

9. Charakterystyka iPSC:

  1. Ekspresja markerów łodygi. Po rozwarstwieniu przez co najmniej 10 przejść, gdy kolonie w 24-dołku są gotowe do rozszczepienia, popraw się 4% paradehydem i barwi immunohistochemią dla markera łodygi NANOG. Potrzeba co najmniej 10 przejść, aby kolonie były ujemne względem wirusa Sendai (SeV), co można potwierdzić immunofluorescencją (rysunek 4C).
  2. Testuj zdolność pluripotencyjną: Trzy różnice warstw zarodkowych. pluripotencję iPSC potwierdza się przez udaną różnicację do każdej z trzech warstw zarodkowych. Każda różnica zaczyna się od zbiegu naczynia o średnicy 10 cm o dobrej morfologii hPSC (Rysunek 4A).
    1. Ectoderm16
      1. Dzień przed rozpoczęciem różnicowania (dzień 1): Nasienne iPSC na płytkach 24-dołkowych pokrytych matrycą o gęstości 2,6 × 105 komórek/cm 2 w medium hPSC z Y-27632 (stężenie końcowe 10 μM) i XAV-939 (stężenie końcowe 2 μM).
      2. Dzień 0–dzień 1: Karmienie 1 mL/dołek z LDN (100 nM końcowe stężenie), SB (10 μM końcowe stężenie) oraz XAV (2 μM końcowe stężenie).
      3. Dzień 2–dzień 7: Karmienie 1 mL/dołek różnicujące z LDN (100 nM końcowe stężenie) i SB (10 μM końcowe stężenie). Od d3 karmić co drugi dzień.
      4. Dzień 8: poprawa za pomocą 4% paradehydu i barwienie immunohistochemią dla markera ektodermy PAX617 oraz potwierdzanie utraty markera pluripotencji NANOG (Rysunek 4D).
    2. Mezoderma18:
      1. Dzień przed rozpoczęciem różnicowania (dzień -1): IPSC nasiona na płytkach 24-dołkowych pokrytych matrycą o gęstości 2,5 × 105 komórek /cm2 w podłożu hPSC z Y-27632 (10 μM końcowe stężenie).
      2. Dzień 0: Karmienie DMEM/F12 z kwasem L-askorbinowym (64 μg/mL końcowe stężenie), selenitem sodu (13,6 ng/mL końcowe stężenie), holotransferryną (10 μg/mL końcowe stężenie), chemicznie zdefiniowanym koncentratem lipidowym (100x) oraz CHIR (końcowe stężenie 5 μM).
      3. Dzień 1: Karmienie DMEM/F12 z kwasem L-askorbinowym (64 μg/mL końcowe stężenie), selenitem sodu (13,6 ng/mL końcowe stężenie), holotransferryną (10 μg/mL końcowe stężenie), chemicznie zdefiniowanym koncentratem lipidowym (100x) oraz heparyną (0,6 U/mL końcowe stężenie).
      4. Dzień 2: Popraw się 4% paradehydem i barwieniem immunohistochemią dla BRACHYURY-T19 oraz potwierdź utratę markera pluripotencji NANOG (Rysunek 4E).
    3. Endoderm20
      1. Dzień przed rozpoczęciem różnicowania (dzień -1): IPSC nasion na płytkach 24-dołkowych pokrytych matrycą o gęstości 1,0 ×10 5 komórek/cm2 w podłożu hPSC z Y-27632 (10 μM końcowe stężenie).
      2. Dzień 0–dzień 4: Na d0, myj DPBS i karmij RPMI z substytutem L-glutaminy (100x), FBS (0,5% końcowe stężenie) oraz Activin A (100 ng/mL końcowe stężenie). Od d0 karmić codziennie tym samym nośnikiem.
      3. Dzień 5: Popraw za pomocą 4% paraformaldehydu i barwienia immunohistochemią markera endodermy SOX1721 oraz potwierdź utratę markera pluripotencji NANOG (rysunek 4F).
        UWAGA: Różnicowania przeprowadzono zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami. Z naszego doświadczenia wynika, że powłoki matrycowe mogą być wymienne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczność tego protokołu można śledzić na różnych etapach. Tabela 1 przedstawia podsumowanie próbek, na których ten protokół został wykonany. Próbki początkowe, będące krioprezerwacją buffy coat przechowywanymi przez tydzień lub krioprezerwacją PBMC, które mają dobrą jakość próbek po rozmrożeniu i wyraźny morfologiczny wygląd po rozszerzeniu komórek, zostały pomyślnie przeprogramowane 6 z 7 razy (Tabela 1, kategoria 1). Dwie kolejne próbki sierści buffy, zebrane i przechowywane w podob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia iPSC ma ogromny potencjał w dziedzinie biomedycyny w zakresie odkrywania mechanizmów choroby, medycyny spersonalizowanej oraz "badań klinicznych w naczyniu"22,23. Efektywne i elastyczne protokoły do przeprogramowywania iPSC z próbek krwi są kluczowe dla odblokowania wielkiego potencjału technologii iPSC, ponieważ są one łatwe do pobrania i często łatwo dostępne w biobankach. Chociaż istnieje wiele opublikowanych protokołów opisujących przeprogramowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczamy, że badania zostały przeprowadzone bez powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być uznane za potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osoby ludzkie zostały zrekrutowane i wyraziły świadomą zgodę na oddawanie krwi zgodnie z protokołem IRB UGA# 2012-10769-06, NYU# s21-01701, Emory# 2024P008659 oraz Emory# 000002114. Badania opisane w tej publikacji zostały wspierane przez National Institute of General Medical Sciences przy National Institute of Health w ramach nagrody numer 5T32GM142623 dla J. Arta, R01MH115174 dla V. Michopoulosa oraz R01NS114567 dla N. Zeltnera. Treść jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne poglądy Narodowych Instytutów Zdrowia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Standardowe naczynia do hodowli tkanek o średnicy 10 cmFalcon353003
12 płyt studniFalcon353043
Stożkowe lampy o pojemności 15 mLFisher7200886
24 płytki studnioweCorning7200740
4% roztwór paraformaldehyduThermo ScientificJ19943-K2
6 płyt studniFisher ScientificFB012927
accuSpin1RFisher Scientific75003449
Aktywność ABio-techne338-AC
AF488-osioł i alfa; kozainvitrogenA11055
AF555-osioł i alfa; RBTinvitrogenA31572
AF647-osioł i alfa; minvitrogenA31571
AF647-osioł i alfa; RBTinvitrogenA31573
Antybiotyk przeciwmykotyczny (100X)Fisher15 240 096 
Serologiczne pipety polistyrenowe BasixFisher14955233
14955234
14955235
14955236
Strzykawki tuberkulinowe BDFisher14-826-87
Rurki BD Vacuum Vacuum Glass Mononuclear Preparation (CPT)Fisher Scientific02-685-125PBMC izolujące probówki pobierające krew
BD  Plastikowe probówki do pobierania krwi z Vacutainerem z K2EDTA: Zamknięcie hemogarduFisher Scientific02-657-32Probówki do pobierania krwi z powłoką antykoagulencyjną
B-MerkaptoetanolFisher21 985 023 
Żelatyna wołowaSigmaG1393
Przeciwciała Brachyury-T, poliklonalne kozy IgGR& DAF2085
CellDrop BFDenovixCellDrop BF
Wirówka 5702EppendorfEP022628102-1EA
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidówFisherNC9022744
Chir 99021 R& D4423
Inkubator CO2SanyoMCO-20AIC
System przechowywania krioprezerwacjiNiestandardowe systemy biogeniczneV-1500AB
CryoStor CS10Technologie komórek macierzystych100-1061Alternatywne medium zamrażające
Zestaw do reprogramowania CytoTune-iPS 2.0 SendaiFisherA16517
DeksametazonSigmaD2915
DMEMFisher11965118
DMEM/F12Fisher11330057
DMSOFisherBP231-1
DPBS 1X BEZ CA MG FisherMT21031CM
EDTAFisherAM9262
Erytropoeityna (EPO)Bio-Techne287-TC-500
Essential 6 Medium (E6)FisherA1516401baza różnicowania 
Medium Essential 8 (E8)FisherA1517001Podstawowe ośrodek hPSC
Mikroskop EVOS FLThermoAMF4300
Serum bydlęce płodoweVWR45000-734
Podstawy FGF (FGF2)Bio-techne233-FB/CF 
GeltrexFisherA1413202Powłoka matrycowa
Roztwór aminokwasów nieistotnych Gibco MEM (100X)Fisher11140050
GlutamaxFisher35050061Zamiennik L-glutaminy 
HeparynaTechnologie komórek macierzystych7980
Histopaque 1077Sigma10771rozwiązanie gradientu gęstości 1 
HolotransferrinSigmaT0665
Czynnik komórek macierzystych człowieka (SCF)Peprotech300-07-100UG
Insulinowy czynnik wzrostu 1 (IGF1)Peprotech100-11-100UG
Interleukina-3 (IL-3)Peprotech200-03-2UG
Kąpiel wodna Isotemp 210Fisher Scientific210
Zastępstwo serum nokautu (KSR)Fisher10828028Bezpłatny suplement FBS 
Kwas L-askorbinowySigmaA4544-100G
LDN193189Stemgent04-0074
L-GlutaminaFisher25030081
LymphoprepTechnologie komórek macierzystych7801Rozwiązanie gradientu gęstości 2
MatrigelCorningCB-40234Powłoka matrycowa
Fibroblasty embrionalne myszyFisherA34964 
Nanogowa poliklonalna koza IgGR& DAF1997-SP
Nunc Biobanking i rurki kriogeniczne do hodowli komórkowejFisher Scientific12-565-163N
Penicylina/StreptomycynaFisher15140122
Oczyszczone przeciwciała anty-Pax-6 dla królika poliklonalnego IgGBiolegenda901301
QBSF-60 Medium Wolne od SerumJakość biologiczna160-204-101EM baza
Medium zamrażające do hodowli komórek do odzyskiwaniaThermo Fisher Scientific12648010Alternatywne medium zamrażające
rhVitronektyna (VTN)FisherA31804
RPMI 1640 MediumFisher11875093
SB431542R& D1614
Wirus Sendai HN Przeciwciało monoklonalne Mysz IgG2aInvitrogen14649482
Selenit soduSigmaS5261
Przeciwciała Sox17 – poliklonalne kozy IgGR& Daf1924
Suplement StemSpan Erythroid ExpansionTechnologie komórek macierzystych2692Alternatywny suplement medium komercyjnego rozszerzającego
StemSpan SFEM II mediumTechnologie komórek macierzystych9605Alternatywne medium komercyjnej ekspansji
Zamrażarka o ultra niskiej temperaturzeThermo Fisher ScientificTSX60086A
Uniwersalne końcówki pipety – filtrowaneVWR76322-132
76322-134
76322-150
76322-156
XAV939Bio-techne3748/10
Y-27632 DihydrochlorekBioGems1293823

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Ray, A., et al. An overview on promising somatic cell sources utilized for the efficient generation of induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 17 (6), 1954-1974 (2021).
  3. Raab, S., Klingenstein, M., Liebau, S., Linta, L. A comparative view on human somatic cell sources for ipsc generation. Stem Cells Int. 2014, 768391(2014).
  4. Sauer, V., et al. Human urinary epithelial cells as a source of engraftable hepatocyte-like cells using stem cell technology. Cell Transplant. 25 (12), 2221-2243 (2016).
  5. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 161-167 (2015).
  6. Quirynen, M., Siawasch, S. aM., Yu, J., Miron, R. J. Essential principles for blood centrifugation. Periodontol 2000. 97 (1), 43-51 (2025).
  7. Perry, J. N., Jasim, A., Hojat, A., Yong, W. H. Procurement, storage, and use of blood in biobanks. Methods Mol Biol. 1897, 89-97 (2019).
  8. Meraviglia, V., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from frozen buffy coats using non-integrating episomal plasmids. J Vis Exp. (100), e52885(2015).
  9. Yang, W., et al. iPSC reprogramming from human peripheral blood using Sendai Virus mediated gene transfer. , Stembook. Cambridge (MA). (2008).
  10. Cerneckis, J., Cai, H., Shi, Y. Induced pluripotent stem cells (ipscs): Molecular mechanisms of induction and applications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 112(2024).
  11. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  12. guidelines on drawing blood: best practices in phlebotomy. , World Health Organization. Geneva. (2010).
  13. Robb, L. Cytokine receptors and hematopoietic differentiation. Oncogene. 26 (47), 6715-6723 (2007).
  14. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3 B 1-A3 B 3 (2015).
  15. Chen, G. Splitting hESC/hiPSC lines with EDTA in feeder free conditions. , Stembook. Cambridge (MA). (2008).
  16. Zeltner, N., Lafaille, F. G., Fattahi, F., Studer, L. Feeder-free derivation of neural crest progenitor cells from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (87), e51609(2014).
  17. Zhang, X., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7 (1), 90-100 (2010).
  18. Lin, Y., Zou, J. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in fully chemically defined conditions. STAR Protoc. 1 (1), (2020).
  19. Technau, U. Brachyury, the blastopore and the evolution of the mesoderm. Bioessays. 23 (9), 788-794 (2001).
  20. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a psc-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  21. Kanai-Azuma, M., et al. Depletion of definitive gut endoderm in sox17-null mutant mice. Development. 129 (10), 2367-2379 (2002).
  22. Kirkeby, A., Main, H., Carpenter, M. Pluripotent stem-cell-derived therapies in clinical trial: A 2025 update. Cell Stem Cell. 32 (1), 10-37 (2025).
  23. Verma, I., Seshagiri, P. B. Current applications of human pluripotent stem cells in neuroscience research and cell transplantation therapy for neurological disorders. Stem Cell Rev Rep. 21 (4), 964-987 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Indukowane pluripotencjalne kom rki macierzysteprzeprogramowanie warstwy leukocytarnejprzeprogramowanie PBMCmorfologia kom rek macierzystychtransdukcja wirusem Sendaimarker pluripotencji NANOGr nicowanie erytroblast wbarwienie immunofluorescencyjneizolacja w gradiencie g sto ciludzkie pluripotencjalne kom rki macierzyste

Powiązane artykuły