Oddychanie podstawowe gleby jako metoda określania wpływu zarządzania glebą i aktywności mikroorganizmów

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół do oceny bazowej respiracji gleby z wykorzystaniem analizatora gazów podczerwieni (IRGA), który umożliwia kontrolowane ciągłe monitorowanie dynamiki CO₂ w glebie w kontrolowanych warunkach i możliwość wykonania powtarzalnej oceny aktywności mikroorganizmów.

Streszczenie

Oddychanie gleby reprezentuje transfer CO₂ z gleby do atmosfery i jest jednym z największych lądowych przepływów węgla po produkcji pierwotnej brutto. Ponieważ jest napędzany w dużej mierze przez aktywność metaboliczną organizmów gleby, jest powszechnie uznawany za wrażliwy wskaźnik aktywności biologicznej gleby, obrotu węgla i wpływu zaburzeń związanych z działalnością człowieka lub zarządzaniem. Oddychanie gleby integruje wiele źródeł CO₂, w tym oddychanie autotroficzne od korzeni roślin i mikroorganizmów ryzosfery oraz oddychanie heterotroficzne związane z rozkładem mikrobiologicznym materii organicznej. Kiedy jest mierzone w braku zewnętrznych substratów lub niedawnych dopływów składników odżywczych, oddychanie mikroorganizmów nazywane jest podstawowym oddychaniem gleby (SBR).

Niniejszy artykuł przedstawia protokół oparty na analizatorze gazów na podczerwień (IRGA) do ilościowego określenia SBR w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Aby wyizolować heterotroficzny składnik przypisany wyłącznie metabolizmowi mikroorganizmów, przepływy CO₂ pochodzenia roślinnego są wykluczone poprzez użycie wstępnie przygotowanych, przesianych i homogenizowanych próbek gleby inkubowanych w znormalizowanych warunkach wilgotności i temperatury, co umożliwia ilościowe określenie kumulatywnej ewolucji C-CO₂ w czasie, zapewniając solidny wskaźnik biomasy mikroorganizmów, ich aktywności i zdrowia gleby. Protokół obejmuje przygotowanie gleby, dostosowanie wilgotności, inkubację w hermetyzowanych pojemnikach, pomiar CO₂ metodą IRGA i obliczenie kumulatywnego oddychania.

W niniejszym badaniu oceniono SBR za pomocą analizatora gazów na podczerwień (IRGA), który umożliwia monitorowanie dynamiki CO₂ w glebie w kontrolowanych warunkach. Wyniki reprezentatywne wykazały, że dodatek kompostu zwiększył oddychanie mikroorganizmów w suchych glebach z Pustyni Tabernas, co wskazuje na silne stymulacje procesów mikrobiologicznych po zastosowaniu poprawki organicznej. Te ustalenia podkreślają przydatność SBR jako wskaźnika wpływu zarządzania glebą na aktywność mikroorganizmów, szczególnie w zdegradowanych środowiskach suchych. Metodologicznie, protokół oparty na IRGA oferuje praktyczne narzędzie do zastosowań badawczych i dydaktycznych związanych z dynamiką węgla w glebie.

Wprowadzenie

Oddycha gleby jest centralnym procesem biogeochemicznym, który obejmuje przepływ dwutlenku węgla (CO₂) z powierzchni gleby do atmosfery. Szacuje się, że jest to drugi co do wielkości przepływ węgla na lądzie po łącznej produkcji pierwotnej¹ i w znacznym stopniu przyczynia się do globalnego cyklu węgla². Ten proces jest kluczowy dla obrotu węgla w ekosystemach lądowych i jest coraz częściej wykorzystywany jako wrażliwy wskaźnik aktywności biologicznej gleby i dynamiki sekwestracji węgla w glebie^3,4.

Oddycha gleby pochodzi z wielu źródeł i jest ogólnie klasyfikowany na dwa główne komponenty biologiczne: oddychanie autotroficzne, pochodzące z metabolizmu korzeni roślin i mikroorganizmów skojarzonych z ryzosphere, oraz oddychanie heterotroficzne, związane z rozkładem mikrobiologicznym materii organicznej w glebie^5,6. Źródła niebiologiczne, takie jak wietrzenie węglanów⁷ i fotodegradacji⁸ mogą również przyczyniać się w określonych warunkach. Aby odizolować heterotroficzny składnik przypisany jedynie do metabolizmu mikroorganizmów, należy wykluczyć przepływy CO₂ pochodzące z roślin.

W tym kontekście oddychanie mikroorganizmów jest definiowane jako produkcja CO₂ lub pobór O₂ przez mikroorganizmy—w tym bakterie, grzyby, pierwotniaki i glony—w wyniku procesów metabolicznych aerobowych lub anaerobowych⁹. Kiedy jest mierzone bez zewnętrznych substratów lub ostatnich dopływów składników odżywczych, oddychanie mikroorganizmów nazywa się oddychaniem podstawowym¹⁰. Oddychanie podstawowe odzwierciedla endogenną aktywność metaboliczną rodzimej społeczności mikroorganizmów i jest często stosowane jako wskaźnik biomasy, aktywności i wrażliwości mikroorganizmów na zaburzenia środowiskowe lub antropogeniczne^11,12.

Aby dokładnie ocenić oddychanie podstawowe, pomiary laboratoryjne są przeprowadzane na przygotowanych, przesiewanych i homogenizowanych próbkach gleby. To wstępne leczenie skutecznie usuwa korzenie i makrofaunę, eliminując oddychanie autotroficzne i umożliwiając skupienie się na heterotroficznej aktywności mikroorganizmów. Chociaż przesiewanie zmienia oryginalną strukturę gleby, poprawia jednorodność i powtarzalność próbek, a także ułatwia badanie procesów sterowanych przez mikroorganizmy w izolacji⁹. Inkubacja jest zwykle przeprowadzana w kontrolowanych warunkach środowiskowych, takich jak 25 °C i 60% pojemności polowej gleby, aby zoptymalizować aktywność mikroorganizmów bez faworyzowania określonych grup funkcyjnych^13,14. W tym kontekście wilgotność gleby i pojemność pola są krytycznymi parametrami, ponieważ oddychanie mikroorganizmów jest bardzo wrażliwe na dostępność wody, która reguluje dyfuzję substratu, dopływ tlenu i metabolizm mikroorganizmów. Z tego powodu pomiary oddychania podstawowego są zwykle wykonywane w znormalizowanych warunkach wilgotności wyrażanych jako proporcja pojemności pola. C-CO₂ ewoluujący w okresie inkubacji jest mierzony jako wskaźnik oddychania podstawowego¹⁵.

Ten protokół jest szczególnie przydatny dla kontrolowanych badań inkubacyjnych w laboratorium, których celem jest ocena aktywności mikroorganizmów poprzez oddychanie podstawowe w przygotowanych glebach. Jest szczególnie przydatny do porównywania gleb poddanych różnym praktykom zarządzania, takim jak stosowanie nawozów organicznych, lub innym zaburzeniom, przy użyciu homogenizowanych próbek w znormalizowanych warunkach temperaturowych i wilgotnościowych. Ponieważ wprowadzone składniki odżywcze pochodzące z roślin są wykluczone, metoda ta jest najbardziej odpowiednia do oceny heterotroficznego składnika oddychania gleby, a nie całkowitego oddychania gleby w warunkach polowych.

Zostało opracowane kilka technik analitycznych do ilościowego określania oddychania gleby, każda z nich różni się pod względem czułości, przepustowości i złożoności operacyjnej^9,16. Klasyczne podejścia obejmują absorpcję alkaliczną z następującą tytulacją, systemy przewodnictwa, chromatografię gazową i analizę gazów na podczerwień. Metody oparte na alkaliach są niezawodne i stosunkowo tanie, ale zapewniają ograniczoną rozdzielczość czasową i mogą być wpłynięte przez niepełne pochłanianie lub wyciek CO₂. Metody przewodnictwa umożliwiają ciągłe pomiary, chociaż mogą być wpłynięte przez temperaturę i siłę jonową. Chromatografia gazowa zapewnia precyzyjne pomiary CO₂ w górnych warstwach powietrza i umożliwia jednoczesne oznaczanie innych gazów, ale wymaga specjalistycznego sprzętu i wyszkolonego personelu, a przepustowość może być ograniczona. Z kolei analizy gazów na podczerwień (IRGA) umożliwiają szybkie i wielokrotne monitorowanie stężenia CO₂ w kontrolowanych warunkach inkubacji, co sprawia, że są szczególnie przydatne do pomiarów

Protokół

1. Przygotowania

1. Zbieranie próbek:
   1. Zbieraj próbki z każdej warstwy gleby lub z głębokości 0-10 cm w przypadku badań powierzchniowych.
      UWAGA: Używaj wysterylizowanych narzędzi i rękawic, aby uniknąć skażenia mikrobiologicznego.
   2. Umieść próbki w torbach izotermicznych i przetransportuj je do laboratorium w schłodzonej walizce.
   3. Jeśli przetwarzanie gleby nie może być wykonane natychmiast, przechowuj próbki w temperaturze 4°C (najlepiej nie dłużej niż 48 godzin).
   4. Pozwól próbkom wyrównać się do temperatury pokojowej przez co najmniej 2 godziny przed przetworzeniem i inkubacją.
2. Przygotowanie materiałów i przetwarzanie gleby:
   1. Dezynfekuj materiały laboratoryjne, zanurzając je w 10% bielinie lub 70% etanolu przez 30 minut, a następnie dokładnie spłucz je wodą destylowaną i pozwól im ostygnąć przed użyciem.
      UWAGA: Używaj rękawic, fartucha laboratoryjnego i okularów podczas pracy z tymi chemikaliami.
   2. Pozostaw próbki w temperaturze pokojowej na 2 godziny w celu stabilizacji.
   3. Przesiej próbki do 2 mm. Usuń korzenie i grubsze zanieczyszczenia za pomocą szczypiec.
   4. Oczyść sito po każdej próbce za pomocą roztworów dezynfekujących i osusz papierowym ręcznikiem.
3. Wyznacz wilgotność gleby (zawartość wody) i pojemność polubowną (woda, którą gleba może zatrzymać)¹⁷.
   1. Obliczenie wilgotności gleby: Wyznacz wilgotność gleby poprzez suszenie w piecu (105°C) 20 g próbki w kapsułce ceramicznej przez 24 godziny¹⁸ [Równ 1].
      [Równ 1]
   2. Wyznacz pojemność polubowną za pomocą urządzenia do pomiaru ciśnienia membrany “Richards”¹⁹.
      1. Umieść próbki gleby na ceramicznych płytkach urządzenia, ograniczonej plastikowymi pierścieniami.
      2. Dodaj wodę destylowaną aż do nasycenia i pozostaw przez co najmniej 24 godziny. Następnie zastosuj ciśnienie -0,33 bara (-33 kPa) przez kolejne 24 godziny. Następnie ponownie określ wilgotność gleby zgodnie z Równaniem 1.
4. Wyznacz gęstość gleby (g·mL^-1). Naleć wagę gleby suszonej w piecu do naczynia o znanej i ważonej pojemności i odnotuj wagę gleby. Gęstość gleby jest współczynnikiem wagi/objętość naczynia.
5. Przygotowanie próbek do inkubacji:
   1. Ustaw temperaturę inkubatora na 25 °C. Norma UNE-EN ISO 16072:2002 (Jakosł gleby: Metody laboratoryjne do określania oddychania mikroorganizmów, https://www.iso.org/standard/32096.html) sugeruje temperaturę na potrzeby porównania między badaniami).
   2. Oszacuj warunki wilgotności: Oblicz objętość destylowanej wody wymaganej dla każdej próbki, aby osiągnąć 60% pojemności polubownej z początkowej zawartości wilgotności gleby^20,21. Będzie to poziom wilgotności na początku eksperymentu i nie będzie potrzeby dostosowywania wilgotności podczas okresu inkubacji.
   3. Wybór ilości gleby: Ilość użytej gleby może się różnić w zależności od zawartości materii organicznej (im wyższa zawartość materii organicznej, tym mniej gleby jest potrzebne do eksperymentu)²¹. Jednakże sugeruje się 20 g jako referencyjną ilość.
   4. Umieść próbki w 100 ml szklanych probówkach i dodaj destylowaną wodę aż do 60% wilgotności procentowej pojemności polubownej. Uszczelnił probówki septum i umieść je w inkubatorze.

2. Pomiary stężenia CO₂

1. Przedział pomiarowy:
   1. Przeprowadź pomiary CO₂ w wybranych przedziałach czasowych zgodnie z oczekiwaną szybkością oddychania gleby, aby uniknąć nadmiernego nagromadzenia CO₂ w górnej części probówki.
   2. Unikaj stężeń wyższych niż 10% (100 000 ppm), aby zapobiec hamowaniu aktywności mikroorganizmów. Skróć przedziały pomiarowe, jeśli stężenia przekraczają ten próg. Przeprowadzaj pomiary codziennie w pierwszym tygodniu i co 3 lub 4 dni później w przykładzie przedstawionym poniżej.
2. Pomiar stężenia CO2 (%) z pomocą analizatora gazu z górnej części probówki o podczerwieni (IRGA)
   1. Skalibruj IRGA przed każdą sesją pomiarową zgodnie z instrukcjami producenta lub za pomocą zera standardowego (powietrze bez CO₂ lub azot) i przynajmniej jednego standardu rozpiętości o znanym stężeniu CO₂ w zakresie pomiarowym. Zweryfikuj stabilność urządzenia i skoryguj przesunięcie linii bazowej zgodnie z instrukcjami

Wyniki

Wyniki przedstawione w tym artykule dotyczą jednego eksperymentu, w którym ubogie gleby żyzne zostały poprawione kompostem w celu zwiększenia parametrów żyzności i aktywności mikrobiologicznej. Oryginalne gleby były badane w “Pustyni Tabernas” (południowo-wschodnia Hiszpania), regionie o klimacie półpustynnym i słabo rozwiniętymi glebowo²². Przez około 40 kg górniego 30 cm jednego pola rolniczego pobrano próbki, zabrano do laboratorium i przesiewano na 2 mm, aby uzyskać frakcję gleby drobnej. To z...

Dyskusja

Oddychanie gleby jest wrażliwym wskaźnikiem aktywności mikrobiologicznej i rozkładu materii organicznej, dostarczając cenne informacje na temat wpływu zarządzania glebą ^23,24. Opisany w tym artykule podejście eksperymentalne zapewnia prostą i mocną ramę do ilościowego określenia aktywności mikrobiologicznej gleby poprzez pomiary emisji CO₂ w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych²⁵, i zostało oparte i zaktualizowane na podstawie pracy Ga...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2 mm sito
Hermetyczne kolby lub fiolki z septum (100 mL)
Waga analityczna
Ekstraktory z płytą ciśnieniową	Soil Moisture Equipment Corp, Goleta, CA, USA	1600F1	Do obliczenia pojemności polowej
Dejonizowana woda lub woda destylowana wysterylizowano
Wyposażenie inkubatora	VWR Inc. Radnor, PA, USA	IL 250R PREMIUM
Nieścieralny marker
Mikrokomputer IRGA CO2 koncentracji	Ametek Inc. Berwin, PA, USA	CheckMate 4	https://www.ametekmocon.com/products/headspacemapgasanalyzers/checkmate-4
Torby i pudełko termoizolacyjne			Do transportu gleby do laboratorium
Piec laboratoryjny			Musi pozwalać na ustawienie 105ºC
Komora laminarna	CRUMA	HZ-1	Opcjonalnie w kroku 2.3
Zatyczka septum do szczelnego uszczelnienia fiolek
Próbki gleby			Zbierane w sposób reprezentatywny z obszaru, który ma być badany.
Środki sterylizujące			Można użyć wybielacza (10%) lub alkoholu (70%)