Wykorzystanie roztworu NMR do charakteryzacji kondensatów biomolekularnych w warunkach bifazowych

Podsumowanie

Przedstawiamy protokoły dla metodologii NMR, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) oraz CONdensate DEtectioN za pomocą SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT), które umożliwiają bezoznakową, ilościową charakterystykę kondensatów biomolekularnych w warunkach bifazowych, ujawniając podział molekularny, dynamikę wymiany, hydratację kondensatu oraz strukturę kropli bez osadu czy oznakowania.

Streszczenie

Biomolekularne kondensaty powstałe w wyniku separacji fazy ciecz-ciecz (LLPS) organizują środowisko wewnątrzkomórkowe i regulują różnorodne procesy biochemiczne. Pomimo ich znaczenia, badanie składu kondensatu, dynamiki wymiany i wewnętrznej organizacji pozostaje wyzwaniem, zwłaszcza bez zewnętrznych tagów. Spektroskopia rezonansu magnetycznego jądrowego (NMR) może zapewnić unikalne, wolne od oznakowania okno na te mezoskalowe zespoły, rejestrując zarówno ruch molekularny, jak i heterogeniczność środowiskową. Dwie komplementarne metody NMR umożliwiają kompleksową charakterystykę kondensatów bezpośrednio w ich stanie bifazowym. Dla kondensatów na tyle dynamicznych, by można je było zaobserwować za pomocą NMR, podejście dyfuzyjne-wymienne, REstricted DIffusion of INvisible speciEs, w skrócie REDIFINE, wykorzystuje kontrast dyfuzji z wymianą chemiczną do ilościowego określenia ułamku cząsteczek podzielonych na fazę skondensowaną i rozcieńczoną, określenia wielkości kropli i przepuszczalności interfejsu oraz wyodrębniania szybkości wymiany cząsteczkowej przez granicę fazową. Dla bardziej sztywnych kondensatów, które są niewidoczne NMR, metoda transferu magnetyzacji półstałej wykrywanej przez wodę, CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer, czyli w skrócie CONdense-MT, wykorzystuje kontrast relaksacyjny i wymianę protonów między skondensowanymi biomolekułami a rozpuszczalnikiem w fazie rozcieńczonej do monitorowania kondensatów na protonach wody, zapewniając dostęp do względnego podziału, prędkości molekularnego tumblingu, dynamiki hydratacji oraz zawartości wody związanej. Razem te podejścia zapewniają wielowymiarowy, ilościowy obraz struktury i dynamiki kondensatu w warunkach niemal natywnych bifazowych, bez znaczników fluorescencyjnych czy detekcji. Ich integracja poszerza narzędzia NMR do badania separacji fazowej biocząsteczek i tworzy podstawy do łączenia fizykochemicznych właściwości kondensatu z ich biologiczną funkcją i patologiczną nieregulacją.

Wprowadzenie

Komórki osiągają swoją niezwykłą organizację przestrzenną i czasową poprzez dzielenie się reakcji biochemicznych ^1,2,3. Oprócz organelli otoczonych błoną, wiele kluczowych procesów komórkowych zachodzi w bezbłonowych przedziałach utworzonych przez separację faz ciecz–ciecz (LLPS) białek i kwasów nukleinowych⁴. Te dynamiczne zespoły, często nazywane kondensatami biomolekularnymi, obejmują jądro, granulki stresujące, plamki jądrowe oraz ciała przetwarzające, które odgrywają istotne role np. w metabolizmie RNA, regulacji transkrypcji czy transdukcji sygnału ^5,6. Ich zdolność do formowania, rozpuszczania i wymiany składników w odpowiedzi na sygnały środowiskowe zapewnia komórkom wszechstronny mechanizm organizacji aktywności biochemicznej bez polegania na błonach lipidowych.

Duży podzbiór kondensatów biomolekularnych powstaje z białek wiążących RNA (RBP), które zawierają wewnętrzne obszary nieuporządkowane (IDR) oraz domeny wiążące RNA (RBD)^7,8. Białka te mogą fazować separację samodzielnie lub w złożeniu z RNA, tworząc kondensaty o różnorodnych właściwościach materiałowych i funkcjach biologicznych. Na przykład białko nukleokasydowe SARS-CoV-2 (N) tworzy biomolekularne kondensatory^RNA-9, które są powiązane z pakowaniem i składaniem genomu wirusa, podczas gdy białko wiążące drogę polipirymidynową 1 (PTBP1) tworzy kondensatory jądrowe, które przyczyniają się do wyciszania genu¹⁰. Ponadto białka takie jak FUS i DDX4 podlegają LLPS napędzanym przez ich nieuporządkowane obszary, co wpływa na metabolizm RNA i tworzenie ziaren stresowych^11,12. Zaburzenia regulacji tych procesów są związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak stwardnienie boczne zanikowe (ALS) oraz otępienie czołowo-skroniowe, gdzie nieprawidłowe przejścia fazowe mogą prowadzić do agregacji i utraty funkcji¹³.

Kondensacja nie ogranicza się do białek i kompleksów białko-RNA. Samo RNA może podlegać LLPS, szczególnie w kontekście sekwencji powtarzających się ekspansji związanych z kilkoma chorobami neurodegeneracyjnymi^14,15. Rozszerzanie się trinukleotydów i heksanukleotydów, takie jak CAG w chorobie Huntingtona czy CUG w dystrofii miotonicznej, mogą tworzyć kondensatory przypominające krople zarówno in vitro, jak i w komórkach¹⁴. Zrozumienie fizycznych podstaw kondensacji RNA, a także tego, czym różni się ona od kondensatów napędzanych przez białka i białka RNA, jest kluczowe dla wyjaśnienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw chorób powtarzających się ekspansji.

Pomimo ich biologicznego znaczenia, ilościowa i bezoznakowa charakterystyka kondensatów biomolekularnych pozostaje ogromnym wyzwaniem¹⁶. Konwencjonalne techniki mikroskopii fluorescencyjnej i spektroskopii opierają się na zewnętrznych etykietach, które mogą zakłócać strukturę, dynamikę lub zachowanie fazowe biomolekuły^17,18. Ponadto niektóre kondensaty są niewidoczne NMR ze względu na ograniczony ruch molekularny i szerokie kształty linii, co ogranicza dostęp do informacji tradycyjnych metod NMR. W związku z tym pilnie potrzebne są eksperymentalne strategie, które pozwolą badać kondensatory bezpośrednio w ich bifazowym, natywnym stanie, bez oznakowania. Biorąc pod uwagę ważną rolę granicy fazy kropli w procesach wymiany i dojrzewaniu kondensatu, równie istotne jest stabilizowanie kropelek biomolekularnych w danej objętości próbki, zapobiegając tym samym sedymentacji fazy gęstej. Można to łatwo osiągnąć za pomocą hydrożeli agarozowych naśladujących cytoszkielet.

Najnowsze rozwiązania w metodologiach opartych na NMR dostarczają takiego rozwiązania. Podejście REDIFINE (REstricted DIffusion of INvisible speciEs)¹⁹ łączy dyfuzyjne NMR z analizą wymiany chemicznej, aby ilościowo określić podział cząsteczki, kinetykę wymiany oraz wielkość kropli w białkach i kondensatach białk–RNA. Uzupełniająco^technika CONDENSE-MT (CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer) wykrywa kondensaty niewidoczne NMR za pomocą transferu magnetyzacji wodnej, umożliwiając ilościowe określenie ilości skondensowanej materii w określonych warunkach oraz dalsze ujawnianie dynamiki hydratacji oraz prędkości molekularnego przewracania się w kondensacie. Razem te metody umożliwiają badania bezznakowe, nieinwazyjne różnorodnych typów kondensatów, kondensatów opartych wyłącznie na białkach, białk–RNA oraz wyłącznie RNA w warunkach równowagi dwufazowej. Rozszerzając zestaw narzędzi NMR, otwierają drzwi do systematycznych, ilościowych badań struktury, dynamiki kondensatu oraz ich powiązań z funkcją biologiczną i chorobą.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Wybór buforu: Używaj przetestowanych buforów, w których biomolekuły są najbardziej stabilne.
   UWAGA: Sygnały NMR są zazwyczaj silniejsze przy niższym pH. Jako wymóg techniczny, należy dodać 5%_D2O jako blokadę pola do wszystkich próbek NMR (końcowa v/v).
2. Stabilizuj próbkę bifazową, używając hydrożelu naśladującego cytoszkielet agarozy jako medium. Zważ proszek agarozowy, aby przygotować bulion agarozowy o stężeniu 1,5% (w/v) w tym samym buforze. Stosuj zwykłą agarozę jako tańszą alternatywę dla biomolekularnych kondensatów tworzonych przez białka wewnętrznie nieuporządkowane (IDP) oraz RNA, które mogą wytrzymać wyższe temperatury. Używaj niskotopniącej agarozy przy przygotowywaniu delikatnych kondensatów zawierających białka zawierające fałdowane domeny¹⁹.
3. Przygotowanie bulionu agarozowego: Podgrzej zawiesinę do ok. 80 °C przez 10 minut i całkowicie rozpuszcz agarozę przez mieszanie lub wirowanie.
   UWAGA: Stopiona agaroza jest gorąca i może się spalić; Rękawiczki odporne na ciepło.
   UWAGA: Utrzymuj stopioną agarozę w cieple (np. 55 °C dla zwykłej agarozy i 37 °C dla niskotopniącej agarozy) w kąpieli wodnej, aby pozostała ciekła przed wymieszaniem z próbką biologiczną.
   Stopiona agaroza może być ogrzewana przez kilkadziesiąt minut^19,21.
4. Przygotuj ostateczną próbkę bifazową:
   1. Aby przygotować próbkę bifazową stabilizowaną przez hydrogel agarozowy, wymieszaj zapasy białka (i/lub RNA) z odpowiednim ciepłym buforem agarozowym w mikrowirówce o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Końcowe stężenie białka/RNA wynosi zazwyczaj 50-500 μM, aby było odpowiednie do detekcji NMR.
   2. Natychmiast przelej mieszankę do rurki NMR o średnicy 3 mm za pomocą długiej szklanej pipety. Pozwól agarozie zastygnąć niedługo po transferze.
      UWAGA: Bez agarozy próbka dwufazowa osiada się z czasem, co komplikuje pozyskiwanie i analizę danych NMR, ponieważ próbka fizycznie zmienia się w skali czasowej eksperymentu.
5. Przeprowadz inspekcję wizualną: Sprawdź próbkę wizualnie. Jeśli następuje separacja fazowa, próbka natychmiast wydaje się mętna i pozostaje taka. Wskazuje to, że próbka bifazowa została pomyślnie ustabilizowana w agaroze.
6. Planując uruchomić CONDENSE-MT, przygotuj dodatkową agarozową próbkę referencyjną, wykonując te same kroki, tylko pomijając dodawanie biocząsteczki. Zamiast tego dodaj bufor, aby uzyskać tę samą objętość próbki. Przygotuj tę próbkę dopiero po przygotowaniu próbki kondensatu i zmierzeniu wszystkich danych na niej, aby upewnić się, że agarozowa próbka referencyjna nie będzie inkubowana przez dłuższy czas.

2. Rejestrowanie eksperymentów REDIFINE

1. Blokuj, podkładaj, dopasuj i dostrojaj kanał ¹H jak zwykle. Skalibruj długość impulsu 90° na ¹godzinę, stosując ogólną procedurę.
2. Nagraj jednowymiarowe widmo z tłumieniem wody. Idealnie obserwuje się silny sygnał biomolekularny (Rysunek uzupełniający 1A).
   1. Jeśli sygnał nie jest zaobserwowany lub jest bardzo słaby, załóżmy, że skondensowane białko/RNA nie jest obserwowalne NMR, a podział do fazy skondensowanej jest wysoki. W takim przypadku nie kontynuuj stosowania REDIFINE, ponieważ ta metoda opiera się na obserwowalnym sygnale biomolekularnym.
   2. W takiej sytuacji zasadniczo eksperymenty CONDENSE-MT powinny działać bardzo dobrze, więc natychmiast przejdź do kroku 4 (Rejestracja eksperymentów CONDENSE-MT).
3. Załaduj konwencjonalny eksperyment Diffusion Ordered Spectroscopy (DOSY), który opiera się na konwencjonalnej procedurze 2D Stymulowanego Echa z użyciem gradientów bipolarnych (sekwencja impulsów Brukera: stebpgp1s19). Szczegóły znajdziesz w instrukcjach obsługi Bruker DOSY i Diffusion.
4. Ustaw P0, P1 i P27 na skalibrowaną długość impulsu 90°. Ustaw jako zasadę: NS na 32 skany, DS na 16, TD1 na 16, a TD2 i SW2 dostosuj tak, aby uzyskać czas akwizycji AQ na poziomie 80-100 ms. Ustaw d1 na 1,5 s.
   UWAGA: Gradienty powinny być odpowiednio skalibrowane.
5. Optymalizuj opóźnienie Watergate d19 jak zwykle zgodnie z polem magnetycznym, aby uzyskać maksymalne wzbudzenie przy aromatach (ok. 7 ppm) lub alifatycznych (ok. 1 ppm). Ustaw d20 na 75 ms. Wybór p30 zależy od wielkości białka/RNA. Dla białek >20 kDa użyj 5 ms; Dla mniejszych białek stosuj zasadę 3,5 ms.
6. Nagraj eksperyment DOSY za pomocą polecenia: 'xau dosy 2 95 16 l y y', które układa siłę gradientu dyfuzji od 2 do 95% w 16 krokach, w sposób liniowy.
   1. Idealnie należy obserwować początkowy zanik sygnału pochodzącego z fazy rozcieńczonej, podczas gdy zanik sygnału fazy skondensowanej powinien się stabilizować (Rysunek 1A i Ilustracja Uzupełniająca 1B).
7. Aby kontynuować pozyskiwanie danych dla pełnego zestawu REDIFINE, stwórz 9 nowych stebpgp1s19, kopiując parametry z pierwotnego, który właśnie uruchomiłeś. W każdym kolejnym eksperymencie zmieniaj tylko opóźnienie dyfuzji d20 w zmiennych krokach, aby obejmowało zakres od 100 do 1000 ms (czyli 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 1000 ms).
8. Każdy z tych eksperymentów wykonuj komendą 'xau dosy 2 95 16 l y n'. Ostatnie "n" zapewnia, że wzmocnienie odbiornika jest zachowane przez całe 10 eksperymentów.

3. Przetwarzanie zbiorów danych REDIFINE i wizualizacja wyników

1. Przetworz każdy eksperyment (łącznie 10) w następujący sposób:
   1. Ustaw qsine SSB 2 jako funkcję okienną, wyodrębnij^5-ty fragment za pomocą qsin; fp, fazuj 1D i zapisuj parametry fazowania w zbiorze danych 2D.
   2. Następnie przetwarzam 2D z xf2, wykonuję korekcję linii bazowej abs2 i wyodrębniam te 16 fragmentów za pomocą split2D (dalsze dane w oknie wyskakującym: r – 16 – 11). Pozwoli to wyodrębnić 16 widm uzyskanych przy użyciu różnych gradientów i zapisać je jako eksperymenty przetworzone 1D od 11 do 26 w tym samym zbiorze danych.
   3. Powtórz to samo dla pozostałych 9 eksperymentów. Czasami kluczowe jest sprawdzenie przynajmniej pierwszych 4-5 przekrojów, aby upewnić się, że fazowanie i korekta bazowa są poprawne. W razie potrzeby popraw to ręcznie – dobre fazowanie i punkt odniesienia są warunkiem prawidłowego ilościowania (Rysunek 1B).
2. Do analizy wykorzystaj udostępniony LLPS_REDIFINE_fit kodu Matlab (Rysunek Uzupełniający 2A). W kodzie dostosuj do swoich eksperymentów następujące rzeczy: 'Delta' (dyfuzja czasów d20), 'P.d' (całkowity czas trwania gradientu 2*p30), exp(1,:) do exp(10,:) na podstawie # przeprowadzonych eksperymentów. Następnie ustaw P.G zgodnie z siłą gradientu sondy (dostępną w folderze eksperymentów TopSpin w pliku "difflist").
3. Dostosuj "folder" i "ścieżkę" w zależności od lokalizacji danych. Uruchom kod do linii 40. To da ci przekroj 1D – stąd wybierz regiony integracyjne; Powinny one obejmować substancje aromatyczne lub alifatyczne i wybierać obszar jak najwęższy, aby nie uwzględniać różnych grup molekularnych, takich jak amidy.
4. Wprowadź granice całkowania w punktach zmiennych 'lewo' i 'prawo' odpowiednio (Ilustracja uzupełniająca 2A). Służy to integracji danych do analizy ilościowej (rysunek 1C). Wybierz nazwę macierzy na podstawie próbki, daty wykonania i szczegółów eksperymentalnych.
5. Uruchom cały kod. W 'fit0' możesz wybrać parametry początkowe, których funkcja optymalizacji użyje do zainicjowania minimalizacji. Zacznij od wartości domyślnych, a jeśli zbieżność nie zostanie osiągnięta, zmieniaj drugą wartość fit0 (populację w fazie skondensowanej) krokami 0,1 z 0,1 na 1.
   UWAGA: Czasami zbiór danych ma kilka lokalnych minimum i trzeba znacznie zmienić parametry początkowe, aby zacząć zbiegać do bardziej globalnego minimum.
6. Po osiągnięciu satysfakcjonującego dopasowania, wartości dopasowania są zapisywane w obrębie rysunku (Rysunek 1D i Dodatkowy Rysunek 2B) i można je znaleźć w zmiennej 'dopasowanie'. Dodatkowo wykreśl te parametry jako wykres statystyczny dla lepszej wizualizacji.

4. Rejestrowanie eksperymentów CONDENSE-MT

UWAGA: Celem eksperymentu jest pośrednie wykrycie kondensatów poprzez ich obserwację sygnału wody rozpuszczalnika za pomocą wymiany protonów²⁰. W eksperymencie CONDENSE-MT pobierany jest i analizowany profil MT z odciskiem palca (Rysunek 2A)²⁰.

1. Nagraj swoje ulubione jednowymiarowe widmo z tłumieniem wody. Jeśli sygnał jest bardzo ograniczony, bardzo prawdopodobne jest, że eksperyment CONDENSE-MT zadziała bardzo dobrze.
2. Ilościowa analiza CONDENSE-MT wymaga wcześniejszego określenia przepływu wody R1. Określ szybkość_R1 za pomocą odzyskiwania inwersji_T1 . Skopiuj dostarczoną sekwencję impulsów, zestaw parametrów Brukera oraz listę vd do odpowiednich folderów. Załaduj zestaw parametrów "T1_inversion_recovery" i dostosuj moc oraz częstotliwości do spektrometru NMR (zgodnie z "edprosol").
   1. Skalibruj impuls 1H 90° (p1), ustaw NS na 2, DS na 0, d1 na 20 s, SW na 10 ppm, TD2 na 16k i TD1 na 24 (długości skorygowanej listy VD). Włącz słaby gradient wzdłuż Z (GPZ0 = 0,1 %), aby uniknąć efektu tłumienia promieniowania.
3. Dla eksperymentu CONDENSE-MT,
   1. Skopiuj dostarczony zestaw parametrów Brukera, sekwencję i listę częstotliwości do folderów specyficznych dla Brukera, załaduj zestaw parametrów "CONDENSE-MT" i dostosuj częstotliwości oraz moce zgodnie ze spektrometrem.
   2. Ustaw P1 na skalibrowaną długość impulsu 90°, a P4 na 1 μs dla impulsu wzbudzającego, aby uniknąć tłumienia promieniowania. Ustaw NS na 2, DS na 16, d1 na 4 s, SW2 na 20 ppm, TD2 na 8k, TD1 na długość listy częstotliwości (zazwyczaj 46). Ustaw SPNAM10 na Squa100.1000, a czas trwania p10 do 5 s.
   3. Znajdź moc SP10, która daje napromieniowanie 100 Hz (komenda 'pulse 100 Hz' obliczy moc zarówno w watach, jak i dB). Odpowiednio dostosuj moc impulsu napromieniowania SP10 i przeprowadź ten pseudo-2D eksperyment za pomocą komendy 'zg'.
      UWAGA: Eksperyment wykorzysta dostarczoną listę częstotliwości, która obejmuje przesunięcia napromieniowania od rezonansu z wodą do bardzo odległego rezonansu (100000 Hz), aby wykryć sygnał wody przy różnych przesunięciach napromieniowania (Rysunek 2B). Wykres całek wodny (zapewnienie prawidłowego fazowania widm; Rysunek 2C) względem przesunięcia napromieniowania daje profil CONDENSE-MT pokazany na Rysunku 2A.
4. Stwórz 7 nowych eksperymentów i w każdym kolejnym zwiększ jedynie moc napromieniowania, aby pokryć zakres od 170 Hz do 1000 Hz (czyli 170, 250, 330, 500, 650, 780, 1000 Hz). W każdym eksperymencie używaj polecenia z poprzedniego punktu. Dla każdej mocy nasycenia zostanie uzyskana cała lista offsetów (rysunek 2D).
   UWAGA: dopasowanie kondensowanego MT wymaga danych referencyjnych uzyskanych na próbce zawierającej wyłącznie agarozę (medium bez kondensatów biomolekularnych). Zapewnij ten sam odstęp czasu między przygotowaniem próbki a pozyskaniem danych oraz zgromadzić ten sam zestaw danych 8 eksperymentów na agarozowej próbce referencyjnej. Ma to zapewnić, że zarówno agarozowa próbka referencyjna, jak i bifazowa były inkubowane przez ten sam czas.

5. Przetwarzanie zbiorów danych CONDENSE-MT i wizualizacja wyników

1. Przetworz każdy eksperyment CONDENSE-MT (łącznie 8, Rysunek Uzupełniający 3A) w następujący sposób.
   1. Ustaw qsine SSB 2 jako funkcję okna, wyodrębnij^46-ty fragment za pomocą qsin; fp, fazuj szczyt wody w 1D, zapisz parametry fazowania w zbiorze danych 2D, następnie przetwarzaj 2D za pomocą xf2 i wyodrębniaj te 46 fragmentów za pomocą split2D (dalsze dane w oknie wyskakującym: r – 46 – 11).
      UWAGA: Wyodrębni to 46 widm 1D uzyskanych przy użyciu różnych przesunięcia napromieniowania i zapisze je jako eksperymenty przetworzone 1D od 11 do 56 w tym samym zbiorze danych (Ilustracja uzupełniająca 3A, pokazana dla eksperymentu 1000 Hz CONDENSE-MT).
   2. Powtórz to samo dla pozostałych 7 eksperymentów. Sprawdź kilka fragmentów z każdego eksperymentu, aby upewnić się, że fazowanie i punkt odniesienia są poprawne (Rysunek 2C). Jeśli trzeba, popraw ręcznie – dobre fazowanie i punkt odniesienia są warunkiem prawidłowego ilościowania!
2. Powtórz te same kroki na danych uzyskanych z agarozowej próbki referencyjnej oraz w eksperymentach z odzyskiem inwersji, wyodrębniając 24. fragment do fazowania i używając split2D (r – 24 – 11).
3. Dopasowuj pozyskane dane za pomocą dostarczonego kodu Matlab. Postępuj zgodnie z konkretnymi instrukcjami w scenariuszu.
4. Najpierw przeprowadź analizę dopasowania dla agarozowej próbki referencyjnej, aby uzyskać parametry tła w przypadku braku kondensatów. Kod read_CONDENSE_MT_data najpierw odczytuje przetworzone dane NMR i integruje sygnał rezonansu wody w jednowymiarowych fragmentach generowanych przez polecenie split2D (Ilustracja uzupełniająca 3B).
5. Ustaw granice całkowania indywidualnie; w Matlabie zostanie wykreślony referencyjny 1D widmo do oceny granic całkowania (Ilustracja Dodatkowa 3C). Kod dodatkowo znormalizuje dane i dopasowuje znormalizowane całki wody w funkcji offsetu i mocy napromieniowania do modelu^{CONDENSE-MT 20}. read_CONDENSE_MT_data przechowuje znormalizowane całki w zmiennej integral_water_real_all, która następnie służy do dalszego dopasowania.
6. Określ szybkość relaksacji wody_R1 w obecności agarozy lub kondensatów przed dopasowaniem danych CONDENSE-MT.
   UWAGA: Dopasowywanie eksperymentu do odzyskiwania inwersji wody można wykonać w pierwszej sekcji skryptu CONDENSE-MT_full Matlab (lub skryptu CONDENSE_MT_referenceMTpool w przypadku danych referencyjnych agarozy). Można wprowadzić nazwę pliku i ścieżkę eksperymentu, a także ID eksperymentu, aby uruchomić skrypt Matlab Inversion_Recovery (Rysunek Uzupełniający 4A, sekcja 1). W razie potrzeby można w tym skrypcie dostosować liczbę jednowymiarowych wycinków oraz granice całkowite; to drugie zależy od parametrów przetwarzania używanych w TopSpin. Ta sekcja określi przepływ wody R1 i przechowuje ją w zmiennej P.R1w , która jest wymagana do późniejszego dopasowania danych CONDENSE-MT.
7. Dla danych agarozowych użyj znormalizowanych całek prostych do dopasowania, używając skryptu CONDENSE_MT_referenceMTpool (który wywołuje funkcję function_1MT .
8. Do ilościowego określenia kondensatu użyj dopasowanych parametrów agarozy jako danych do globalnego dopasowania danych uzyskanych na próbce skondensowanej (Rysunek uzupełniający 4A). To ustali właściwości fizyczne siatki agarozowej jako stałe wartości dopasowania, umożliwiając ilościowe określenie kondensatowego efektu kondensatu osadzonego w siatce agarozowej (rysunek 2E).
9. Wykonaj kwantyfikację kondensatu za pomocą skryptu CONDENSE-MT_full , który wywołuje funkcję function_2MT Matlab. Parametry początkowe optymalizacji obliczeniowej są dane za pomocą fit0 (Ilustracja uzupełniająca 4B). Niepewność parametrów dopasowania zostanie obliczona za pomocą macierzy Jacobia, z której wyprowadzona będzie macierz wariancja-kowariancja (Rysunek uzupełniający 4B).
10. Oceń jakość dopasowania na podstawie odchylenia dopasowania, przypominającego resztkowe odchylenie prognozy modelu od danych eksperymentalnych. Aby uzyskać dalszą kontrolę jakości, wyrysuj dopasowanie razem z danymi eksperymentalnymi (Rysunek Uzupełniający 4C).

Wyniki

Opisany tutaj protokół LLPS REDIFINE został zastosowany do domeny N-terminalowej FUS (NTD). FUS NTD łatwo oddziela się fazą w warunkach otoczenia przy stężeniach mikromolowych^19,21. Ta konkretna próbka została przygotowana w stężeniu 200 μM w buforze HEPES o pojemności 30 mM zawierającej 200 mM KCl przy pH 7,5, z 0,5% regularną agarozą. Po separacji fazowej sygnały FUS NTD pozostają widoczne w fazie skondensowanej (Rysunek 1A,B). To czyni go idealnym kandydatem do badania LLPS REDIFINE. Większość białek podatnych na LLPS zawiera długie, wewnętrznie nieuporządkowane obszary, które zwykle pozostają widoczne w fazie skondensowanej; jednak w bardziej ustrukturyzowanych białkach tak nie jest.

Dopasowanie REDIFINE (Rysunek 1D i Rysunek 3A,B) ujawniło wiele unikalnych parametrów dla tej próbki FUS NTD. Konkretnie określał współczynniki dyfuzji w fazie rozcieńczonej i skondensowanej (D_dil i D_cond), populację białka w fazie skondensowanej (ν_cond), średnią wielkość kropli R oraz przepuszczalność międzyfazową p. Wielkość kropli i przepuszczalność definiują przepływ wymiany między fazami od fazy skondensowanej do rozcieńczonej k_cd=3p/R, co pozwala uzyskać informacje o dynamice wymiany¹⁹.

Wyniki te można wizualizować na różne sposoby (Rysunek 3B). Za pomocą wykresu pająka można porównywać wyniki w różnych warunkach lub próbkach. Z drugiej strony, parametry REDIFINE można obrazowo przedstawić w modelu, aby najskuteczniej je zobrazować. Należy zauważyć, że REDIFINE udostępnia wszystkie te wyniki bez etykiet w ciągu zaledwie kilku godzin, używając tylko jednej próbki.

Ponieważ sygnał NMR FUS NTD pozostaje wykrywalny w fazie skondensowanej (rysunek 3C), CONDENSE-MT najprawdopodobniej nie będzie odpowiedni ze względu na brak kontrastu relaksacyjnego. Zarejestrowaliśmy zestaw danych CONDENSE-MT na FUS NTD i rzeczywiście nie zaobserwowano różnicy w profilu MT między agarozową próbką referencyjną a bifazową FUS NTD (Rysunek 3C). To sprawia, że metodologia CONDENSE-MT nie jest stosowalna do tej konkretnej próbki FUS NTD.

Jednak CONDENSE-MT zapewnia dynamiczną charakterystykę kondensatów RNA powtarzających się ekspansji (rysunek 3C,D)²⁰. Należy zauważyć, że CONDENSE-MT może dostarczyć wielu parametrów unikalnie charakteryzujących RNA w fazie skondensowanej (rysunek 3D), mimo że jego sygnał jest nieobserwowalny w konwencjonalnym NMR (rysunek 3C). Uzyskane parametry to kinetyka wymiany protonów między kondensatem a wodą objętą (_{kondensat k, H2O} i_{k, H2O, kondensat),} szybkość relaksacji_T2 kondensatu (_{T2, kondensat}), odzwierciedlająca zakres dynamicznego zatrzymania biomolekuł podczas kondensacji, oraz pozorna szybkość R₂ wody objętej (R_{2, woda}). Ten ostatni parametr to liniowa kombinacja prędkości przewracania się wody masowej, rozcieńczonej oraz powoli skondensowanej wody. Wyższe wartości wody R_2,wskazują na większą populację wody w kondensacie, co podnosi pozorny ogólny poziom wody R₂₀ (Rysunek 2E i Rysunek 3D).

DOSTĘPNOŚĆ DANYCH I KODU

LLPS REDIFINE surowe dane i kody przetwarzające są dostępne w repozytorium Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787 . Surowe dane CONDENSE-MT oraz kody przetwarzające zostały zdeponowane do repozytorium Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697. Do przetwarzania jest wymagany MATLAB. Są one również dostępne w tym artykule (Dodatkowe pliki kodujące).

Rysunek 1: Workflow REDIFINE. (A) Pomiary dyfuzji dają złożone dwufazowe krzywe rozpadu dyfuzji w próbkach skondensowanych. Powstały rozpad zawiera zdekonvolwowane parametry opisujące współczynniki dyfuzji gatunków w fazie skondensowanej i rozcieńczonej, ich populacje, wielkość kropli oraz współczynnik wymiany między fazami. (B) Aby zdekodować te izolowane parametry, należy zarejestrować pseudo-3D zbiór danych poprzez zmianę nie tylko siły gradientu, ale także opóźnień dyfuzji. Dla ilościowego określenia absolutnie niezbędne jest, aby każdy fragment tych pomiarów był odpowiednio fazowany i koregowany bazowo. (C) Po sprawdzeniu jakości zmierzonych i przetworzonych danych, te jednowymiarowe fragmenty są wprowadzane do kodu MATLAB do analizy i końcowego wykresu. (D) Dane są następnie dopasowywane przez solver programowania nieliniowego. Parametry dopasowania i otrzymania zostały zilustrowane dla bifazowej próbki FUS NTD. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Workflow CONDENSE-MT (A) Unikalny profil CONDENSE-MT zaobserwowany na rezonansie wodnem ilustrujący rozszerzenie spowodowane obecnością skondensowanych biomolekuł i wody. (B) Woda jest obserwowana przy każdym przesunięciu napromieniowania. (C) Do ilościowości niezbędne jest, aby wszystkie widma były prawidłowo fazowane. (D) Po uzyskaniu rezonansu wody przy różnych przesunięciach napromieniowania, eksperyment powtarza się przy różnych mocach napromieniowania. Daje to zestaw danych względnego sygnału wodnego w funkcji zarówno przesunięcia promieniowania, jak i mocy napromieniowania (E). Dane są następnie dopasowywane za pomocą nieliniowego solvera programowania. Parametry dopasowania i uzyskane zostały zilustrowane dla bifazowej próbki RNA 31xCAG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Prezentacja wyników REDIFINE i CONDENSE MT. (A) Przedstawienie parametrów REDIFINE na wykresie pająka do analizy porównawczej między próbkami lub warunkami. (B) Model schematyczny ilustrujący parametry pochodzące z REDIFINE, w tym współczynniki dyfuzji, promień kropli, podział i kurs wymiany między fazami. (C) Porównanie profili CONDENSE-MT uzyskanych dla odniesienia agarozy i bifazowego FUS NTD w agarozie przy promieniowaniu 500 Hz.
(D) Analiza kondensowa-MT kondensatów RNA powtarzających się ekspansji 31xCAG, pokazująca ekstrakcję parametrów i wizualizację efektów transferu magnetyzacji związanych z kondensatem. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Ilustracja uzupełniająca 1: Konfiguracja REDIFINE. (A) Domena N-końcowa FUS pozostaje obserwowalna po przygotowaniu próbki dwufazowej skondensowanej. Obserwuje się silny sygnał amid/amino i aromatyczny protonowy. (B) Zanik sygnału obserwowany w eksperymencie dyfuzyjnym DOSY ilustruje szybszy rozpad populacji białek w fazie rozcieńczonej oraz wolniejszy rozpad białka w fazie skondensowanej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: przetwarzanie REDIFINE. (A) Kod Matlaba używany do dopasowywania REDIFINE, z podświetlonymi parametrami tam, gdzie potrzebne jest konkretne wejście. Wstawka ilustruje, jak wybiera się obszar całkowitości. (B) Minimalizacja funkcji dopasowania i wynikających z tego wyników. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy rysunek 3: Konfiguracja CONDENSE-MT. (A) Przegląd eksperymentów NMR wymaganych do analizy CONDENSE-MT, w tym eksperymentu inwersji wody-odzysku (ekspercja 5) oraz eksperymentów CONDENSE-MT przy różnych mocach napromieniowania (ekspercja 11-18). (B), (C) Przegląd skryptu Matlab do odczytu i integrowania 1D widm wody dla zbiorów danych CONDENSE-MT. Eksperymenty CONDENSE-MT są podane jako główne – main8. Granice integracji wprowadzane są jako water_left i water_right. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Ilustracja uzupełniająca 4: Przetwarzanie CONDENSE-MT. (A) Pierwsza sekcja skryptu dopasowania CONDENSE-MT, która zawiera montaż do odzyskiwania inwersji wody (sekcja 1) oraz wprowadzenie wcześniej określonych parametrów tła agarozy. (B) Dopasowywanie i określanie niepewności parametrów zbiorów danych CONDENSE-MT. Parametry początkowe dopasowania można ustawić w ramach fit0. (C) Wykres sekcji wyniku dopasowania CONDENSE-MT. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe pliki kodujące: Skrypty MATLAB do analizy REDIFINE i CONDENSE-MT. Bruker Topspin koduje do konfiguracji eksperymentu CONDENSE-MT oraz skryptów MATLAB używanych do przetwarzania i dopasowywania zbiorów danych dyfuzji REDIFINE oraz CONDENSE-MT do transferu magnetyzacji, w tym integracji danych, analizy relaksacyjnej oraz globalnych procedur dopasowywania modeli. Do uruchamiania skryptów wymagany jest MATLAB. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiliśmy tutaj szczegółowe protokoły charakteryzacji NMR bifazowych kondensatów biomolekularnych bez oznakowania. Dotyczą one dwóch nowych metodologii: LLPS REDIFINE oraz uzupełniającego, lecz ortogonalnego eksperymentu o nazwie CONDENSE-MT. Chociaż ogólnie stosowalny, LLPS REDIFINE opiera się na wykrywaniu biomolekularnym i wymaga obserwowalnego sygnału przy separacji fazowej do właściwej analizy. Chociaż może to ograniczać zastosowanie REDIFINE, większość kondensatów zawiera białka o wewnętrznych nieuporządkowanych obszarach, które zwykle można zaobserwować za pomocą NMR. W szczególności dla białk:RNA oraz kondensatów tylko RNA, sygnał biocząsteczek w fazie skondensowanej rozszerza się poza granice wykrywania przy separacji fazowej. Jeśli współczynnik podziału na fazę skondensowaną jest wysoki, konwencjonalny NMR prawie nie zaobserwuje sygnału. CONDENSE-MT omija to ograniczenie wykrywania, będąc techniką obserwowaną na wodzie, opierającą się na znaczącej różnicy w relaksacji między cząsteczkami w fazach rozcieńczonych i skondensowanych.

Prawidłowe przygotowanie próbek jest kluczowe dla skutecznego zastosowania zarówno REDIFINE, jak i CONDENSE-MT. Dlatego ważne jest, aby agaroza była całkowicie stopiona przed przelaniem do mieszaniny, aby uniknąć rozległego powstawania pęcherzyków powietrza podczas transferu oraz zapewnić wystarczającą ilość materiału do niezawodnego wypełnienia rurki NMR mieszaninami bifazowymi, które początkowo przyklejają się do szklanej ściany. Dla CONDENSE-MT kluczowe jest powtarzalne przeniesienie określonej objętości agarozy, ponieważ tło agarozy będzie kwantyfikowane osobno. Jeśli podział biomolekuł między fazy skondensowane i rozcieńczone jest silnie nierówny, lub wymiana między fazami jest bardzo wolna lub szybka, efekty REDIFINE lub CONDENSE-MT mogą być nieobecne lub zbyt słabe do wiarygodnego ilościowego określenia. Może to być kluczowe ograniczenie tych technik. W takim przypadku jednak podwyższenie lub obniżenie temperatury może być pomocne, ponieważ temperatura jest potężnym modulatorem podziału cząsteczek i przepływów wymiany chemicznej. Po pozyskaniu zbiorów danych wyniki optymalnego dopasowania często uzyskuje się iteracyjnie, powtarzając optymalizację obliczeniową z parametrów najlepszego dopasowania z początkowego lub poprzedniego dopasowania jako wartości wejściowych.

W systemach wywołujących silne efekty REDIFINE i CONDENSE-MT, eksperymenty te mogą dostarczyć wglądu w podział cząsteczek molekularnych, kursów wymiany i dynamiki molekularnej bez oznakowania, które trudno osiągnąć innymi metodami bez etykiet. Ponadto metody oparte na NMR są zazwyczaj nieinwazyjne, co pozwala na wielokrotną analizę próbek lub przechowywanie przez dłuższy czas, co pozwala na monitorowanie właściwości kondensatu w czasie. Jest to szczególnie interesujące w kontekście patologicznego dojrzewania kondensatu w wyniku fibrylizacji, co jest trudne do badania metodami komplementarnymi przez bardzo długie okresy czasu.

Biorąc pod uwagę, że bezbłonowe organelle komórkowe są zazwyczaj zespołami wieloskładnikowymi o złożonej architekturze, przyszłe zastosowania tej techniki obejmują wykrywanie i charakteryzację coraz bardziej zaawansowanych wieloskładnikowych modeli kondensatu oraz analizy kondensatu w kontekście komórkowym za pomocą NMR wewnątrzkomórkowego. Wymaga to jednak adaptacji REDIFINE lub CONDENSE-MT do tak złożonych systemów, a działania na rzecz tego są już prowadzone.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Spektrometr NMR Avance NEO 700 MHz	Bruker Biospin	https://www.bruker.com/en.html	Dane są pozyskiwane za pomocą spektrometru NMR 700 MHz.
Topspin	Bruekr Biospin	https://www.bruker.com/en.html	Dane są przetwarzane za pomocą tego oprogramowania.
Białko FUS NTD		Nie ma	To białko jest eksprymowane i oczyszczane w naszym laboratorium
RNA 31xCAG		Nie ma	RNA jest produkowane i oczyszczane w naszym laboratorium
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	Dane są przetwarzane i wizualizowane za pomocą tego oprogramowania.