Artykuł metodologiczny

Izolacja i terapeutyczne zastosowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z samodzielnie składających się agregatów komórek macierzystych mezenchymalnych

DOI:

10.3791/70534

⸱

24 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of Stomatology, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 4The second Department of Surgery, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 5Military Medical Innovation Center, The Fourth Military Medical University, 6School of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, 7Department of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje efektywną izolację dużych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (LEV) od samodzielnie organizujących się agregatów komórek macierzystych oraz ich terapeutyczne zastosowanie w regeneracji kości żuchwy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są kluczowymi mediatorami komunikacji międzykomórkowej oraz obiecującymi czynnikami wolnymi od komórek dla medycyny regeneracyjnej. Wśród subpopulacji EV duże pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (LEV) są szczególnie odpowiednie do naprawy tkanek ze względu na wzbogacony ładunek proregeneracyjny. Jednak standaryzowane i powtarzalne metody generowania funkcjonalnych LEV pochodzących z komórek macierzystych zębów do dalszej charakterystyki i oceny terapeutycznej pozostają ograniczone. Wykorzystując wyjątkowy potencjał osteogenny komórek macierzystych z brodawki wierzchołkowej (SCAP), opracowaliśmy trójwymiarowy model hodowli w warunkach niskiej adhezji, aby indukować samoorganizujące się agregaty SCAP. Model ten naśladuje fizjologiczną kondensację mezenchymalną, znacząco wzmacniając interakcje między komórkami i zwiększając wydzielanie LEV. Kluczowe parametry hodowli oraz notatki dotyczące obsługi są dostarczane, aby poprawić spójność agregatu i zmaksymalizować produkcję LEV przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek. Przedstawiamy tutaj ustandaryzowany protokół efektywnej produkcji funkcjonalnych LEV pochodzących z SCAP, obejmujący generowanie agregatów 3D, izolację za pomocą wirowania różnicowego, analizę pomiaru i koncentracji cząstek opartą na analizie śledzenia nanocząstek (NTA) oraz terapeutyczne podanie za pomocą termicznie sieciowanego hydrożelu do naprawy ubytków kostnych żuchwy. To podejście usprawnia produkcję LEV w dalszych badaniach mechanistycznych oraz przedklinicznej ocenie regeneracji czaszkowo-twarzowej. Ten zoptymalizowany przepływ pracy zapewnia powtarzalne przygotowanie bioaktywnych LEV o stałych wydajnościach i wzbogaconym ładunku pro-osteogenicznym, ułatwiając badania podstawowe i przyspieszając kliniczne przekształcenie rekonstrukcji czaszkowo-twarzowej z udziałem EV. W zastosowaniach reprezentatywnych LEV wypełnione hydrożelem zapewniają lokalizowany magazyn w miejscach defektu i ułatwiają łatwe obsługiwanie podczas implantacji. Łącznie ta metoda zapewnia skalowalną platformę do przygotowywania LEV pochodzących z SCAP i podkreśla kluczowe kwestie dotyczące standaryzowanego raportowania i projektowania badań translacyjnych. To podejście wspiera szersze wdrożenie w laboratoriach czaszkowo-twarzowych EV.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to nanocząstki związane z błoną uwalniane przez komórki, które pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej poprzez transfer bioaktywnych ładunków, takich jak białka, miRNA i lipidy 1,2,3. Wśród subpopulacji EV duże pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (LEV) wyróżniają się bezpośrednim uwalnianiem z błony komórkowej oraz wrodzonym wzbogaceniem cząsteczek proregeneracyjnych, co czyni je dobrze przystosowanymi do naprawyi regeneracji tkanek, które wymagają 4,5. W medycynie regeneracyjnej EV pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) są coraz częściej uznawane za realną bezkomórkową alternatywę dla terapii pełnokomórkowej 6,7,8. Odtwarzają one regeneracyjne efekty parakrynologiczne rodzicielskich MSC, unikając jednocześnie ograniczeń bezpośredniego przeszczepu komórek, takich jak niska efektywność przeszczepów, immunogenność oraz zmienność partii 7,8,9,10. Wśród źródeł MSC komórki macierzyste z brodawki wierzchołkowej (SCAP) wykazują wyższy potencjał różnicowania osteogennego i odontogennego 11,12,13, co czyni EV pochodzącymi z SCAP szczególnie atrakcyjnymi do naprawy kości i tkanek zębowych 8.

Warto zauważyć, że biogeneza i funkcjonalność pojazdów elektrycznych są głęboko kształtowane przez mikrośrodowisko komórkowe 14,15. Konwencjonalne dwuwymiarowe (2D) monowarstwowe hodowle znacząco odbiegają od natywnego kontekstu tkanek16,17, często prowadząc do EV o ograniczonej zdolności regeneracyjnej18. Dla porównania, trójwymiarowe (3D) samoorganizujące się agregaty MSC odzwierciedlają kluczowe aspekty fizjologicznej kondensacji mezenchymalnej, stadium rozwojowego charakteryzującego się wysoką gęstością komórek, intensywnym kontaktem komórka-komórka oraz wzbogaconą macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), która zapewnia wsparcie strukturalne oraz dostarcza biochemiczne i mechaniczne sygnały regulujące adhezję, migrację i decyzje dotyczące losu komórek 19,20,21. To biomimetyczne mikrośrodowisko 3D nie tylko poprawia komunikację międzykomórkową i sygnalizację parakryno, ale także sprzyja wydzielaniu pojazdów elektrycznych o wyższej wydajności i ulepszonych profilach ładunku bioaktywnego 24,25,26. Wykorzystanie 3D samodzielnie składanych agregatów MSC wyłania się więc jako bardzo obiecująca strategia uzyskania funkcjonalnie wydajnych EV dla zastosowań regeneracyjnych18.

Pomimo wyraźnych zalet elektrycznych pochodzących z agregatu, ustandaryzowane protokoły ich izolacji i charakteryzacji od systemów 3D pozostają niedopracowane. Obecne metody izolacji EV, takie jak wirowanie różnicowe, są dobrze ugruntowane i oferują skalowalne ramy produkcji EV27. Podobnie opisano metody generowania agregatów MSC, często opierające się na zwijaniu komórek wywołanym witaminą C i agregacji z komórek hodowanych przez 2D28. Jednak architektura ECM w tych agregatach indukowanych witaminą C może nadal różnić się od przestrzennie zorganizowanego, kondensacyjnego mikrośrodowiska rodzimych tkanek mezenchymalnych. Natomiast samoorganizacja bez rusztowania w warunkach niskiej adhezji ułatwia powstawanie zwartych, kulistych agregatów, które przybliżają kluczowe cechy kondensacji mezenchymalnej19,29. Obecnie brakuje systematycznego i powtarzalnego procesu izolowania i stosowania EV z takich agregatów 3D SCAP o niskiej przyczepności. Z praktycznego punktu widzenia produkcja LEV z konwencjonalnych 2D hodowli SCAP zazwyczaj mieści się w zakresie ~1011 cząstek/mL według analizy śledzenia nanocząstek (NTA), a agregacja 3D o niskiej przyczepności ma zwiększyć produkcję LEV kilkukrotnie, jednocześnie zachowując powtarzalność w dalszych zastosowaniach. Aby wypełnić tę lukę, przedstawiamy kompleksowy protokół, który wykorzystuje wrodzoną funkcjonalność osteogeniczną/odontogenną SCAP oraz optymalizuje mikrośrodowisko MSC poprzez 3D agregację o niskiej przyczepności. Protokół ten umożliwia niezawodną produkcję wysokiej jakości LEV, stanowiąc standaryzowane narzędzie do rozwoju terapii regeneracyjnych bez komórek w medycynie czaszkowo-twarzowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Czwartego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE. Pobranie i wykorzystanie próbek ludzkich zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki IV Wojskowego Uniwersytetu Medycznego (zatwierdzenie nr IRB-REV-2022187). Przed pobraniem próbki uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich dawców; Dla dawców, którzy byli niepełnoletni lub w inny sposób niezdolni do wyrazienia zgody, uzyskano pisemną świadomą zgodę od ich prawnych opiekunów. Wszystkie odczynniki były filtrowane sterylnie, a procedury hodowli komórkowej przeprowadzano w szafie bioasekuracyjnej, aby zachować bezpłodność (patrz Tabela materiałów). Traktuj wszystkie materiały pochodzące od człowieka (zęby, tkanki, komórki pierwotne, podłoża kondycjonowane i preparaty EV) jako potencjalnie zakaźne. Wszystkie procedury związane z próbkami ludzkimi wykonuj w certyfikowanej szafce bezpieczeństwa biologicznego, używając odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE), w tym fartucha laboratoryjnego, rękawiczek i ochrony oczu. W zakresie bezpieczeństwa biologicznego i utylizacji odpadów należy stosować się do wytycznych instytucjonalnych BSL-2: Obchodzić się ze wszystkimi materiałami pochodzącymi od człowieka oraz zanieczyszczonymi jednorazami jako odpady biohazardowe BSL-2; Po użyciu odczyszcz powierzchnie/sprzęt zatwierdzonym przez instytucję środkiem dezynfekującym. Zbieraj ciekłe odpady biologiczne w oznaczonych pojemnikach i dezaktywuj je zatwierdzonymi metodami przed utylizacją. Natychmiast wyrzucaj ostre przedmioty do zatwierdzonych pojemników na ostre przedmioty (bez ponownego przelewania). Traktować tkanki/tusze zwierzęce oraz resztki znieczulających/chemicznych jako regulowane odpady biologiczne/chemiczne i utylizować je za pośrednictwem usług instytucjonalnych zgodnie z obowiązującymi przepisami.

1. Izolacja i kultura ludzkich SCAPs

UWAGA: P/S to bioaktywna mieszanka antybiotyków, która może powodować podrażnienia skóry/oczu lub reakcje alergiczne. Uchwyt w szafce BSL-2 biosafety podczas otwierania; nosić rękawiczki i ochronę oczu; unikać generowania aerozoli; oraz utylizować odpady zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi odpadów chemicznych. Kolagenaza typu I (roztwór) to enzym bioaktywny, który może powodować podrażnienia skóry/oczu lub reakcje alergiczne. Uchwyt w szafie BSL-2 biosafety; nosić rękawiczki i ochronę oczu; unikanie rozprysków i powstawania aerozolu podczas pipetowania; oraz szybko odkażać wycieki zgodnie z procedurami instytucjonalnymi. Chronić kolagenazę typu I przed światłem podczas przechowywania i użytkowania (patrz Tabela materiałów).

  1. Pobierz trzecie trzonowce z niedojrzałymi wierzchołkami od zdrowych dawców (16–21 lat) i dokładnie przepłucz solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) zawierającą 1% penicyliny/streptomycyny (P/S) (patrz Tabela materiałów).
  2. Rozciąć tkankę brodawki wierzchołkowej od wierzchołka korzenia za pomocą sterylnych pęsety okulistycznych i nożyczek, a następnie pokróć ją na małe fragmenty (<1 mm3).
  3. Przenieś wszystkie fragmenty tkanek do probówki wirówki o pojemności 15 mL. Trawić fragmenty kolagenazą typu I w dawce 2 mg/mL w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, delikatnie potrząsając co 15 minut.
  4. Zatrzymaj trawienie, dodając równą objętość pełnego, α-minimalnego medium istotnego (α-MEM) (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Czas trawienia kolagenazy typu I nie jest stały i zależy od stanu trawienia tkanek. Monitoruj uważnie, przerwaj trawienie, gdy tkanki ulegają częściowej erozji poprzez dodanie podłoża. Nadmierne trawienie może utrudniać żywotność komórek.
  5. Wiruj zawiesinę ogniwa w 100 × g przez 5 minut w 4 °C, wyrzucaj supernatant i ponownie zawiesij pellet w 2 mL pełnego α-MEM.
  6. Nasiać trawioną zawiesinę tkankową do 10-cm szalki Petriego i dodać 8 mL kompletnego α-MEM do końcowej objętości 10 mL na każdą miskę.
  7. Hodować SCAP w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂.
    UWAGA: Monitoruj hodowle nieprzerwanie, komórki zazwyczaj migrują z fragmentów tkanek i przyczepiają się do naczynia w wzorze promieniowym w ciągu 3–7 dni. Jeśli żywotność tkanek jest słaba lub nie zaobserwowano migracji komórek w ciągu 5 dni, należy przejść na pełny α-MEM z dodatkiem 20% surowicy w stężeniu.
  8. W przypadku przekazywania komórek komórki były myte 5 ml PBS, aby usunąć pozostałe medium po osiągnięciu 80–90% zbiegu. Następnie inkubowano je z 2 mL 0,25% trypsyny-1 mM EDTA w 37 °C przez 2 minuty (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Trypsyna – EDTA jest drażniąca i może uszkadzać skórę oraz oczy. Obchod się z nim w rękawiczkach i z ochroną oczu, unikaj rozbryzgów i powstawania aerozolu, a w razie kontaktu natychmiast spłukuj dużą ilością wody. Unieszkodliwiaj cieczne odpady zawierające trypsynę zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  9. Gdy komórki pod mikroskopem zostaną zaokrąglone z przerwanymi połączeniami międzykomórkowymi, delikatnie odłącz komórki od naczynia bez nadmiernych uszkodzeń strukturalnych. Neutralizuj trypsynę, dodając 4 mL kompletnej α-MEM.
  10. Zbieraj komórki poprzez delikatne, powtarzane pipetowanie do świeżej rurki wirówki o pojemności 15 mL. Po wirowaniu w 100 × g przez 5 minut odrzuć supernatant i ponownie zawiesijcie granulkę komórkową w pełnym α-MEM. Nasiaj ponownie zawiesowane komórki do świeżych misek hodowlanych lub płytek do studni. Wymień podłoże co dwa dni.
    UWAGA: Upewnij się, że SCAP-y używane do kultury agregatowej mieszczą się w pasucie 5. Stemness i zdolność agregacji maleją wraz ze wzrostem liczby przejść30,31, co może obniżyć łączną efektywność formacji i funkcjonalność.

2. Samoskładanie agregatów SCAP

  1. Pobierać 3–5 SCAP przez trypsynizację, wirować w dawce 100 × g przez 5 minut i ponownie zawiesić w α-MEM uzupełnionym o 10% surowicę płodową (FBS) o wyczerpanym EV (Buffs) i 1% P/S (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Przygotuj wyczerpane EV FBS przez wirowanie FBS w 150 000 × g w temperaturze 4 °C przez noc, aby usunąć EV i inne zanieczyszczenia32.
  2. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiewaj 1 × 105 komórek na dołek w płytkach o ultra-niskim przyczepieniu z 24 dołkami. Reguluj średnią objętość do 500 μL na odwiert, aby utrzymać stan zawieszenia.
  3. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 72 godziny i wymieniaj podłoże co 48 godzin.
  4. Codziennie monitoruj powstawanie kruszywa pod odwróconym mikroskopem optycznym. Zbieraj elektrowniczki, gdy agregaty osiągają średnicę 200–400 μm i mają zwartą, gładką strukturę.
    UWAGA: Zdefiniuj jedną "partię" produkcyjną jako LEVs wyizolowane z połączonego warunkowanego medium zebrane z agregatów SCAP zasiewanych tego samego dnia z tego samego przejścia komórki i utrzymywanych w identycznych warunkach hodowli w ramach jednego okna zbioru (72 godziny). Każdą partię przetwarzaj niezależnie przez wirowanie. Zmień podłoże hodowlane po 48 godzinach po wysiewie i uzupełnij tym samym ilością świeżego medium. Do produkcji LEV należy zebrać kondycjonowane medium w 48 godzinach i ponownie po 72 godzinach po siewie, a zebrane podłoże (0–48 h i 48–72 godzin) zebrać jako jedną partię. Utrzymuj zgromadzone podłoże w temperaturze 4 °C i przetwarzaj je do izolacji LEV.

3. Izolacja i charakterystyka EV od agregatów SCAP

  1. Wirowanie różnicowe do izolacji dużych LEV-ów
    1. Zbierz pożywkę zawierającą kruszywa SCAP do rurek wirówek o pojemności 15 mL.
    2. Wirować w 800 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć nienaruszone kruszywa i duże zanieczyszczenia komórkowe.
    3. Przelej supernatant do nowych probówek 15 mL i wiruj w 2500 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby wyeliminować pozostałości płytek krwi i fragmenty małych komórek.
    4. Ostrożnie przelej supernatant do sterylnych stożkowych rurek o pojemności 1,5 mL i wiruj w 16 800 × g przez 30 minut w 4 °C, aby uzyskać LEV-y w granulkach.
      UWAGA: Użyj stożkowych lamp o pojemności 1,5 mL, aby zwiększyć wydajność LEV.
    5. Usuń supernatant, ponownie zawiesij granulkę w 1 mL sterylnego PBS i ponownie wiruj w 16 800 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, używając rotora o stałym kącie (kompatybilnego ze standardową wirówką stołową), aby rozpylić LEV.
    6. Ustaw hamowanie na "wolny" lub "niski" (zazwyczaj poziom hamulca 1 lub 2), aby zapobiec ponownemu zawieszeniu pelletu LEV podczas ostatniej fazy hamowania.
    7. Usuń supernatant i ponownie zawiesij ostatni granulek LEV w 50 μL sterylnego PBS. Użyj zawiesiny natychmiast (w ciągu 24 godzin) lub przechowuj ją w temperaturze 4 °C. Unikaj zamarzania, aby zminimalizować utratę bioaktywności.
      UWAGA: Przygotuj około 80 studni agregatów, aby uzyskać wystarczające LEV dla typowych eksperymentów końcowych. Próbki LEV są zalecane do natychmiastowej charakterystyki lub zastosowania terapeutycznego, a nie do długoterminowego przechowywania. Jeśli wymagane jest dłuższe przechowywanie, należy zachować zawiesinę LEV (np. 5–10 μL na rurkę), aby uniknąć powtarzających się wahań temperatury i cykli zamrożenia i rozmrażania. Aliquoty można szybko zamrażać na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze −80 °C dla krótkotrwałego przechowywania (np. do 1–3 miesięcy). Rozmroz na lodzie i użyj od razu. Należy zauważyć, że zamrożenie może zmniejszać bioaktywność i wpływać na odzyskiwanie/rozkład rozmiarów cząstek; dlatego, kiedy to możliwe, przeprowadzaj badania funkcjonalne z wykorzystaniem świeżo przygotowanych LEV. Aby kontrolować jakość po przechowywaniu, ponownie zmierz stężenie cząstek i rozkład rozmiarów za pomocą NTA i kontynuuj tylko wtedy, gdy wartości pozostają w określonym zakresie akceptacji. Dodatkowo, w tym protokole stężenie cząstek NTA jest główną metodą ilościfikacji, aby uniknąć utraty pęcherzyków związanych z testami białkowymi, takimi jak BCA, maksymalizując wydajność w dalszych zastosowaniach.
  2. NTA dla rozmiaru i stężenia cząstek
    UWAGA: NTA wykonywana jest za pomocą komercyjnie dostępnego analizatora śledzącego nanocząsteczki (patrz Tabela materiałów) do oceny rozkładu rozmiarów i stężenia cząstek.
    1. Rozcieńcz 1 μL zawieszenia LEV (z Sekcji 3.1, Krok 6) w 1 499 μL sterylnego PBS w sterylnej stożkowej rurce o pojemności 1,5 mL i dokładnie wymieszaj.
    2. Uruchom kompatybilne oprogramowanie i napełnij próbkę komórką 10 mL ultraczystej wody. Potwierdź, że liczba cząstek w tle wynosi < 10 na klatkę, aby upewnić się, że system jest czysty (patrz Tabela materiałów).
    3. Skalibruj instrument przygotowanym roztworem standardowym. Ustaw parametry oprogramowania na: Czułość 70, Migawka 70, Minimalna Strefa 5 oraz Minimalna Jasność 20. Wykonaj "AutoAlignment", aby upewnić się, że laser jest wyostrzony. Dostosuj standardowe rozcieńczenie do poziomu 50–400 (najlepiej ~200), a następnie uruchom program kalibracyjny.
      UWAGA: Przygotuj roztwór standardowy, rekonstytuując 1 μL kulek kalibracyjnych w 1 mL wody destylowanej, aby uzyskać roztwór pierwotny. Rozcieńcz 100 μL roztworu pierwotnego w 25 mL wody destylowanej (rozcieńczenie 1:250 000) i przechowuj w temperaturze 4 °C do tygodnia.
    4. Przed analizą opłucz komórkę próbki 5 mL wody destylowanej.
    5. Przepłucz kanał 1 mL wody destylowanej i potwierdzi, że liczba cząstek na interfejsie detekcyjnym wynosi <10.
    6. Wstrzyknąć 1 mL rozcieńczonej próbki LEV ze stałą prędkością 0,5 mL/s, używając sterylnej strzykawki o pojemności 1 mL.
      UWAGA: Ręcznie steruj strzykawką, aby utrzymać stałą prędkość wstrzykiwania.
    7. Przeprowadz analizę cząstek i generuj raporty. W oprogramowaniu utworz nowy pomiar i wybierz tryb Rozmiar/Stężenie. Ustaw akwizję na 3 nagrania, 60 sekund na nagranie, przy 25 °C, używając tych samych parametrów detekcji co w kroku 3 (czułość 70, migawka 70, minimalna jasność 5, minimalna jasność 20).
    8. rozpocznij akwizycję i sprawdź, czy liczba cząstek na ekranie pozostaje w granicach 50–400 cząstek na klatkę (najlepiej ~200); jeśli wyjdziemy poza ten zakres, zatrzymaj się i dostosuj rozcieńczenie próbki, a następnie powtórz Krok 6. Po uzyskaniu przeprowadzić analizę, aby uzyskać średni rozmiar, rozmiar trybu, D10/D50/D90 oraz stężenie cząstek (cząstki/mL). Następnie eksportuj wyniki i wykresy rozkładu rozmiarów jako .csv i .pdf (lub równoważne formaty raportów) i zapisz plik pomiarowy do prowadzenia dokumentacji.

4. Terapeutyczne zastosowanie LEV w regeneracji kości żuchwy

  1. Przygotowanie hydrożelu obciążonego LEV-em
    1. Przygotuj kolbę Pluronic F-127 (20% objętości). Dodaj proszek pluronowy F-127 do sterylnego PBS do końcowego stężenia 20% (w/v) i mieszaj w 4 °C przez noc, aż całkowicie się rozpuści i stanie się jednorodny (patrz Tabela materiałów). Utrzymuj roztwór w temperaturze 4 °C przez cały okres przygotowania, aby uniknąć przedwczesnej żelacji.
      UWAGA: 20% (w/v) Pluronowy F-127 jest ciekły w temperaturze 4 °C i podlega termogelacji w temperaturze ~20–25 °C (zależnie od rurki/pomieszczenia); w temperaturze 37 °C staje się żel stabilny.
    2. Ładuj LEV w warunkach zimnych. Wstępne schładzenie rurek, końcówek pipetek i hydrożelu do 4 °C. Mieszanie 50 μg LEV (równoważnych LEV z dwóch 24-dołowych płyt kruszyw) z 1 mL 20% Pluronowego F127 poprzez delikatne pipetowanie i krótkie wirowanie przy niskich prędkościach, aby zapewnić równomierny rozkład. Utrzymuj mieszankę na lodzie lub w temperaturze 4 °C aż do wszczepienia się.
    3. Wskazówki dotyczące obsługi i użytkowania (dla powtarzalności). Szybko wykonuj ładowanie i ładowanie strzykawką/końcówką na lodzie. Jeśli mieszanina ogrzeje się powyżej ~20–25 °C, lepkość wzrasta i może rozpocząć się żelacje; w takim przypadku przywróć do 4 °C, aż materiał znów stanie się w pełni płynny przed użyciem. Po umieszczeniu w defektie pozwól na zachod żelowania w temperaturze ciała (37 °C).
  2. Ustanowienie modelu ubytku kostnego u myszy
    1. Znieczulanie 8-tygodniowych myszy C57Bl/6 (samców lub samic) za pomocą podania dootrzębnownego pentobarbitalu sodu (50 mg/kg) (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Pentobarbital sodny to silny środek uspokajający/środek znieczulający i jest toksyczny dla ludzi, jeśli zostanie przypadkowo wstrzyknięty, połknięty lub wdychany. Przygotowuj i podawaj je z użyciem bezpiecznych praktyk (nie odnawiaj igieł; natychmiast wyrzucaj do pojemnika na ostre przedmioty), nosząc rękawiczki i ochronę oczu, unikaj kontaktu ze skórą oraz przechowywaj/rejestruj stosowanie zgodnie z instytucjonalnymi zasadami dotyczącymi leków kontrolowanych. Potwierdź prawidłową znieczulenie u myszy, sprawdzając brak odruchu rogówki i brak wycofania kończyn po szczypnięciu poduszki stopy. Nałóż ochronną maść okulistką, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
    2. Ogol sierść na lewej części żuchwy i dezynfekuj na przemian 10% jodem povidonu i 75% etanolem.
      UWAGA: 75% etanolu jest wysoce łatwopalne; Używaj go z dala od źródeł zapłonu i zapewnij dobrą wentylację. Povidone-jod może powodować podrażnienia skóry/oczu lub reakcje alergiczne; Noś rękawiczki, unikaj kontaktu z oczami/błoną śluzową i szybko czyść rozlane rzeczy.
    3. Wykonaj 1 cm podłużne nacięcie wzdłuż krawędzi żuchwy i tępo rozciąć tkanki miękkie, aby odsłonić kąt żuchwy.
    4. Stwórz okrągły defekt kości (2 mm średnicy) za pomocą wiertarki dentystycznej z ciągłym irygowaniem solą fizjologiczną, aby zapobiec uszkodzeniom termicznym (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Uważnie monitoruj krwawienia śródoperacyjne, kontroluj krwotok małymi wacikami, aby utrzymać czyste pole chirurgiczne i zmniejszać ryzyko infekcji. Unikaj kontaktu z otaczającymi tkankami miękkimi wiertłem, aby zapobiec zaplątaniu.
  3. Wszczepienie hydrożelu obciążonego LEV
    1. Załaduj mieszankę LEV-hydrogel do sterylnej strzykawki i wstrzyknij ją w ubytek kostny, zapewniając pełne wypełnienie.
      UWAGA: Podawaj ~10 μg LEVs na mysz. Do uzyskania wystarczającej ilości LLEV-ów dla eksperymentu z n = 5 myszy potrzebne są dwie płytki z agregatami SCAP na 24 dołki.
    2. Dla grupy kontrolnej wstrzyknąć równą objętość hydrożelu pluronowego F-127 bez LEV.
    3. Zszyj nacięcie szwami 4-0 i podaj podskórne środki przeciwbólowe (karprofen, 5 mg/kg), aby złagodzić ból pooperacyjny (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Karprofen to farmakologicznie aktywny NLPZ i może być szkodliwy, jeśli zostanie przypadkowo wstrzyknięty lub jeśli ma kontakt ze skórą/oczami. Noszenie rękawiczek, unikanie ostrych urazów, wyrzucanie igieł/strzykawek do pojemnika na ostre przedmioty oraz utylizacja nieużywanych leków i zanieczyszczonych materiałów zgodnie z procedurami dotyczącymi odpadów farmaceutycznych instytucji.
    4. Umieść myszy na kocu podgrzewającym do czasu wyzdrowienia z narkozy, a następnie przenieś je do indywidualnych klatek z dostępem do jedzenia i wody.
      UWAGA: Nie zostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej świadomości, by utrzymać leżącą część mostka. Myszy należy oddać do rodzinnych domów dopiero po pełnym wyzdrowieniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z eksperymentalnym przepływem pracy, kluczowe kroki, w tym izolacja SCAP, tworzenie agregatów, ekstrakcja LEV oraz terapeutyczna implantacja, zostały pomyślnie przeprowadzone (Rysunek 1). Klinicznie zaimpekowane trzecie trzonostrowce dawcy wykazywały niedojrzałe wierzchołki z nienaruszoną tkanką brodawki wierzchołkowej przyczepioną wokół otwartych otworów kanałowych, co potwierdza odpowiednie źródło SCAP (Rysunek 2A). Podczas hodowli in vitro, w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnące zainteresowanie terapiami regeneracyjnymi bez komórek sprawia, że LEV pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych są obiecującą alternatywą dla przeszczepów całych komórek, dzięki ich zdolności do dostarczania bioaktywnych cząsteczek bez ryzyka związanego z podejściami opartymi na komórkach. Jednak kliniczne tłumaczenie terapii opartych na LEV zostało utrudnione przez brak fizjologicznie istotnych systemów hodowlanych, które mogłyby w pełni zachować i poprawić funkcjonalność LEV. Konwencjonalne kultury mon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez granty z Narodowego Programu Badań i Rozwoju Chin (2021YFA1100600), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82471011, 82401201), Projektu Państwowego Kluczowego Laboratorium Rekonstrukcji i Rekonstrukcji Szczęki Twarzowej (2024MS04), Chińskiej Fundacji Nauk Podoktoranckich (BX20230485) oraz Projektu Współpracy i Wymiany Laboratoriów Partnerskich Czwartego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego (2024HB014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 mL strzykawki z igłąBD300841Znieczulenie
Naczynie do hodowli komórek o średnicy 10 cmCorning353003Hodowla komórkowa
15 mL rurka do wirówki polistyrenowejCorning352095Hodowla komórkowa
75% Etanol DezynfekującyHai Shi Hai NuoHS-750Działanie
Szwy chłonne 4-0Jinhuan MedicalR413Działanie
Wirówka stołowaWIGGENS187 CE187Izolacja EV
Inkubator CO2, 150 L, typ uniwersalnyThermoFisher51032874Hodowla komórkowa
Kolagenaza typu IThermoFisher17100017Hodowla komórkowa
WacikiDeroyal30-033Działanie
Zakrzywione nożyczki operacyjneJZ Surgical InstrumentJ21040Działanie
Mobilna Turbina StomatologicznaKaVoS609CDziałanie
Elektroniczna wagaZhi KeZK-DSTHodowla komórkowa
Metr EppendorfEppendorf3810XIzolacja EV
Kleszcze, dobrzeJZ Surgical InstrumentJD1020Działanie
Krem do depilacjiVeet1.00097E+11Działanie
Szybki Ball BurDentsply SironaE0123Działanie
Szybka rękodziełoKaVoKV-1-008-1644Działanie
Mikroskop odwróconyMshotMF53-NHodowla komórkowa
MEM i alfa; (Minimalne Niezbędne Medium &alfa;)ThermoFisher12561056Hodowla komórkowa
Mikroskop wideo śledzący nanocząstki PMX-120Particle MetrixZetaView PMX120Analiza śledzenia nanocząstek
Penicylina-Streptomycyna (P/S)ThermoFisher15140122Hodowla komórkowa
Pentobarbital sodowySigma-Aldrich57-33-0Znieczulenie
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)ThermoFisher10010023Hodowla komórkowa
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443Implantacja EV
Roztwór jodu povidonuBaxter  PROSL500Działanie
Specjalistyczne serum płodowe bydło (FBS)ThermoFisher12664025Hodowla komórkowa
Sterylny blok gazyZwycięstwo10-000-681Działanie
Stołowa mikrowirówka o dużej prędkościHitachiCT15EIzolacja EV
Trephine DrillBiometowa mikrofiksacja01-9182Działanie
Trypsin-EDTAThermoFisher25200072Hodowla komórkowa
Płytka z ultra-niskim mocowaniem 24 dołkówCorning3473Hodowla komórkowa
Vortex Mixer GeniePrzemysł naukowySI0425Implantacja EV

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiu, G., et al. Functional proteins of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Stem Cell Res. Ther. 10, 359-372 (2019).
  2. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res. Ther. 9, 50-63 (2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 19, 213-228 (2018).
  4. Rai, A., et al. Proteomic dissection of large extracellular vesicle surfaceome unravels interactive surface platform. J. Extracell. Vesicles. 10, 1-20 (2021).
  5. Ye, T., et al. Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity. Bioact. Mater. 21, 194-208 (2023).
  6. Liang, Z., Luo, Y., Lv, Y. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles mediate BMP2 gene delivery and enhance bone regeneration. J Mater Chem B. 8, 6378-6389 (2020).
  7. Olaechea, A., et al. Preclinical Evidence for the use of oral mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in bone regenerative therapy: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 12, 791-800 (2023).
  8. Zhang, T., et al. Extracellular vesicles derived from human dental mesenchymal stem cells stimulated with low-intensity pulsed ultrasound alleviate inflammation-induced bone loss in a mouse model of periodontitis. Genes Dis. 10, 161-1625 (2023).
  9. Cai, X. Y., et al. Inflammation-triggered Gli1(+) stem cells engage with extracellular vesicles to prime aberrant neutrophils to exacerbate periodontal immunopathology. Cell Mol Immunol. 22, 371-389 (2025).
  10. Wang, Y., et al. Reciprocal regulation of mesenchymal stem cells and immune responses. Cell Stem Cell. 29, 1515-1530 (2025).
  11. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. J Tissue Eng. 29, 1-17 (2017).
  12. Yang, H., et al. Secreted frizzled-related protein 2 promotes the osteo/odontogenic differentiation and paracrine potentials of stem cells from apical papilla under inflammation and hypoxia conditions. Cell Prolif. 53, 1-11 (2020).
  13. Huang, M., Dissanayaka, W. L., Yiu, C. K. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges, and opportunities. Stem Cell Res Ther. 16, 1-20 (2025).
  14. Jaukovic, A., et al. Specificity of 3D MSC Spheroids Microenvironment: Impact on MSC Behavior and Properties. Stem Cell Rev Rep. 16, 853-875 (2020).
  15. Wang, X., et al. Hypoxia promotes EV secretion by impairing lysosomal homeostasis in HNSCC through negative regulation of ATP6V1A by HIF-1 alpha. J Extracell Vesicles. 12, 1-20 (2023).
  16. Yuste, I., et al. Mimicking bone microenvironment: 2D and 3D in vitro models of human osteoblasts. Pharmacol Res. 169, 1-57 (2021).
  17. Fontana, F., et al. In Vitro 3D cultures to model the tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13, 1-16 (2021).
  18. Cook, K., Li, H. Advancing extracellular vesicle production: improving physiological relevance and yield with 3D cell culture. Nanoscale. 17, 15110-15131 (2025).
  19. Sui, B. D., et al. Mesenchymal condensation in tooth development and regeneration: a focus on translational aspects of organogenesis. Physiol Rev. 103, 1899-1964 (2023).
  20. Kobayashi, T., Kronenberg, H. M. Overview of skeletal development. Methods Mol Biol. 2230, 3-16 (2021).
  21. Naba, A. Mechanisms of assembly and remodelling of the extracellular matrix. Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 865-885 (2024).
  22. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 1-16 (2021).
  23. Zhang, J., et al. Functional tissue-engineered microtissue formed by self-aggregation of cells for peripheral nerve regeneration. Stem Cell Res Ther. 13, 1-20 (2022).
  24. Yu, W., et al. Higher yield and enhanced therapeutic effects of exosomes derived from MSCs in hydrogel-assisted 3D culture system for bone regeneration. Biomater Adv. 133, 1-17 (2022).
  25. Kim, M., et al. Three-dimensional spheroid culture increases exosome secretion from mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 15, 427-436 (2018).
  26. Millan, C., et al. Extracellular vesicles from 3d engineered microtissues harbor disease-related cargo absent in EVs from 2D cultures. Adv Healthc Mater. 11, 1-17 (2022).
  27. Petit, I., Levy, A., Aberdam, D. Purification of extracellular microvesicles secreted by dermal fibroblasts. Methods Mol Biol. 2154, 63-72 (2020).
  28. Li, S., et al. Construction, characterization, and regenerative application of self-assembled human mesenchymal stem cell aggregates. J Vis Exp. (15), e64697(2023).
  29. Sui, B. D., et al. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods Mol Biol. 2002, 87-99 (2019).
  30. Mobasseri, R., et al. Peptide-modified nanofibrous scaffold promotes human mesenchymal stem cell proliferation and long-term passaging. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 84, 80-91 (2018).
  31. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  32. Cao, Y., et al. Isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues. J Vis Exp. 20, e63990(2022).
  33. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell Tissue Res. 347, 701-711 (2012).
  34. Li, Y., et al. Lysosome-Featured Cell Aggregate-Released Extracellular Vesicles Regulate Iron Homeostasis and Alleviate Post-Irradiation Endothelial Ferroptosis for Mandibular Regeneration. Adv Sci (Weinh). 12, 1-22 (2025).
  35. Longjohn, M. N., Christian, S. L. Characterizing Extracellular Vesicles Using Nanoparticle-Tracking Analysis. Methods Mol Biol. 2508, 353373(2022).
  36. Cantore, S., et al. Characterization of human apical papilla-derived stem cells. J Biol Regul Homeost Agents. 31, 901-910 (2017).
  37. Wang, Z., et al. Fibroblast growth factor 2 promotes osteo/odontogenic differentiation in stem cells from the apical papilla by inhibiting PI3K/AKT pathway. Sci Rep. 14, 19-35 (2024).
  38. Li, J., et al. TGF-beta2 and TGF-beta1 differentially regulate the odontogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Arch Oral Biol. 135, 1-15 (2022).
  39. Zhang, W., et al. Foxc2 and BMP2 Induce Osteogenic/Odontogenic Differentiation and Mineralization of Human Stem Cells from Apical Papilla. Stem Cells Int. 18, 23-36 (2018).
  40. Man, K., et al. An ECM-mimetic hydrogel to promote the therapeutic efficacy of osteoblast-derived extracellular vesicles for bone regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 10, 82-99 (2022).
  41. Ming, L., et al. Small extracellular vesicles laden oxygen-releasing thermosensitive hydrogel for enhanced antibacterial therapy against anaerobe-induced periodontitis alveolar bone defect. ACS Biomater Sci Eng. 10, 932-945 (2024).
  42. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Purification of mitochondria by sucrose step density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 14, 8-28 (2014).
  43. Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 2016, 299-310 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Extracellular VesiclesMesenchymal Stem CellsStem Cell AggregatesLarge Extracellular VesiclesSCAP Derived LEVs3D Cell CultureDifferential CentrifugationNanoparticle Tracking AnalysisHydrogel DeliveryCraniofacial Regeneration

Powiązane artykuły