Artykuł metodologiczny

Wyjaśnienie materialnych podstaw formuły Yiqi Qingjie wobec nefropatii IgA z wykorzystaniem UHPLC-Q-Orbitrap HRMS zintegrowanego z farmakologią sieciową

320 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70541

⸱

19 maja 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences., 2Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences., 3Department of New Drug Research and Development, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences.

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje zastosowanie ultrawydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu z hybrydową spektrometrią mas kwadrupolowo-Orbitrap o wysokiej rozdzielczości (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), połączoną z farmakologią sieciową i dokowaniem molekularnym, w celu przewidywania i walidacji podstaw materialnych wzoru Yiqi Qingjie (YQQJ) w leczeniu nefropatii IgA (IgAN).

Streszczenie

Badanie to wykorzystuje UHPLC-Q-Orbitrap HRMS do charakteryzacji składników YQQJ ekstrahowanych przez wodę i wchłanianych przez krew. Farmakologia sieciowa i molekularne dokowanie są dalej stosowane do przewidywania i weryfikacji materialnej podstawy leżącej u podstaw terapeutycznych efektów YQQJ przeciwko IgAN. Ekstrakt wodny i próbki surowicy YQQJ zostały przeanalizowane za pomocą UHPLC-Q-Orbitrap HRMS w celu scharakteryzowania składników chemicznych i identyfikacji związków wchłanianych przez krew. Identyfikacja związków została przeprowadzona na podstawie baz referencyjnych, opublikowanej literatury oraz kompleksowej oceny czasu retencji, dokładności masy jonów prekursorów, wzorców fragmentacji MS/MS oraz rozkładu izotopowego. Potencjalne cele prototypowych związków wchłanianych przez krew przewidywano na podstawie baz danych predykcji celów, natomiast cele związane z IgAN zbierano z zintegrowanych platform bioinformatycznych. Główne cele były przesiewane za pomocą analizy sieci PPI. Zbudowano sieć "złożony–cel–szlak–choroba" do identyfikacji kluczowych składników, a następnie przeprowadzono dokowanie molekularne w celu oceny interakcji między związkami rdzeniowymi a celami. W sumie zidentyfikowano 185 związków w wylocie wodnym YQJ. Wśród nich 28 związków trafiło do krwiobiegu w formach prototypowych. PPI zidentyfikowało 42 kluczowe cele związane z terapeutycznym efektem YQQJ w IgAN. Analizy wzbogacenia KEGG i GO wykazały udział w proliferacji komórek, zapaleniu i apoptozie oraz wzbogaceniu w kilku kluczowych szlakach, takich jak PI3K-Akt, MAPK i JAK-STAT. Analiza molekularnego dokowania przewidywała korzystne interakcje wiązania między sześcioma kluczowymi celami (CASP3, IGF1R, JUN, STAT3, PRKCB i PIK3CA) a trzema głównymi związkami wchłanianymi przez krew—kwasem deacetylaserulozydowym, kwasem geniposydowym i dioscyną—o konsekwentnie niskich energiach wiązania, co sugeruje potencjalne interakcje. Ta zintegrowana analiza ujawnia, że YQQJ wywiera działanie terapeutyczne przeciwko IgAN poprzez wiele składników i wielu celów. Za kluczowe aktywne składniki przyczyniające się do tych efektów sugeruje się kwas deacetylosalonozydowy i diosycynę.

Wprowadzenie

Nefropatia IgA (IgAN) jest jednym z najczęstszych pierwotnych zapaleń kłębuszów na świecie. Jego przejawy kliniczne są wysoce zróżnicowane, zazwyczaj objawiane jako mikroskopowa lub gruba krwiaczka, często towarzysząca różnemu stopniu białkomoczu, nadciśnienia i uszkodzenia nerek. Wcześniejsze badania sugerowały, że nawet 40% pacjentów przechodzi w niewydolność nerek w ciągu 20 lat od rozpoznania1; Jednak nowsze dowody wskazują na znacznie gorszą rokowanie, przy czym większość pacjentów rozwija niewydolność nerek w ciągu 10–15 lat, a tylko niewielka część utrzymuje funkcję nerek przez całe życie bez progresji 2,3,4. Chociaż terapie celowane niedawno osiągnęły postęp kliniczny w zarządzaniu IgAN, ich wysokie koszty i stosunkowo powolne poczęcie skuteczności pozostają poważnym wyzwaniem, a równowaga korzyści i ryzyka klinicznych pozostaje przedmiotem dyskusji 5,6.

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) wykazuje wyjątkowe zalety w leczeniu chorób złożonych. Charakteryzuje się stabilną skutecznością terapeutyczną, stosunkowo niską częstością wystąpień niepożądanych oraz wielocelowymi efektami synergicznymi7. W przeciwieństwie do leków farmakologicznych o jednym celu, formuły TCM zazwyczaj zawierają wiele bioaktywnych składników, które mogą jednocześnie modulować różne szlaki biologiczne. Ten wieloskładnikowy i wielocelowy sposób działania daje potencjalną przewagę terapeutyczną w leczeniu złożonych chorób, takich jak IgAN8. W teorii TCM IgAN nie ma konkretnej nazwy choroby, ale ogólnie klasyfikuje się ją jako "krwiomocznika", "obrzęk", "ból pleców", "wiatr nerek" oraz "chorobę wyżułową". Większość badaczy uważa, że jego główna patogeneza wiąże się z niedoborem Qi w płucach i śledziony, co prowadzi do utraty kontroli nad Qi obronnym i, w konsekwencji natarcie wiatru, wilgoci, ciepła i toksyn, co ostatecznie uszkadza nerki. Chociaż nerka jest głównym organem zaangażowanym, mogą być również dotknięte serce, wątroba, śledziona i płuca. Na podstawie tej wiedzy wiele badań koncentrowało się na identyfikacji ziołowych leków i formuł o właściwościach Qi-tonizujących, wzmacniających zewnętrznych, oczyszczających ciepło, detoksykujących i rozwiązujących wilgoć do klinicznego leczenia IgAN10,11.

Formuła Yiqi Qingjie (YQQJ) to skuteczna empiryczna recepta stosowana w Dziale Nefrologii w naszym szpitalu do leczenia IgAN. Formuła obejmuje siedem ziół, w tym Astragalus membranaceus (Huangqi), Lonicera japonica Thunb. (Jinyinhua), Rheum palmatum L. (Dahuang), Hedyotis diffusa Willd. (Baihuasheshecao), Dioscorea nipponica Makino (Chuanshanlong), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng) oraz Plantago asiatica L. (Cheqiancao). YQQJ pełni funkcje terapeutyczne takie jak tonifikacja Qi, konsolidacja zewnętrznej powierzchni, oczyszczanie ciepła, detoksykacja, aktywacja krążenia krwi oraz wspieranie diurezy12. Badania kliniczne wykazały, że YQQJ znacząco zmniejsza białkomocz i krwiomocz u pacjentów z IgAN, poprawia funkcję nerek oraz łagodzi objawy immunologiczne błony śluzowej, jednocześnie wykazując korzystny profil bezpieczeństwa 12,13.

Chociaż ta formuła wykazała korzystną skuteczność kliniczną, podstawa farmakologicznie aktywnych substancji pozostaje trudna do wyjaśnienia, ponieważ formuły TCM zawierają wiele składników chemicznych. Profilowanie chemiczne oparte wyłącznie na analizie chromatograficznej lub spektrometrycznej mas może ujawnić ogólny skład chemiczny wzoru; jednak nie jest w stanie określić, które związki są wchłaniane do krążenia układowego i bezpośrednio przyczyniają się do efektów terapeutycznych14. Ponadto konwencjonalne badania farmakologii sieciowej w dużej mierze opierają się na przewidywaniach opartych na bazie danych i zazwyczaj przesiewają związki kandydatów, korzystając z parametrów takich jak biodostępność doustna i podobieństwo do leku. Takie podejście może pominąć związki, które faktycznie wykazują działanie farmakologiczne in vivo15.

Aby złagodzić te ograniczenia, najnowsze badania coraz częściej stosują integracyjne strategie analityczne, które łączą ultra-wydajną chromatografię cieczową z hybrydową kwadrupolową i Orbitrap spektrometrią mas wysokiej rozdzielczości (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), farmakochemią surowicy oraz farmakologią systemową w badaniach TCM16,17. Farmakochemia surowicy identyfikuje związki, które po podaniu wchodzą do ogólnoustrojowego krążenia, dostarczając farmakokinetycznie istotnych dowodów na przesiewowe badania potencjalnych składników bioaktywnych18. Tymczasem UHPLC-Q-Orbitrap HRMS umożliwia bardzo dokładne wykrywanie i charakterystykę strukturalną składników chemicznych w złożonych macierzach ziołowych19.

W porównaniu z podejściami opartymi wyłącznie na profilowaniu chemicznym lub teoretycznym przewidywaniu celów, integracyjny workflow stosowany w tym badaniu — obejmujący identyfikację komponentów opartą na UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, przesiewowe badania farmakochemiczne surowice, analizę farmakologii sieciowej oraz walidację dokowania molekularnego — oferuje kilka zalet metodologicznych. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS umożliwia kompleksową i precyzyjną identyfikację złożonych składników chemicznych. Farmakochemia surowicy ogranicza kandydatów do tych, które faktycznie są wchłaniane do krążenia systemowego, co poprawia biologiczną wiarygodność kolejnych analiz sieci. Analiza farmakologii sieciowej oparta na eksperymentalnie potwierdzonych związkach pochłanianych pozwala na systemowe badanie mechanizmów wielocelowych i lepiej odzwierciedla holistyczne cechy farmakologiczne formuł TCM. Dokowanie molekularne zapewnia dodatkowo wstępną walidację obliczeniową przewidywanych interakcji związek z celem oraz wspiera racjonalne priorytetyzowanie kandydatów na cząsteczki do późniejszej weryfikacji eksperymentalnej. Łącznie ten integracyjny przepływ pracy zapewnia niezawodną, efektywną i fizjologicznie istotną strategię wyjaśniania materialnych podstaw i mechanizmów złożonych formuł ziołowych, takich jak YQQJ.

Ten sposób pracy jest szczególnie odpowiedni do badania farmakologicznie aktywnych substancji podstawowych i mechanizmów złożonych formuł ziołowych, gdy dane o wchłanianiu in vivo można uzyskać z badań farmakokinetycznych na zwierzętach lub ludziach. Jest szczególnie stosowalny do formuł o ustalonej skuteczności klinicznej, ale niejasnych składnikach aktywnych. Niemniej jednak należy uwzględnić kilka ograniczeń. Po pierwsze, dokładność przewidywania celów zależy od jakości i kompletności publicznych baz danych. Po drugie, workflow koncentruje się na prototypowych związkach wykrytych w obiegu i nie uwzględnia bioaktywnych metabolitów powstających in vivo. Po trzecie, prognozy uzyskane na podstawie analiz farmakologii sieciowej wymagają dalszej weryfikacji eksperymentalnej. Pomimo tych ograniczeń, workflow zapewnia efektywne i wiarygodne podejście do generowania hipotez i priorytetyzacji celów w mechanistycznych badaniach wzorów TCM.

Dlatego badanie wykorzystuje UHPLC-Q-Orbitrap HRMS do systematycznego charakteryzowania zarówno wodnych składników ekstraktu, jak i krążących związków YQQJ, tworząc tym samym stosunkowo kompleksową bazę potencjalnych aktywnych składników. Na podstawie tego zbioru danych analiza farmakologii sieciowej, połączona z walidacją dokowania molekularnego, przewiduje potencjalnie farmakologicznie aktywne składniki YQQJ w leczeniu IgAN i stanowi podstawę dla kolejnych badań mechanistycznych.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt były zgodne z Wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych wydanymi przez Chiński Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt. Wszystkie procedury w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Centrum Eksperymentów Zwierząt Szpitala Guang'anmen.

1. Administracja zwierząt i leków

  1. Użyj dwunastu 6-tygodniowych samców szczurów Sprague–Dawley (SD) o wadze 200–230 g.
  2. Wszystkie zwierzęta powinny być przechowywane w Centrum Eksperymentalnych Zwierząt.
    UWAGA: Utrzymuj temperaturę w domu na poziomie 20–26 °C oraz wilgotność względną na poziomie 40–70%. Użyj cyklu światła/ciemności 12 godzin i 12 godzin, aby symulować naturalne rytmy okołodobowe.
  3. Aklimatyzuj zwierzęta przez 7 dni w standardowych warunkach z darmowym dostępem do jedzenia i wody przed eksperymentem. Losowo podziel szczury na dwie grupy (n = 6 na grupę): grupę kontrolną i grupę leczoną lekami.
  4. Odnosi się do równoważnej dawki przeliczanej przez powierzchnię ciała między ludźmi a zwierzętami20. Podawaj skoncentrowany ekstrakt YQQJ doustnie w dawce 24,68 mL/(kg·dzień) grupie leczonej lekami. Podawaj grupie kontrolnej równocześnie równą ilość wody destylowanej, aby zapewnić synchroniczne uzdatnienie.
  5. Kontynuuj podawanie przez 1 dzień. Podziel całkowitą dawkę dzienną na trzy równe dawki (np. o 08:00, 13:00 i 18:00), aby zapewnić pełną dawkę w ciągu jednego dnia.
    UWAGA: Zwierzęta poczęstujmy przez 12 godzin przed ostatnim gavage, z darmowym dostępem do wody.
  6. Pobieraj próbki krwi po 2 i 8 godzinach po końcowym podaniu. Znieczulać szczury poprzez podanie 1% pentobarbitalu sodu (50 mg/kg) wewnątrzotrzewnejowego. Pobierz krew z aorty brzusznej.
  7. Pozostawić próbki krwi pionowo w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, następnie wiruj w 450 × g przez 5 minut w 4 °C. Sprawdź, czy supernatant (surowica) jest przezroczysty i wolny od hemolizy. Przelej surowicę supernatantową i przechowuj w temperaturze –80 °C do dalszej analizy.

2. Przygotowanie rozwiązań

  1. Przygotowanie roztworów testowych
    1. Zbieraj wszystkie surowe zioła YQQJ zgodnie ze wzorem. Dodaj 4 objętości oczyszczonej wody do garnka i namocz przez 20 minut.
      UWAGA: Do ziół dodano oczyszczoną wodę w stosunku 4:1 (v/w).
    2. Doprowadź mieszankę do wrzenia, a następnie konkuuj wywar przez 30 minut na niskim ogniu. Przefiltruj przez gazę i zbierz filtrat. Powtórz wywar z resztek z 4 objętościami wody przez kolejne 30 minut i ponownie przefiltruj.
    3. Połącz oba filtraty. Skoncentruj połączony roztwór za pomocą rotacyjnego parownika ustawionego na temperaturę kąpieli wodnej 60 °C, aż osiągnie stężenie 3 g/mL (w/v, równoważne surowym materiałom leczniczym).
    4. Sprawdź, czy skoncentrowany ekstrakt jest ciemną, lepką cieczą bez widocznych wydzieleń. Przechowuj w temperaturze 4 °C na później.
  2. Przygotowanie rozwiązań referencyjnych
    1. Dokładnie zważ następujące związki referencyjne: kwas deacetylaserulozydowy, kwas geniposydowy, kwas loganowy, morronyzyd, kwas chlorogenowy, swerozyd, kwas plantagoguanidynowy, ren-8-O-β-D-glukopiranozyd, genistyna, apigenina-7-glukozyd, diosetyna-7-O-β-D-glukopiranozyd, kalykozyna, protodioscyn, genisteina, diosetyna, pseudoprotodioscyn, formononetyna, 3-hydroksy-9,10-dimetoksypterkarpan, aloeemodyna, rein, dioscyn.
    2. Rozpuszcz każdy związek w metanolu, zawarj mieszankę przez 1 minutę, a następnie sonikatuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
    3. Rozcieńczaj każdy roztwór metanolem, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/mL dla każdego standardu.

3. Przygotowanie próbki

  1. Przygotowanie próbek ekstraktu YQQJ
    1. Pipeta 100 μL ekstraktu wodnego YQQJ do rurki wirówki o pojemności 1,5 mL. Dodaj 300 μL metanolu i wypląć wir przez 1 minutę. Wirówka w 1800 × g, 4 °C przez 10 minut. Upewnij się, że powstały supernatant jest czysty i wolny od zawieszonych cząstek.
    2. Weź 100 μL supernatantu i wymieszaj z 100 μL ultraczystą wodą, aby uzyskać rozcieńczenie 1:1. Delikatnie przewijcie i przenieście do fiolki z automatycznym próbkowaniem do analizy.
  2. Przygotowanie próbek surowicy zawierającej leki
    1. Pipeta 100 μL surowicy do rurki wirówki o pojemności 1,5 mL. Dodaj 300 μL metanolu i zachowuj wir przez 10 minut, aby zapewnić wytrącanie białka. Wirówka w 1800 × g., 4 °C przez 10 minut.
    2. Pobierz 270 μL supernatantu i przelej do czystej rurki. Odparuj supernatant do suchości za pomocą koncentratora odśrodkowego próżniowego ustawionego na 120 × g, 37 °C przez 4 godziny, aż powstanie widoczny pozostałość stała.
    3. Rekonfunduj resztę za pomocą 90 μL roztworu wodnego metanolu o stężeniu 50%. Wiruj przez 1 minutę, aby całkowicie rozpuścić resztę, następnie ponownie wiruj w 1800 × g, 4 °C przez 10 minut.
    4. Pobierz 80 μL ostatniego przezroczystego supernatantu i przelej go do fiolki z autopróbką do analizy.

4. Warunki analityczne

  1. Warunki chromatograficzne
    1. Przeprowadz separację chromatograficzną za pomocą systemu UHPLC wyposażonego w kolumnę chromatograficzną.
    2. Użyj binarnej fazy komórkowej (Faza A: woda zawierająca 0,1% kwasu mrówkowego; Faza B: acetonitryl). Zastosuj program elucii gradientu, jak pokazano w Tabeli 1, z przepływem 0,3 mL/min. Ustaw temperaturę kolumny na 40 °C, a objętość wtrysku na 6,0 μL.
      UWAGA: Specyfikacje kolumny to 2,1 mm × 100 mm, wymiary cząstek 1,8 μm.
  2. Warunki MS
    1. Analizować próbki za pomocą spektrometru masowego quadrupole-orbitrap wyposażonego w podgrzewaną sondę natryskową do jonizacji elektrorozpylającej (HESI).
    2. Ustaw parametry następująco: napięcie jonizacyjne: 3,7 kV (tryb dodatni) / 3,5 kV (tryb ujemny); temperatura kapilar: 320 °C; ciśnienie gazu w pochwie: 30 psi; ciśnienie gazu pomocniczego: 10 psi; temperatura rozpuszczalności: 300 °C; gaz ochrowy i gaz pomocniczy: azot; gaz kolizyjny: azot, 1,5 mTorr.
    3. Pobieranie danych w trybie pełnego skanowania/dd-MS2 . Ustaw pełne parametry skanowania następująco: rozdzielczość 70000, cel automatycznej kontroli wzmocnienia 1×106, maksymalny czas izolacji 50 ms, zakres skanowania m/z 100–1500.
    4. Zbieraj dane dd-MS2 z parametrami rozdzielczości 17500, cel automatycznej kontroli wzmocnienia 1×105, maksymalny czas izolacji 50 ms, wybierz górne n (n≤10) najbardziej intensywne jony macierzyste do fragmentacji wraz z mechanizmem dynamicznego wykluczania, okno izolacji m/z 2, energia kolizji 10 V, 30 V, 60 V oraz próg intensywności 1×105.

5. Przetwarzanie danych MS

  1. Przetwarzaj pozyskane dane MS za pomocą specjalistycznego oprogramowania do przetwarzania danych. Przejdź do modułu Import Data i prześlij surowe pliki danych.
  2. Wykonaj moduł Peak Picking i wykonaj dekonwolucję szczytową, aby grupować jony addukcji i generować cechy złożone.
  3. Przeszukaj referencyjne bazy danych związków, bazy danych predykcji celów oraz odpowiednią opublikowaną literaturę w celu identyfikacji kandydatów.
  4. Identyfikacja związków za pomocą dwóch uzupełniających się strategii identyfikacji opartych na wysokorozdzielczych danych MS.
    1. Identyfikacja oparta na dopasowaniu. Potwierdzaj związki na podstawie autentycznych standardów referencyjnych. Akceptuj identyfikacje tylko wtedy, gdy spełnione są wszystkie następujące kryteria:
      1. Dokładność masy: Błąd masowy zarówno jonów prekursorowych, jak i fragmentów musi mieścić się w granicach ±5 ppm.
      2. Podobieństwo widmowe: Wynik podobieństwa kosinusowego między eksperymentalnym widmem MS/MS a widmem MS/MS standardu referencyjnego musi wynosić ≥ 0,85.
      3. Rozkład izotopowy: Wynik dopasowania wzorców izotopowych musi wynosić ≥ 90%.
      4. Zachowanie chromatograficzne: Odchylenie czasu retencji między wykrytym związkiem a standardem referencyjnym musi wynosić < 0,2 min.
        UWAGA: Związki spełniające wszystkie powyższe kryteria są oznaczane jako MSI Poziom 1, co oznacza potwierdzoną identyfikację strukturalną.
    2. Identyfikacja oparta na wysokorozdzielczych danych MS oraz in silico spektralnych prognozach. Dla związków bez dostępnych standardów referencyjnych należy przeprowadzić domniemaną identyfikację na podstawie dokładnych pomiarów mas i obliczeniowej prognozy spektralnej. Akceptuj adnotacje tylko wtedy, gdy spełnione są następujące kryteria:
      1. Dokładność masy: Błąd masowy jonów prekursorowych musi mieścić się w granicach ±5 ppm, a błąd masowy jonów fragmentów musi mieścić się w granicach ±10 ppm.
      2. Podobieństwo spektralne: Porównaj eksperymentalne widmo MS/MS z teoretycznym widmem MS/MS generowanym ze złożonej struktury SMILES za pomocą algorytmu Progenesis QI. Akceptuj dopasowania z wynikiem współsinusowego podobieństwa ≥ 0,60.
      3. Rozkład izotopowy: Wynik dopasowania wzorców izotopowych musi wynosić ≥ 90%.
      4. Chromatograficzne przewidywanie zachowania: Odchylenie między eksperymentalnym czasem retencji a przewidywanym czasem retencji przez uczenie maszynowe musi wynosić < 1,0 min.
        UWAGA: Model predykcji czasu retencji został wytrenowany na podstawie eksperymentalnych danych chromatograficznych z ponad 2000 związków referencyjnych analizowanych w tych samych warunkach chromatograficznych. Związki spełniające te kryteria są oznaczane jako MSI Level 2, reprezentujące rzekomo zidentyfikowane związki o wysokiej pewności strukturalnej.

6. Farmakologia sieci

  1. Identyfikacja składników wchłanianych przez krew oraz celów związanych z IgAN
    1. Zaimportuj zidentyfikowane prototypowe składniki YQQJ wchłonięte przez krew do baz danych predykcji celów. Wybierz "Homo sapiens" jako gatunek docelowy i uzyskaj potencjalne cele. Zarejestruj je jako docelowy zestaw związków wchłanianych przez krew w YQQJ.
    2. Użyj słowa kluczowego "IgA Nefropatia", aby uzyskać cele chorób związanych z IgAN z zintegrowanych platform bioinformatycznych. Konsoliduj wyniki z wielu źródeł, aby zminimalizować błędy uprzedzenia.
      UWAGA: Użyj bazy danych białek, aby przekonwertować wszystkie odzyskane cele do formatu symbolu genu dla spójności.
  2. Budowa sieci interakcji białko-białko (PPI) oraz identyfikacja kluczowych celów
    1. Połącz docelowy zestaw związków wchłanianych przez krew YQQJ z zestawem docelowym dla choroby IgAN i wyodrębnij ich przecięcie.
    2. Prześlij przecięte cele na platformę PPI21. Konfiguruj ustawienia: ustaw organizm jako Homo sapiens, wynik pewności na 0,90 i odrzuć wszystkie odłączone węzły.
    3. Zaimportuj dane PPI do oprogramowania wizualizacyjnego22. Uruchom wtyczkę analizy topologicznej. Oblicz centralność stopnia (DC)23, centralność pomiędzy (BC)24 oraz centralność bliskości (CC)25.
    4. Przesiewaj główne terapeutyczne cele YQQJ względem IgAN, filtrując węzły z parametrami topologicznymi (DC, BC i CC) przekraczającymi medianę.
  3. Budowa i analiza zintegrowanej sieci "YQQJ – komponenty absorbowane przez krew–cele–szlaki–choroby"
    1. Przygotuj plik atrybutów węzła: Stwórz arkusz kalkulacyjny zawierający dwie kolumny. Oznacz pierwszą kolumnę Nazwa węzła , a drugą Typ węzła. Przypisz do każdego węzła jedną z pięciu kategorii (Formuła, Składnik wchłonięty przez krew, Cel przecięcia, Ścieżka lub Choroba).
    2. Przygotuj plik interakcji sieciowej (krawędziowy): Stwórz arkusz kalkulacyjny definiujący połączenia między węzłami (np. komponent absorbowany krwią do celu przecięcia). Upewnij się, że wszystkie nazwy węzłów są zgodne z tymi w pliku atrybutów węzła, aby uniknąć błędów mapowania.
    3. Import i budowanie sieci: Uruchom oprogramowanie do wizualizacji sieci. Przejdź do pliku > Import > Network , aby załadować plik brzegowy. W oknie podglądu zmapuj kolumny jako Węzeł Źródłowy i Węzeł docelowy i kliknij OK , aby wygenerować początkowy wykres.
    4. Mapuj atrybuty węzłów i ustaw style wizualne: Importuj plik atrybutów węzła za pomocą pliku > Import > Table. Otwórz panel Styl i przypisz kolumnę Typ węzła do konkretnych właściwości wizualnych, w tym kształtu węzła, koloru wypełnienia i rozmiaru.
    5. Wykonaj analizę topologiczną: Przejdź do Narzędzi > Analizuj Sieci, aby wykonać obliczenia topologiczne. Filtruj i identyfikuj podstawowe związki aktywne oraz kluczowe cele terapeutyczne na podstawie wartości stopni.
      UWAGA: Stosuj te same parametry topologiczne opisane w kroku 6.2, aby zapewnić spójność w identyfikacji węzłów rdzeniowych.
    6. Eksport obrazu sieci: Sfinalizuj układ sieci. Przejdź do File > Eksportuj > Network to Image, aby zapisać zoptymalizowaną wizualizację.
  4. Wzbogacanie GO i analizy ścieżek KEGG
    1. Wyślij listę genów: Otwórz internetową platformę do adnotacji funkcjonalnej. Przejdź do sekcji Krok 1: Zgłoś listę genów i zaślij wcześniej przefiltrowaną listę genów docelowych26.
    2. Wybierz gatunek: W rozwijanych menu dla kroku 2: Wprowadzanie jako gatunek oraz Krok 3: Analiza jako gatunek, wybierz H. sapiens. (człowiek), aby upewnić się, że analiza została przeprowadzona w odpowiednim kontekście biologicznym.
    3. Konfiguruj niestandardową analizę: Wybierz tryb Niestandardowej Analizy . W kategorii Wzbogacenie sprawdź następujące bazy danych: Gene Ontology (GO) Molecular Function (MF), GO Biological Process (BP), GO Cellular Component (CC) oraz Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Pathway.
    4. Ustaw progi istotności: ustaw próg wartości P na < 0,01, wzbogacenie minimalne ≥na 1,5 i nakładanie się na ≥ 3. Zachowaj wszystkie inne parametry na ich domyślnych ustawieniach.
    5. Wykonaj analizę: Kliknij przycisk Analiza wzbogacenia , aby przesłać zadanie i poczekaj na zakończenie obliczeń.
    6. Pobierz i eksportuj wyniki: Uzyskaj dostęp do strony raportu z wygenerowanej analizy. Kliknij przycisk pobierania, aby wyeksportować szczegółowe dane wzbogacania w formacie arkusza kalkulacyjnego, wraz z odpowiadającymi wykresami słupkowymi i mapami cieplnymi.

7. Weryfikacja dokowania molekularnego

  1. Pobierz wysokorozdzielcze (< 2,50 Å) trójwymiarowe struktury białkowe głównych celów oraz 2D struktury chemiczne rdzeniowych składników wchłanianych przez krew z baz danych biologii strukturalnej27.
  2. Uruchom oprogramowanie dokowania molekularnego i zaimportuj pobrane struktury.
  3. Wykonaj kolejno następujące kroki wstępnego przetwarzania: przejdź do Edytuj > Usuń wodę, aby wyeliminować cząsteczki wody; wybierz Edytuj > Usuń heteroatomy , aby wyrzucić niestandardowe reszty.
  4. Przejdź do edycji > Wodory > Dodaj > Tylko polarne , aby dodać atomy wodoru polarnego. Zapisz przetworzone struktury w formacie PDBQT za pomocą pliku > zapisz > zapisz PDBQT.
  5. Zdefiniuj miejsce dokowania za pomocą narzędzia Grid > Grid Box . Wymiary siatki były adaptacyjnie dostosowywane (20–100 Å), aby zapewnić pełne pokrycie przewidywanych obszarów wiązania.
  6. Zainicjalizuj parametry dokowania: Wybierz receptor przez dokowanie > makrocząsteczkę > Ustaw sztywną nazwę pliku i otwórz ligand przez dokowanie > Ligand > Open. Parametry dokowania ustalono: wyczerpawczość = 32, zakres energii = 3 kcal/mol, a do 10 trybów wiązania zachowano. Dla białek z kokrystalizowanymi ligandami siatka dokowania była wycentrowana na centroidzie ligandu z rozszerzeniem 8,0 Å, natomiast dla białek bez współkrystalizowanych ligandów przewidywano kieszenie wiązające za pomocą DoGSiteScorer z około 90% pokryciem.
  7. Wybierz Lamarckian Genetic Algorithm (LGA) jako strategię wyszukiwania. Wykonaj symulację przez dokowanie > uruchom AutoDock.
  8. Oceń powinowactwo wiązania na podstawie obliczonej energii wiązania (wynik dokowania)28.
    UWAGA: Niższa energia wiązania oznacza silniejszą przewidywaną bioaktywność oraz wyższą stabilność strukturalną kompleksu białko-ligand. Próg ≤ -5,0 kcal/mol jest zazwyczaj stosowany do identyfikacji korzystnej stabilności wiązania.

Wyniki

Analiza składników w ekstrakcie wodnem YQQJ
Analiza składników ekstraktu wodnego YQQJ została przeprowadzona na warunkach określonych w PROTOKOLE 4. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS został użyty zarówno w pełni pozytywnych, jak i ujemnych trybach pełnego skanowania jonów do profilowania wodnego ekstraktu YQQJ, a uzyskany chromogram bazowy szczytowy jonów (BPI) przedstawiono na Rysunku 1. Na tej podstawie samodzielnie utworzona baza danych składowych chemicznych połączona z charakterystyką spektralną MS/MS umożliwiła pomyślną identyfikację 185 związków z ekstraktu wodnego, z szczegółowymi informacjami podsumowanymi w Tabeli Uzupełniającej 1. Reprezentatywne wzorce dopasowania spektralnego i fragmentacji MS/MS stosowane do identyfikacji związków są zilustrowane na Rysunku Uzupełniającym 1. Analiza statystyczna kategorii związków wykazała, że flawonoidy i terpenoidy były dominującymi składnikami w YQQJ, stanowiąc 94 związki, co stanowi najliczniejszy odsetek.

Składniki YQQJ wchłaniane przez krew
Aby wyjaśnić bezpośrednie substancje bioaktywne in vivo, przeanalizowano próbki surowicy pobrane po podaniu YQQJ. Chromogram BPI surowicy pustej (Rysunek 2) został uwzględniony do porównania, aby odróżnić związki pochodzące z leków od endogennych składników surowic. Na podstawie BPI surowicy zawierającej lek (Rysunek 3) zidentyfikowano łącznie 28 prototypowych składników wchłoniętych do krwiobiegu, głównie flawonoidów, terpenoidów i sterydów. Ekstrahowane chromatogramy jonowe (EIC) reprezentatywnych związków z ekstraktu YQQJ, surowicy pustej oraz surowicy zawierającej lek dodatkowo potwierdziły obecność składników pochodzących z leków w krążeniu (Rysunek uzupełniający 2). Wśród nich 10 związków pochodzi od Spatholobus suberectus Dunn, 7 od Dioscorea nipponica Makino, 7 od Astragalus membranaceus, 6 od Hedyotis diffusa Willd., 6 od Lonicera japonica Thunb., 4 od Plantago asiatica L. oraz 4 od Rheum palmatum.L., jak podsumowano w Tabeli Uzupełniającej 1.

Docelowa prognoza składników YQQJ wchłanianych przez krew związanych z IgAN
Łącznie 28 zidentyfikowanych prototypowych składników wchodzących do krwiobiegu zostało wprowadzonych do baz danych predykcyjnych celów, co dało 459 potencjalnych celów. Tymczasem z zintegrowanych platform bioinformatycznych pobrano 2779 celów związanych z IgAN. Analiza przecięcia zidentyfikowała 247 nakładających się celów pomiędzy YQQJ a IgAN (Rysunek 4).

Budowa i analiza sieci PPI
247 przecinających się celów zostało przesłanych do platformy PPI, a oprogramowanie wizualizacyjne wykorzystano do przesiewania kluczowych celów na podstawie trzech parametrów topologicznych: DC, BC i CC. Ostatecznie zidentyfikowano łącznie 42 cele jako węzły rdzeniowe. Workflow używany do selekcji tych kluczowych celów jest podsumowany w Rysunku Uzupełniającym 3. W sieci PPI rozmiar i kolor węzła zmieniały się w zależności od wartości parametrów (rysunek 5), wśród których TP53, SRC, AKT1, ESR1 i STAT3 plasowały się wśród pięciu głównych celów rdzeniowych.

"Formuła–składniki wchłaniane przez krew–główne cele–szlaki–choroba" sieci YQQJ
Aby systematycznie ujawnić mechanizmy wieloskładnikowe i wielocelowe YQQJ wobec IgAN, skonstruowano sieć interakcji "Formuła–Składniki wchłaniane przez krew–Główne cele–Szlaki–Choroba" za pomocą oprogramowania do wizualizacji. Sieć składała się z 96 węzłów i 459 krawędzi, z których każda krawędź reprezentowała relację lub interakcję między dwoma węzłami (rysunek 6).

Analizy wzbogacania GO i KEGG
Analiza wzbogacania GO dla 42 kluczowych celów wykazała 1162 terminy BP, 52 CC i 92 składniki MF. Rysunek 7 przedstawia 10 najbardziej wzbogaconych terminów GO w kategoriach BP, CC i MF. Analiza wzbogacenia KEGG dodatkowo zidentyfikowała 182 szlaki związane z tymi głównymi celami. Rysunek 8 ilustruje 20 najważniejszych wzbogaconych szlaków ściśle powiązanych z patogenezą IgAN. Na tych wykresach głębsze czerwone kolory wskazują na większą istotność statystyczną, podczas gdy większe rozmiary bąbelków lub dłuższe słupki oznaczają większą liczbę wzbogaconych celów w każdej ścieżce.

Ocena dokowania molekularnego
W niniejszym badaniu, na podstawie wcześniejszej analizy kluczowych celów i powiązanych szlaków YQQJ w leczeniu IgAN 29,30,31,32, wybrano sześć kluczowych celów, w tym CASP3 (PDB ID: 6X8I), IGF1R (PDB ID: 1JQH), JUN (PDB ID: 8RPP), STAT3 (PDB ID: 6NJS), PRKCB (PDB ID: 8SE3) oraz PIK3CA (PDB ID: 5FI4), jako białka receptorowe do molekularnego dokowania. Odpowiadając podstawowej patogenezie TCM IgAN, definiowanej jako "patogenny wiatr, wilgotne ciepło i toksyny atakujące nerki", wybrano reprezentatywne aktywne składniki o właściwościach oczyszczających ciepło, wilgoć i detoksykujące jako ligandy, mianowicie kwas deacetylasperulozydowe i geniposydynowy z Hedyotis diffusa Willd. oraz dioscynę z Dioscorea nipponica. Makino. Wyniki dokowania przedstawiono na rysunku 9. Spośród wszystkich kombinacji ligand-receptor dioscyna wykazywała wyraźnie niższe energie wiązania przy wszystkich wybranych celach, co sugeruje wyższą przewidywaną afinitet wiązania. Poza interakcjami między JUN a kwasem deacetylaserulozydowym/kwasem geniposydowym, pozostałe pary dokujące również wykazały korzystne aktywności wiązania. Reprezentatywne zgodności dokowania 3D przedstawiono na rysunku 10.

figure-results-1
Rysunek 1: Chromogramy jonów szczytowych bazowych ekstraktu wodnego YQQJ. (A) Dodatnia faza jonowa (BPI) chromatogram. (B) Chromogram BPI w trybie ujemnym jonowym. Chromatogramy pokazują ogólny profil chemiczny ekstraktu wodnego YQQJ w ustalonych warunkach HRMS UHPLC-Q-Orbitrap. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Chromogramy jonów szczytowych zasad surowicy pustej. (A) Dodatnia faza jonowa (BPI) chromatogram. (B) Chromogram BPI w trybie ujemnym jonowym. Chromatogramy reprezentują profil tła surowicy endogennej używany jako kontrolny punkt do porównania z surowicą zawierającą leki, aby odróżnić składniki pochodzące od substancji endogennych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Chromogramy jonowe bazy w surowicy zawierającej YQQJ. (A) Dodatnia faza jonowa (BPI) chromatogram. (B) Chromogram BPI w trybie ujemnym jonowym. Chromatogramy reprezentują profil składników wchłoniętych przez krew wykrytych w surowicy po podaniu YQQJ. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Diagram Venna nakładających się celów między YQQJ a IgAN. Diagram pokazuje liczbę przewidywanych celów YQQJ, celów związanych z IgAN oraz ich przecięcia, podkreślając wspólne cele potencjalnie zaangażowane w działanie terapeutyczne. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5: Sieć interakcji białko-białko (PPI) kluczowych celów. Węzły reprezentują cele białkowe, a krawędzie reprezentują interakcje między celami. Rozmiar węzła i intensywność koloru odpowiadają wartościom stopni, przy czym większe i ciemniejsze węzły wskazują na wyższą łączność w sieci. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-6
Rysunek 6: Zintegrowana sieć komponentów YQQJ, celów, szlaków i chorób. Sieć ilustruje zależności między wzorem, składnikami wchłanianymi przez krew, głównymi celami, szlakami oraz IgAN. Trójkąt symbolizuje chorobę; Koło symbolizuje ścieżki; Węzeł w kształcie litery V reprezentuje wzór YQQJ; diament symbolizuje zioła; Heksagon reprezentuje składowe; Oktagon reprezentuje prototypowe elementy wchłaniane przez krew; Prostokąt reprezentuje cele. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-7
Rysunek 7: Analiza wzbogacania GO dla kluczowych celów. Wykres słupkowy pokazuje 10 najważniejszych wzbogaconych terminów ontologii genów w kategoriach BP, CC i MF. Oś x reprezentuje terminy GO, a oś y pokazuje −log10(wartość p), co wskazuje na znaczenie wzbogacenia. Skróty: BP = Proces biologiczny; CC = składnik komórkowy; MF = Funkcja molekularna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-8
Rysunek 8: Analiza wzbogacenia szlaku KEGG dla kluczowych celów. Wykres bańki pokazuje 20 najbardziej wzbogaconych ścieżek KEGG. Rozmiar kropki wskazuje liczbę wzbogaconych genów, a gradient koloru oznacza −log10(wartość p), przy czym bardziej czerwone kolory wskazują na wyższą istotność statystyczną. Oś x pokazuje stosunek genów, a oś y zawiera składniki szlaku. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-9
Rysunek 9: Mapa ciepła energii wiązania dokowania molekularnego. Mapa ciepła pokazuje energie wiązania (kcal/mol) między celami rdzeniowymi a kluczowymi związkami wchłanianymi przez krew. Niższe wartości energii wiązania wskazują na silniejszą przewidywaną więźność. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-10
Rysunek 10: Reprezentatywne konformacje dokowania molekularnego. (A) Wiązanie konformacji kwasu deacetylasparulozydowego z CASP3. (B) Wiązanie potwierdzenia dioscyny ze STAT3. (C) Wiązanie konformacji kwasu geniposydowego z PIK3CA. Obrazy pokazują przewidywane interakcje ligand–białko oraz orientację wiązania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek uzupełniający 1: Identyfikacja strukturalna reprezentatywnych związków za pomocą wysokiej rozdzielczości MS/MS. (A) Porównanie spektralne od głowy do ogona kwasu deacetylosalonozydowego pomiędzy spektrum eksperymentalnym (góra, czerwony) a spektrum bazy referencyjnej (dolny, niebieski). (B) Wysokorozdzielcze spektrum fragmentacji kwasu deacetylosalonozydowego MS/MS. (C) Porównanie spektralne od głowy do ogona kwasu geniposydowego z bazą danych referencyjnych. (D) Eksperymentalne spektrum fragmentacji kwasu geniposydowego w MS/MS. (E) Porównanie spektralne Dioscyny od głowy do ogona z bazą danych referencyjnych. (F) Wysokorozdzielcze spektrum fragmentacji MS/MS Dioscyn. Te panele ilustrują dopasowanie spektralne stosowane do identyfikacji złożonych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Wyodrębnione chromatogramy jonowe (EIC) reprezentatywnych związków w próbkach. (A) EIC kwasu deacetylasolazolozydowego. (B) EIC kwasu geniposydowego. (C) EIC Dioscin. Dla każdego panelu górny ślad reprezentuje ekstrakt wodny YQQJ (ZY), środkowy ślad to puste serum kontrolne (KBX), a dolny ślad to próbki surowicy zawierające składniki wchłonięte przez krew po podaniu YQQJ (GYX). Porównanie podkreśla obecność związków pochodzących z leków w surowicy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Przepływ pracy przy selekcji kluczowych celów. Schemat blokowy ilustruje etapowy proces identyfikacji celów, w tym przewidywanie celów złożonych, zbieranie celów związanych z IgAN, analizę przecięć, budowę sieci PPI oraz przesiewanie kluczowych celów na podstawie parametrów topologicznych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Czas (min)Faza mobilna
A (v%)B (v%)
0982
1.0982
14.07030
25.00100
28.00100
28.1982
30.0982

Tabela 1: Program elucii gradientu UHPLC. Tabela przedstawia skład fazy ruchomej i warunki gradientu stosowane przy separacji chromatograficznej, w tym punkty czasowe oraz odpowiednie proporcje rozpuszczalników wodnych (faza A) i organicznych (faza B).

Tabela uzupełniająca 1: Zidentyfikowane składniki chemiczne ekstraktu wodnego YQQJ. Tabela zawiera listę związków zidentyfikowanych przez UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, w tym prototypowe składniki wchłaniane przez krew (A1–A28), wraz z ich klasyfikacją i pochodzeniem ziołowym. Skróty: BHSSC = Hedyotis diffusa Willd.; CSL = Dioscorea nipponica Makino; DH = Rheum palmatum L.; JXT = Spatholobus suberectus Dunn; HQ = Astragalus membranaceus.; CQC = Plantago asiatica L.; JYH = Lonicera japonica. Thunb. Klasy związków obejmują A = alkaloidy; Ald = Aldehydy; F = flawonoidy; N = nukleozydy; O = Inni; OA = kwasy organiczne; P = fenole; PA = kwasy fenolowe; Phe = fenylopropanoidy; Q = Quinones; S = Sacharydy; Ste = sterydy; T = Terpenoidy; Taniny = Taniny. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W niniejszym badaniu zastosowano zintegrowaną strategię łączącą "identyfikację HRMS UHPLC-Q-Orbitrap – analizę farmakochemii surowicy – przewidywanie farmakologii sieciowej – walidację dokowania molekularnego", aby systematycznie wyjaśnić potencjalne podstawy materialne i mechanizmy YQQJ w leczeniu IgAN. W przeciwieństwie do wcześniejszych badań, które opierały się głównie na SM do analizy chemicznych składników formuł ziołowych, a następnie przewidywały mechanizmy wyłącznie za pomocą farmakologii sieciowej16, farmakochemia surowicy opiera się na procesie "złożone składniki ziołowe – składniki wchłaniane przez krew – bezpośrednie substancje aktywne in vivo – farmakodynamiczna podstawa materiału". Poprzez identyfikację składników wchodzących do obiegu ogólnoustrojowego po podaniu, podejście to jest powszechnie uznawane za skuteczną strategię identyfikacji farmakodynamicznej podstawy materiałowej formuł TCM.

W tym badaniu analiza HRMS UHPLC-Q-Orbitrap początkowo zidentyfikowała 185 składników YQQJ, z czego 28 potwierdzono jako prototypowe związki wchłaniane przez krew, co stanowiło wiarygodną podstawę chemiczną dla kolejnych badań mechanistycznych. Dokładność tej identyfikacji zależała od kompleksowego dopasowania czasu retencji, dokładnej masy oraz informacji o fragmentacji MS/MS14. Na podstawie strategii farmakochemii surowicy te prototypowe związki wchłaniane przez krew zostały wykorzystane jako punkt wyjścia do budowy sieci, co zwiększyło znaczenie między składnikami ziołowymi a skutecznością in vivo33. Integrując cele przecinające się z chorobą złożoną z przesiewowym rdzeniem węzłów opartych na PPI, a następnie analizami wzbogacenia GO i KEGG, zidentyfikowano15 kluczowych szlaków sygnalizacji związanych z IgAN. Wyniki dokowania molekularnego sugerowały, że główne składniki wchłaniane przez krew pochodzą z Hedyotis diffusa Willd. i Dioscorea nipponica Makino.może oddziaływać z kluczowymi celami na podstawie przewidywanych powinowactw wiązania, a nie eksperymentalnie potwierdzonej aktywności funkcjonalnej. Wyniki te wspierają hipotezę, że kwas deacetylaserulozydowy, kwas geniposydowy oraz dioscyna mogą być potencjalnymi kluczowymi składnikami farmakodynamicznymi YQQJ, do czasu dalszej weryfikacji eksperymentalnej.

Z technicznego punktu widzenia kluczowe było wstępne przygotowanie próbek. Ze względu na złożoność surowicy oraz obecność endogennych białek (np. hormonów i enzymów), zakłócenia w wykrywaniu składników wchłanianych przez krew są nieuniknione. W tym badaniu zastosowano wytrącanie metanolu w celu wzbogacenia analitów i zmniejszenia interferencji tła, zapewniając zarówno czułość, jak i dokładność analizy MS34. Jeśli chodzi o punkty czasowe pobierania próbek krwi, różne składniki w ziołowych preparatach mogą wykazywać różne wzorce wchłaniania i przemian in vivo, co wpływa na ich wykrywalność w surowici. Dlatego na podstawie wstępnych badań próbki surowicy pobierano w ciągu 2 i 8 godzin po ostatecznym podaniu, aby zmaksymalizować pokrycie krążących składników.

Kilka kroków proceduralnych okazało się szczególnie istotnych dla skutecznej realizacji tego przepływu pracy. Dokładna identyfikacja związków w dużej mierze opiera się na łącznej ocenie czasu retencji, wysokiej rozdzielczości dokładności masy oraz diagnostycznych jonów fragmentów MS/MS. Ponadto odpowiednie punkty pobierania próbek surowicy są niezbędne do wychwycenia składników wchłoniętych przez krew, które mogą pojawić się w krążeniu na różnych etapach po podaniu. Dlatego konieczne jest staranne zoptymalizowanie warunków wstępnej obróbki próbek i separacji chromatograficznej, aby zapewnić niezawodne wykrywanie prototypowych związków w złożonych macierzach biologicznych.

Potencjalne wyzwania analityczne mogą pojawić się podczas przygotowywania próbki i analizy MS. Na przykład niepełne wytrącanie białek może powodować efekty matrycowe, które tłumią efektywność jonizacji, podczas gdy nadmierny szum tła może zmniejszać czułość detekcyjną. Problemy te można złagodzić poprzez optymalizację proporcji rozpuszczalnika podczas wytrącania białek, poprawę warunków separacji chromatograficznej oraz dostosowanie parametrów akwizycji MS. Podczas przetwarzania danych mogą wystąpić fałszywie dodatnie adnotacje złożone, gdy opiera się wyłącznie na dopasowaniu bazy danych; dlatego zaleca się ręczną weryfikację wzorców fragmentacji MS/MS oraz zachowań retencyjnego, aby poprawić niezawodność identyfikacji.

W tej pracy uwzględniono kilka kwestii metodologicznych. Po pierwsze, zamiast stosować konwencjonalne kryteria, takie jak biodostępność doustna i podobieństwo do leku, do przewidywania celów stosowano jedynie eksperymentalnie potwierdzone składniki wchłaniane przez krew. Takie podejście zapobiegało potencjalnemu pominięciu związków aktywnych z powodu ustalonych progów filtracji oraz wyeliminowało nieistotne składniki, które nie są biodostępne in vivo, wzmacniając tym samym fizjologiczne znaczenie przewidywania sieci16. Po drugie, wybór aktywnych ligandów do dokowania koncentrował się szczególnie na głównych składnikach pochodzących z ziół mających funkcje "rozpraszania wilgoci wiatrowej i oczyszczania toksyn cieplnych" (Hedyotis diffusa Willd. i Dioscorea nipponica Makino.), ustanawiając mechanistyczny most między patologiczną koncepcją TCM "toksyny wiatr-wilgoci-cieplny atakującej nerki" a współczesnymi cechami patologicznymi IgAN. Stanowi to wstępne dowody wspierające teorię korelacji wzorcow–wzorzec TCM. Po trzecie, biorąc pod uwagę potencjalne różnice w rozmiarze i jakości danych w różnych bazach danych, zintegrowano wiele platform, aby poszerzyć zasięg celów i zmniejszyć stronniczość wprowadzaną przez pojedynczą bazędanych.

W porównaniu z konwencjonalnymi strategiami, które bezpośrednio stosują farmakologię sieciową do wszystkich wykrytych składników chemicznych, obecny workflow kładzie nacisk na priorytetyzację związków opartą na dowodach na podstawie eksperymentalnie wykrytych składników wchłoniętych przez krew. Ten proces filtracji stopniowej zmniejsza liczbę kandydatów na związki wchodzące do analizy obliczeniowej i poprawia interpretowalność sieci interakcji związk–cel. Ponadto, w przeciwieństwie do badań zorientowanych na metabolomikę, które głównie obejmują endogenne zaburzenia metaboliczne, obecna strategia koncentruje się na egzogennych związkach prototypowych pochodzących z leków ziołowych, co umożliwia bardziej bezpośrednie przypisywanie aktywności farmakologicznej konkretnym składnikom ziołowym.

Z praktycznego punktu widzenia metodologicznego ten workflow oferuje kilka zalet w badaniu złożonych formuł ziołowych. Integracja HRMS z farmakochemią surowicy umożliwia wiarygodną identyfikację biodostępnych składników biologicznych, a późniejsze połączenie farmakologii sieciowej i dokowania molekularnego tworzy hierarchiczne ramy analityczne, które łączą dowody chemiczne z mechanistycznym przewidywaniem. Ponadto ograniczenie budowy sieci do eksperymentalnie zweryfikowanych związków zmniejsza złożoność sieci i ułatwia wyraźniejszą identyfikację kluczowych interakcji związk–cel.

To badanie ma również swoje ograniczenia. Po pierwsze, farmakologia sieciowa i dokowanie molekularne to predykcyjne podejścia obliczeniowe. Silne powinowactwo wiązania niekoniecznie przekłada się na biologiczną regulację in vivo, ponieważ dokowanie molekularne nie uwzględnia dynamiki białek, kontekstu komórkowego ani sygnalizacji w dalszej fazie. Ponadto obecny protokół dokowania nie obejmował walidacji ponownego dokowania za pomocą ligandów współkrystalizowanych ani benchmarkingu z znanymi inhibitorami, co może ograniczać ocenę dokładności dokowania. Przyszłe badania obejmujące walidację opartą na RMSD, symulacje dynamiki molekularnej oraz testy eksperymentalne dodatkowo wzmocnią wiarygodność tych prognoz. Obecnie nasza grupa zakończyła walidację mechanistyczną, wykazując, że dioscyna działa poprzez szlak JAK2/STAT3, co w pewnym stopniu wzmacnia wiarygodność przewidywania i zapewnia częściowe wsparcie eksperymentalne dla kluczowych celów zidentyfikowanych w badaniu, choć inne interakcje komponent–cel nadal wymagają potwierdzenia36. Po drugie, wpływ proporcjonalnej zgodności i zależności dawkowania między ziołami nie został uwzględniony w obecnej analizie. Przyszłe badania mogą wprowadzić modele sieci ważone dawką i efektem, aby lepiej odzwierciedlać praktyki kliniczne przepisywania37.

Podsumowując, obecny workflow — wysokorozdzielcza identyfikacja składników wchłoniętych przez krew oparta na SM, analiza celów i szlaków oparta na farmakologii sieciowej oraz walidacja dokowania molekularnego — umożliwia efektywne zawężenie bazy substancji aktywnej i celów działania z złożonej formuły ziołowej. Daje to jasny kierunek eksperymentalny do dalszej weryfikacji biologicznej i przyspiesza mechanistyczne badania wzorów TCM. W przyszłości integracja metabolomiki przestrzennej, modeli organoidów oraz technologii multiomiki może umożliwić dynamiczną i trójwymiarową walidację oraz rozszerzenie obecnych wyników w systemach, które dokładniej oddają warunki fizjologiczne i patologiczne, dostarczając tym samym bardziej solidnych dowodów na wyjaśnienie naukowych podstaw wzorów TCM.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Prace te zostały wsparte przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 81973675), Wysoki Poziom Projektu Promocji Chińskich Szpitali Medycznych (Grant nr HLCMHPP2023039) oraz Pekińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych (grant nr 7252259).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AutoDock 4.2.6Instytut Badań nad Scenariuszami-
Kolumna chromatograficznaWaters Corp.ACQUITY UPLC HSS T3
Wysokoobrotowa chłodnicza wirówkaTechnologia Laboratorium HettichMikro 220R
Zintegrowane platformy bioinformatyczneWeizmann   Instytut  of  Nauka-Baza danych GeneCards (https://www.genecards.org/)
Zintegrowane platformy bioinformatyczneThe  Johns  Hopkins  University  School  of  Medycyna-Baza danych OMIM (https://omim.org/).
LC-MS/4 L AcetonitrylThermo Fisher ScientificA955-4
LC-MS/4 L MetanolThermo Fisher ScientificA456-4
LC-MS/4 L WaterThermo Fisher ScientificW6-4
LC-MS/50 mL kwasu mrówkowegoThermo Fisher ScientificA117-50
Oprogramowanie do przetwarzania danych ze spektrometrii masWaters Corp.-Oprogramowanie Progenesis QI 3.0
Oprogramowanie dokujące molekularneLaboratorium OlsonaAutoDock 4.2.6
Platforma PPIFirma zajmująca się bazami danych STRING-Platforma internetowa STRING (https://string-db.org)
Baza danych białekEuropejski Instytut Bioinformatyki; Szwajcarski Instytut Bioinformatyki; Źródło informacji o białkach-Platforma UniProt (https://www.uniprot.org/)
Kwadrupolowy spektrometr masowy orbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR
Referencyjne bazy danych związkówTCM Pro 2.0, Beijing Hexin Technology Co., Ltd.-
Rotacyjny parownikShanghai Titan Scientific Co., LtdTR-3L
Bazy danych biologii strukturalnej.Laboratorium Narodowe Brookhaven-Baza danych RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)
Bazy danych biologii strukturalnej.Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej-Baza danych PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
Bazy danych predykcji celówSIB Szwajcarski Instytut Bioinformatyki-Baza danych SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch)
Bazy danych predykcji celówSzanghaj   Instytut  of  Materia   Medica-Baza danych TCMSP (https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)
Wtyczka do analizy topologicznej--Wtyczka Centiscape 2.2; Analizator sieci
System UHPLCVanquish Flex-
Ultrawydajny chromatograf cieczyThermo Fisher ScientificVanquish Flex UHPLC
Ekstraktor ultradźwiękowyKunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.KQ3200D
Koncentrator odśrodkowy próżniowyNingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd.SCIENTZ-1LS
Oprogramowanie do wizualizacji--Cytoscape 3.10.4
Platforma do adnotacji funkcjonalnej oparta na sieci.Broad  Instytut-Platforma online Metascape (https://metascape.org)

Bibliografia

  1. Pattrapornpisut, P., Avila-Casado, C., Reich, H. N. IgA nephropathy: Core curriculum 2021. Am J Kidney Dis. 78 (3), 429-441 (2021).
  2. Pitcher, D., et al. Long-term outcomes in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (6), 727-738 (2023).
  3. Shen, X., et al. Long-term outcomes of IgA nephropathy in China. Nephrol Dial Transplant. 40 (6), 1137-1146 (2025).
  4. Roberts, I. S. D. Pathology of IgA nephropathy: A global perspective. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 71-74 (2024).
  5. Floege, J., Bernier-Jean, A., Barratt, J., Rovin, B. Treatment of patients with IgA nephropathy: A call for a new paradigm. Kidney Int. 107 (4), 640-651 (2025).
  6. Zhang, Y., Zhang, H. Current understanding and new insights in the treatment of IgA nephropathy. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 75-79 (2024).
  7. Kang, S. Comparative analysis of western medicine and traditional Chinese medicine. 4th Int. Conf. Social Sciences and Humanities and Arts (SSHA 2025), 2025, , 350-355 (2025).
  8. Wang, X. H., et al. Traditional Chinese medicine in treating IgA nephropathy. J Transl Intern Med. 9 (3), 161-167 (2021).
  9. Zeng, Q., Xu, J. L., Liang, Y., Yu, R. H. Etiology and treatment progress of IgA nephropathy. Med Recapitulate. 28 (1), 163-167 (2022).
  10. Guo, T., et al. Regulation of immune dysfunction in IgA nephropathy. Chin J Basic Med Tradit Chin Med. 30 (3), 552-555 (2024).
  11. Deng, Q. H., Zou, D., Zhang, S. L., Zhou, X. Regulation of mucosal immunity in IgA nephropathy. Acta Chin Med. 40 (5), 1026-1031 (2025).
  12. Zhang, S. Q., Rao, X. R., Dai, X. W. Clinical observation of Yiqi Qingjie Fang. Guangming J Chin Med. (12), 44-45 (2006).
  13. Dong, M. Y., et al. Efficacy of Yiqi Qingjie Fang combined with immunosuppressants. Chin J Integr Tradit West Med. 39 (7), 791-797 (2019).
  14. Yu, Y., Yao, C., Guo, D. A. Chemical basis of traditional Chinese medicine. Acta Pharm Sin B. 11 (6), 1469-1492 (2021).
  15. Zhou, W. X., Cheng, X. R., Zhang, Y. X. Network pharmacology: A new concept. Chin J Pharmacol Toxicol. 26 (1), 4-9 (2012).
  16. Huang, Q., et al. Active components of Eucommia ulmoides. Chin J New Drugs Clin Rem. 40 (6), 460-469 (2021).
  17. Zhang, A. H., et al. Chinmedomics approach. Engineering. 5 (1), 60-68 (2019).
  18. Wang, X., Zhang, A., Sun, H., Yan, G. Serum pharmacochemistry of TCM. Phytother Res. 31, 7-14 (2017).
  19. Liu, R., Zhao, Z., Dai, S., Che, X., Liu, W. Bioactive compound identification. J Agric Food Chem. 67 (13), 3811-3825 (2019).
  20. Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. Pharmacological experimental methodology. Chin Pharmacol Bull. (1), 19(1992).
  21. Szklarczyk, D., et al. STRING v11 database. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D607-D613 (2019).
  22. Shannon, P., et al. Cytoscape software. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  23. Jeong, H., Mason, S. P., Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Protein network centrality. Nature. 411 (6833), 41-42 (2001).
  24. Joy, M. P., Brock, A., Ingber, D. E., Huang, S. High-betweenness proteins. J Biomed Biotechnol. (2), 96-103 (2005).
  25. Wuchty, S., Stadler, P. F. Centers of complex networks. J Theor Biol. 223 (1), 45-53 (2003).
  26. Zhou, Y., et al. Metascape resource. Nat Commun. 10 (1), 1523(2019).
  27. Burley, S. K., et al. RCSB PDB resources. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D564-D574 (2025).
  28. Laskowski, R. A., Swindells, M. B. LigPlot+. J Chem Inf Model. 51 (10), 2778-2786 (2011).
  29. Cheung, C. K., et al. Pathogenesis of IgA nephropathy. Nat Rev Nephrol. 21 (1), 9-23 (2025).
  30. Zhao, L., et al. Triptolide and IgA nephropathy. Cell Prolif. 55 (9), e13278(2022).
  31. Tao, J., et al. JAK-STAT activity in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (7), 973-982 (2020).
  32. Cox, S. N., et al. Wnt/β-catenin and PI3K/AKT pathways. Kidney Int. 78 (4), 396-407 (2010).
  33. Nie, X., et al. Huagan Jian analysis. Chin Tradit Herb Drugs. 53 (2), 382-394 (2022).
  34. Wu, X. W., et al. Serum pharmacochemistry methodology. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 25 (3), 173-179 (2019).
  35. Abbasi, K., et al. Deep learning in drug target prediction. Curr Med Chem. 28 (11), 2100-2113 (2021).
  36. Zhou, L., et al. Dioscorea nipponica mechanisms. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120272(2025).
  37. Zhang, K. Y., et al. Dose–effect network pharmacology. Chin J Hosp Pharm. 43 (7), 738-747 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

dokowanie molekularnezwi zki wch aniane do krwiidentyfikacja zwi zk wsie oddzia ywa bia kowychcie ka KEGGtradycyjna medycyna chi ska
Wyjaśnienie materialnych podstaw formuły Yiqi Qingjie wobec nefropatii IgA z wykorzystaniem UHPLC-Q-Orbitrap HRMS zintegrowanego z farmakologią sieciową
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.