Method Article

Rozszyfrowywanie epitranskryptomu: In Silico Wgląd w sieć regulacji m6A w raku piersi

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia podejście do przeprowadzania in silico analiz genetycznych, molekularnych i prognostycznych regulatorów modyfikacji m6A poprzez integrację profili mutacji, zmian liczby kopii, ekspresji genów oraz wyników klinicznych przy użyciu publicznie dostępnych zestawów danych z The Cancer Genome Atlas (TCGA), projektu Genotype-Tissue Expression (GTEx) oraz platform mikroarray.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N6-metyloadenozyna (m6A) jest najbardziej obfitą wewnętrzną modyfikacją RNA w transkryptach eukariotycznych i odgrywa krytyczną rolę w metabolizmie RNA, ekspresji genów i homeostazie komórkowej. Dysregulacja regulatorów m6A, w tym “pisarzy”, “kasujących” i “czytających”, była coraz częściej wiążana z biologią raka; jednak ich pełne role w raku piersi pozostają niezrozumiałe. Głównym celem tego artykułu dotyczącego metod jest zapewnienie początkującym w bioinformatyce krok po kroku ram dla wykorzystywania publicznie dostępnych zbiorów danych dotyczących raka do przeprowadzania analiz mutacyjnych, oceny zmian ekspresji genów oraz badania ich związku z przeżyciem pacjentów. Jako przypadek badawczy, regulatorzy m6A w raku piersi byli analizowani za pomocą zbiorów danych z Cancer Genome Atlas (TCGA), projektu Genotype-Tissue Expression (GTEx) i platform mikroarray. Profile transkryptomowe były systematycznie analizowane, aby pokazać przepływy pracy oceny prognostycznego znaczenia komponentów regulacyjnych m6A w raku piersi. Przy użyciu tego ramowania analitycznego zidentyfikowano odrębne wzorce zmian genetycznych i różnicowej ekspresji wśród kluczowych regulatorów m6A. Kilka regulatorów, w tym METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 i RBMX, było związane z lepszym przeżyciem pacjentów, podczas gdy YWHAG był związany z gorszym ogólnym przeżyciem. To badanie zapewnia kompleksowy przegląd systemowej genomiki genów regulacyjnych m6A w raku piersi, pokazując praktyczny i powtarzalny internetowy przepływ pracy w dziedzinie bioinformatyki. Te odkrycia poszerzają rozumienie regulacji epitranskryptomu w raku piersi i oferują podstawę dla opracowania nowych strategii diagnostycznych i terapeutycznych opartych na m6A.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje epitranskryptomiczne reprezentują ważną warstwę posttranskrypcyjnej regulacji genów i przyczyniają się do różnorodnych procesów komórkowych i stanów chorobowych. Spośród ponad 170 zidentyfikowanych do tej pory modyfikacji RNA, N6-metyloadenozyna (m6A) jest najbardziej rozpowszechniona i dobrze scharakteryzowana w eukariotycznych mRNA1. Instalowana przez kompleksy „pisarzy” obejmujące METTL3/METTL14, usuwana przez „szumaty” obejmujące FTO i ALKBH5 oraz interpretowana przez białka „czytające” obejmujące członków rodziny YTH i IGF2BP, m6A organizuje składanie, stabilność, transport i translację RNA, wpływając w ten sposób na kluczowe procesy biologiczne, w tym rozwój, różnicowanie i reakcję na stres2,3.

Zmiany w komponentach regulacyjnych m6A zostały zgłoszone w szerokim spektrum nowotworów4. W wielu rakietach, aberracyjna aktywność m6A napędza złośliwe fenotypy; np. podwyższone ekspresja METTL3 promuje inicjację i progresję raka prostaty poprzez modulacje szlaku hedgehog i metylacji RNA MYC5,6. Początkowo uważano, że FTO jest zaangażowane w wywieranie onkogenicznych efektów w ostrym białaczu szpiku, wykazano, że promują progresję nowotworową w raku wątroby, płuc i jelita grubego7,8,9,10. Jednak zidentyfikowano kontekstowo zależne role FTO i ALKBH5, które ilustrują dualną naturę regulacji pośredniczonej przez m6A, która może promować zarówno sygnalizację onkogeniczną, jak i hamują nowotwory11,12,13,14. Czytacze m6A, w tym YTHDF1/2/3, różnorodne jądrowe rybonukleoproteiny (hnRNP) oraz białka wiązania mRNA czynnika wzrostu podobnego do insuliny-2 (IGF2BP1-3), również zostały związane z karcynogenezą15,16,17.

W raku piersi coraz więcej dowodów sugeruje, że regulatorzy m6A są często dysregulacji i mogą być związani z podtypami nowotworowymi, cechami związanymi z odpornością i wynikami klinicznymi18,19. Wiele badań mechanizmu wskazuje, że METTL3 jest często nadmiernie ekspresowanym czynnikiem pro-onkogennym w raku piersi. Instalacja m6A przez METTL3 może stabilizować lub zwiększać translację transkryptów, które promując proliferację, przemianę nabłonkowo-mezenchimalną (EMT), przerzuty i chemiorezystancję20. Wykazano również, że METTL3 promuje progresję raka piersi poprzez ukierunkowanie Bcl-221. ALKBH5 zostało związane z regulacją programów nowotworowych łożyskowych poprzez NANOG i inne związane z łożyskowością cząsteczki, ale jego wpływ może się różnić w zależności od kontekstu nowotworowego22.

Ponieważ lista regulatorów m6A w ostatnich latach nadal się rozszerza, konieczne jest zaktualizowanie sposobu, w jaki nowo zidentyfikowane regulatorzy mogą być dysregulować w raku piersi. Tabela 1 zawiera listę regulatorów m6A, które obejmują pisarzy, czytelników i szumujących modyfikacji m6A. Dodatkowo, nowe regulatorzy m6A, w tym LRPPRC i YWHAG, zostały zidentyfikowane z implikacjami w progresji nowotworów23,24,25. Dlatego przeprowadzono kompleksową genetyczną i molekularną charakteryzację wszystkich znanych regulatorów m6A w raku piersi, stosując narzędzia, które mogą być stosowane przez badaczy o ograniczonym tle bioinformatycznym.

Celem tego artykułu o metodach jest przedstawienie krok po kroku platformowego protokołu bioinformatycznego do analizy regulatorów m6A w raku piersi z wykorzystaniem publicznie dostępnych zasobów genomiki nowotworów. Korzystając z zestawów danych z The Cancer Genome Atlas (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), projektu Genotype Tissue Expression (GTEx)26 oraz internetowych platform analitycznych takich jak cBioPortal i UCSC Xena, ten protokół demonstruje odtwarzalne przepływy pracy do oceny profili mutacyjnych, zmian ekspresji genów i związku z przeżyciem pacjentów. Ten wizulizowany i dostępny podejście ma na celu ułatwienie przyjęcia analizy danych epitranskryptomicznych przez badaczy nowych w bioinformatyce nowotworowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Lista genów kodujących regulatorów metylacji m6A, sklasyfikowana jako pisarze, czytelnicy i skazy, znajduje się w Tabeli 1. Wszystkie wymienione geny zostały uwzględnione w kolejnych analizach mutacji, wzorców ekspresji i przeżycia ogólnego. Wszystkie oprogramowanie i narzędzia użyte w tej pracy są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Identyfikacja zmian genetycznych w regulatorach m6A

  1. Uzyskaj dostęp do cBioPortal dla genomiki raka. Przejdź do strony cBioportal (www.cbioportal.org)27,28. Na stronie głównej wybierz kartę “Zapytanie”, aby rozpocząć nową analizę.
  2. Wybierz odpowiednie badanie nad rakiem i kohorty.
  3. W pasku wyszukiwania “Wybierz badania do wizualizacji i analizy” wpisz “Rak inwazyjny piersi“ i wybierz “Rak inwazyjny piersi (TCGA, Pan-Cancer Atlas)”.
  4. Na dole wybierz “Zapytaj według genu”.
    KRYTYCZNE: Upewnij się, że wybrana kohort (996 próbek) zawiera zarówno dane o mutacji, jak i zmianach liczby kopii (CNA).
  5. Definiuj zapytanie genetyczne. W polu “Wprowadź geny”, wprowadź symbole genów HUGO dla pełnej listy regulatorów m6A poddawanych badaniu.
    UWAGA: Geny mogą być wprowadzane jako lista rozdzielona spacjami. Pod “Wybierz profile genomowe”, upewnij się, że zaznaczono dwa następujące typy danych: Mutacje i Zmiany liczby kopii.
  6. Pod “Wybierz zestaw pacjentów/przypadków,” wybierz domyślny zestaw próbek, który odpowiada kohorcie ze wszystkimi przypadkami profilu.
  7. Kliknij niebieski przycisk “Prześlij zapytanie”.
  8. Pobierz i interpretuj dane o zmianach genetycznych. Po przesłaniu wynik ładuje się na karcie “podsumowanie”. Centralne wizualizowanie “OncoPrint” zapewnia natychmiastowe przeglądanie zmian genetycznych we wszystkich zapytanych genach w kohorcie, które można pobrać.
  9. Obok OncoPrint, znajdź wykres “Podsumowanie typu raka”. Zapewnia to ilościowy podział zmian w różnych podtypach raka piersi.
  10. Przeprowadź analizę Pan-Raka. Wróć na stronę główną cBioPortal i wybierz “Badania TCGA PanCancer Atlas” pod kartą “Zapytanie”.
  11. W polu wejściowym genów, wpisz tę samą listę genów regulatorów m6A.
  12. Kliknij “Prześlij zapytanie” i na stronie wyników, przejdź do karty “Podsumowanie typów raka”. To zapewnia widok pan-rakowy.

2. Porównawcza analiza transkryptomowa regulatorów m6A za pomocą UCSC Xena.

  1. Uzyskaj dostęp do platformy UCSC Xena. Przejdź do strony UCSC Xena (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. Na stronie głównej, kliknij przycisk “Uruchom Xenę”, aby wejść do głównego przeglądarki analiz.
  3. W przeglądarce Xeny, kliknij “ZESTAWY DANYCH”.
  4. Wśród zestawów danych, wybierz “TCGA TARGET GTEx”. Zawiera ono jednolitą przetwarzaną analizę RNA-Seq z normalnych tkanek projektów TCGA i GTEx.
  5. Na następnej stronie, kliknij “WIZUALIZUJ”.
  6. Definiuj zmienną Fenotyp (grupa próbek). W “Wybierz pierwszą zmienną”, wybierz “Główna kategoria” w typie danych fenotypowych.
  7. Kliknij "DO DRUGIEJ ZMIENNEJ”. Następnie, w typie danych genomowych, zaznacz “Ekspresja genu” w zestawie danych. Dodaj listę genów w polu “Dodaj gen lub pozycję”. Kliknąć “Gotowe”.
  8. Wizualizuj wzorce ekspresji za pomocą mapy cieplnej.
  9. Aby oddzielić próbki piersi (TCGA+GTEx) od TCGA TARGET GTEx, wpisz ”Piers” i użyj opcji filtracji, aby zachować próbki.
  10. Mapa cieplna jest teraz widoczna i może być pobrana jako PDF.
  11. Generuj porównawcze wykresy pudełkowe dla pojedynczych genów. Aby zmierzyć i wizualizować różnice w ekspresji dla określonego genu, użyj “Wyświetl jako wykres”. Korzystając z tej opcji, dane mogą być wyświetlane jako wykres pudełkowy, wykres kropek i wykres skrzypcowy, porównując roz

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmiennościowe ujęcie regulatorów metylacji m6a w raku piersi

We wcześniejszym badaniu nad analizą genomową zestawów danych TCGA zgłoszono nawroty mutacji w kilku genach kodujących regulatorów metylacji DNA31. W niniejszym badaniu wykorzystano cBioPortal do analizy zestawu danych “Rak inwazyjny piersi (TCGA, PanCancer Atlas)” w celu zbadania profili mutacji genów kodujących pisarzy, czytelników i kasujących metylację RNA m6A. Analiza ta ujawnila różnorod...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł metody ten zapewnia wszechstronny, dostępny i zintegrowany przepływ pracy do systematycznego profilowania multi-omicznego i translacji klinicznej każdej sygnatury genów w badaniach nad rakiem, demonstrowany tu poprzez analizę regulatorów metylacji RNA m6A w raku piersi. Łącząc te główne publiczne platformy bioinformatyczne, podejście to umożliwia badaczom efektywne przejście od odkryć genomowych do hipotez klinicznie istotnych bez konieczności posiadania zaawansowanej wiedzy informatycznej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Część tego rękopisu została zrewidowana przy użyciu narzędzi językowych opartych na sztucznej inteligencji w celu poprawy czytelności i jasności. Cały istotny treść, interpretacja, analizy i wnioski są autorstwa samych autorów. Oświadczamy, że nie ma konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z przyznającą wdzięczność grantem od Alfaisal University (IRG 25450) dla RM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalMemorial Sloan-Kettering Cancer Centerhttps://www.cbioportal.org
Genotype-Tissue Expression (GTEx)GTEx Consortiumhttps://gtexportal.org
Kaplan-Meier PlotterGyorffy lab/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
The Cancer Genome Atlas (TCGA)National Cancer Institute (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena BrowserUniversity of California Santa Cruzhttps://xenabrowser.net

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

Related Articles