Method Article

Dekodowanie epitranskryptomu: In Silico Insights na temat sieci regulacyjnej m6A w raku piersi

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia podejście do przeprowadzania in silico analiz genetycznych, molekularnych i prognostycznych regulatorów modyfikacji m6A poprzez integrację profili mutacji, zmian liczby kopii, ekspresji genów oraz wyników klinicznych z wykorzystaniem publicznie dostępnych zbiorów danych z Cancer Genome Atlas (TCGA), projektu Genotype-Tissue Expression (GTEx) oraz platform mikromacierzy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N6-metyladenozyna (m6A) jest najliczniejszą wewnętrzną modyfikacją RNA w transkrypcjach eukariotycznych i odgrywa kluczową rolę w metabolizmie RNA, ekspresji genów oraz homeostazie komórkowej. Dysregulacja regulatorów m6A, w tym "pisarzy", "gumerów" i "czytników", jest coraz częściej powiązana z biologią nowotworów; Jednak ich kompleksowa rola w leczeniu raka piersi pozostaje do poznania. Głównym celem tego artykułu metodycznego jest dostarczenie początkującym bioinformatyce krok po kroku ram wykorzystania publicznie dostępnych zbiorów danych o nowotworach do przeprowadzania analiz mutacyjnych, oceny zmian w ekspresji genów oraz badania ich powiązań z przeżyciem pacjentów. Jako studium przypadku analizowano regulatory m6A w raku piersi przy użyciu zestawów danych z Cancer Genome Atlas (TCGA), projektu Genotype-Tissue Expression (GTEx) oraz platform mikroarray. Systematycznie analizowano profile transkryptomiczne, aby wykazać procesy oceny prognostycznego znaczenia komponentów regulacyjnych m6A w raku piersi. Korzystając z tego ram analitycznych, zidentyfikowano wyraźne wzorce zmian genetycznych i różnic ekspresji wśród kluczowych regulatorów m6A. Kilka regulatorów, w tym METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 i RBMX, wiązało się z lepszym przeżyciem pacjentów, podczas gdy YWHAG wiązał się ze słabym ogólnym przeżyciem. Niniejsze badanie przedstawia kompleksowy przegląd genów regulujących m6A m6A w raku piersi, jednocześnie demonstrując praktyczny i powtarzalny proces bioinformatyki opartej na sieci. Te odkrycia pogłębiają zrozumienie regulacji epitranskryptomii w raku piersi i stanowią podstawę do opracowania nowych strategii diagnostycznych i terapeutycznych opartych na m6A.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje epitranskryptomiczne stanowią ważną warstwę regulacji genów po transkrypcji i przyczyniają się do różnorodnych procesów komórkowych oraz stanów chorobowych. Spośród ponad 170 modyfikacji RNA zidentyfikowanych do tej pory, N6-metyladenozyna (m6A) jest najbardziej powszechną i dobrze scharakteryzowaną w eukariotycznych mRNA1. Instalowany przez kompleksy "writer", w tym METTL3/METTL14, usuwany przez "gumki", w tym FTO i ALKBH5, oraz interpretowany przez białka "czytnicze", w tym członków rodzin YTH i IGF2BP, m6A koordynuje splicing, stabilność, transport i translację RNA, wpływając tym samym na kluczowe procesy biologiczne, w tym rozwój, różnicowanie i reakcję na stres 2,3.

Zgłoszono zmiany w komponentach regulacyjnych m6A w szerokim zakresie nowotworów4. W wielu nowotworach nieprawidłowa aktywność m6A napędza fenotypy złośliwe; np. podwyższona ekspresja METTL3 sprzyja inicjacji i postępowi raka prostaty poprzez modulację szlaku jeża oraz metylację RNA MYC 5,6. Początkowo uznano, że FTO jest powiązany z działaniem onkogennym w ostrej białaczce szpikowej, wykazano, że napędza postęp guza w nowotworach wątroby, płuc i jelita grubego 7,8,9,10. Jednak zidentyfikowano kontekstowe role FTO i ALKBH5, które ilustrują podwójny charakter regulacji pośredniczonej przez m6A, która może promować zarówno onkogen, jak i sygnalizację supresyjnąnowotworów 11,12,13,14. Czytelnicy M6A, w tym YTHDF1/2/3, heterogeniczne jądrowe rybonukleoproteiny (hnRNP) oraz białka wiążące mRNA (IGF2BP1-3), są również powiązane z rakogenezą 15,16,17.

W przypadku raka piersi coraz więcej dowodów sugeruje, że regulatory m6A są często dysregulowane i mogą być powiązane z podtypami nowotworów, cechami immunologicznych oraz wynikami klinicznymi18,19. Wiele badań mechanistycznych wskazuje na METTL3 jako często zwiększona pro-onkogenna czynnik w raku piersi. Instalacja m6A za pośrednictwem METTL3 może stabilizować lub usprawniać translację transkrypcji sprzyjających proliferacji, przejściu nabłonk-mezenchymal (EMT), przerzutom oraz chemiooporności20. Wykazano, że METTL3 sprzyja postępowi raka piersi poprzez celowanie wBcl-221. ALKBH5 jest powiązany z regulacją programów zanurzania nowotworów poprzez NANOG i inne cząsteczki związane z nim, jednak jego wpływ może się różnić w zależności od kontekstu nowotworowego22.

W miarę jak lista regulatorów m6A stale się powiększa w ostatnich latach, potrzebna jest aktualizacja na temat tego, jak nowo zidentyfikowani regulatorzy mogą być dysregulowani w przypadku raka piersi. Tabela 1 przedstawia listę regulatorów m6A, w tym zapisywacze, czytniki i gumki modyfikacji m6A. Dodatkowo zidentyfikowano nowe regulatory m6A, w tym LRPPRC i YWHAG, mające znaczenie dla progresji raka 23,24,25. Dlatego przeprowadzono kompleksową charakterystykę genetyczną i molekularną wszystkich znanych regulatorów m6A w raku piersi, wykorzystując narzędzia wykorzystywane przez badaczy o ograniczonym doświadczeniu bioinformatycznym.

Celem tego artykułu w Metodach jest przedstawienie krok po kroku platformowego protokołu bioinformatycznego do analizy regulatorów m6A w raku piersi, wykorzystując publicznie dostępne zasoby genomiki nowotworowej. Wykorzystując zbiory danych z The Cancer Genome Atlas (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), projektu Genotype Tissue Expression (GTEx)26 oraz internetowych platform analitycznych, takich jak cBioPortal i UCSC Xena, protokół ten demonstruje powtarzalne procesy oceny profili mutacyjnych, zmian w ekspresji genów oraz powiązania z przeżyciem pacjenta. To wizualizowane i przystępne podejście ma na celu ułatwienie wdrażania analizy danych epitranskryptomicznych przez badaczy nowych w bioinformatyce nowotworów.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Lista genów kodujących regulatory metylacji m6A, sklasyfikowanych jako pisarze, czytniki i gumki, znajduje się w Tabeli 1. Wszystkie wymienione geny zostały uwzględnione w późniejszych analizach mutacji, wzorców ekspresji oraz ogólnego przeżycia. Wszystkie oprogramowanie i narzędzia użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Identyfikacja zmian genetycznych w regulatorach m6A

  1. Uzyskaj dostęp do portalu cBioPortal dotyczący genomiki nowotworów. Przejdź na stronę cBioportal (www.cbioportal.org)27,28. Na stronie głównej wybierz zakładkę "Zapytanie", aby rozpocząć nową analizę.
  2. Wybierz odpowiednie badanie nowotworu i grupę uczestników.
  3. W pasku wyszukiwania "Wybierz badania do wizualizacji i analizy" wpisz "Breast Invasive Carcinoma" i wybierz "Breast Invasive Carcinoma (TCGA, Pan-Cancer Atlas)".
  4. Na dole wybierz "Zapytanie według genu".
    KRYTYCZNE: Upewnij się, że wybrana kohorta (996 próbek) zawiera zarówno dane dotyczące mutacji, jak i zmiany numeru kopii (CNA).
  5. Zdefiniuj pytanie genetyczne. W sekcji "Enter Genes" wpisz symbole genów HUGO dla pełnej listy regulatorów m6A będących przedmiotem badania.
    UWAGA: Geny można wpisywać jako listę oddzieloną przez spacji. W sekcji "Wybierz profile genomowe" upewnij się, że sprawdzono następujące dwa typy danych: mutacje i zmiany numeru kopii.
  6. W sekcji "Wybierz pacjenta/zestaw przypadków" wybierz domyślny zestaw próbek odpowiadający kohorcie ze wszystkimi przypadkami profilowymi.
  7. Kliknij niebieski przycisk "Wyślij zapytanie".
  8. Pobierz i zinterpretuj dane o modyfikacjach genetycznych. Po przesłaniu wynik zostanie załadowany na zakładce "podsumowanie". Centralna wizualizacja "OncoPrint" zapewnia natychmiastowy przegląd zmian genetycznych we wszystkich zapytaniach genów w kohorcie, który można pobrać.
  9. Obok OncoPrint znajdź wykres "Podsumowanie typu raka". Daje ona ilościowy podział zmian w poszczególnych podtypach raka piersi.
  10. Wykonaj analizę pan-nowotworową. Wróć na stronę główną portalu cBioPortal i wybierz "TCGA PanCancer Atlas Studies" w zakładce "Zapytanie".
  11. W polu wejściowym genów wpisz tę samą listę genów regulatorów m6A.
  12. Kliknij "Wyślij zapytanie" i na stronie wyników przejdź do zakładki "Podsumowanie typów nowotworów". To daje pan-nowotworowe spojrzenie.

2. Porównawcza analiza transkryptomiczna regulatorów m6A z użyciem UCSC Xena.

  1. Uzyskaj dostęp do platformy UCSC Xena. Przejdź na stronę UCSC Xena (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. Ze strony głównej kliknij przycisk "Launch Xena", aby wejść do głównej przeglądarki analiz.
  3. W przeglądarce Xena kliknij "DATA SETS".
  4. Spośród zbiorów danych wybierz "TCGA TARGET GTEx". Zawiera ona jednolicie przetworzone dane RNA-Seq z normalnych tkanek projektów TCGA i GTEx.
  5. Na następnej stronie kliknij "VISUALIZE".
  6. Zdefiniuj zmienną fenotypu (grupa próby). W sekcji "Wybierz swoją pierwszą zmienną" wybierz "Kategorię główną" w typie danych fenotypowych.
  7. Kliknij "DO DRUGIEJ ZMIENNEJ". Następnie w typie danych genomowych zaznacz "Gene Expression" w zbiorze danych. Dodaj listę genów w polu "Dodaj gen lub pozycję". Kliknij "Gotowe".
  8. Wizualizuj wzorce ekspresji za pomocą mapy ciepła.
  9. Aby oddzielić próbki piersi (TCGA+GTEx) od TCGA TARGET GTEx, wpisz "Breast" i użyj opcji filtra do przechowywania próbek.
  10. Mapa ciepła jest teraz widoczna i można ją pobrać jako PDF.
  11. Generuj porównawcze wykresy pudełkowe dla poszczególnych genów. Aby ilościowo określić i zobrazować różnice w ekspresji dla konkretnego genu, użyj wykresu "View as chart". Korzystając z tej opcji, dane można oglądać jako wykres pudełkowy, skalkowy wykres oraz wykres skrzypiec, porównując rozkład wyrażeń między obiema grupami prób.
  12. Użyj opcji "Pobierz jako PDF", aby pobrać wykresy.
  13. Istotność statystyczną (wartość p) można uzyskać, klikając na "STATYSTYKI".

3. Ocena prognostycznego znaczenia regulatorów m6A za pomocą plotera Kaplan-Meier.

  1. Uzyskaj dostęp do narzędzia Kaplan-Meier Plotter. Przejdź na stronę Kaplan-Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. Na stronie głównej wybierz zakładkę "rak piersi", aby rozpocząć analizę specyficzną dla zbiorów danych dotyczących raka piersi.
  3. Skonfiguruj zapytanie genowe dla pojedynczego genu.
  4. W sekcji głównych danych wejściowych znajdź pole "Symbol Genu".
  5. Na scenę wchodzi oficjalny symbol genu regulatora m6A do analizy (np. METTL3).
    KLUCZOWE: Bezpośrednio pod polem do wprowadzania genów zlokalizuj i włącz pole wyboru "Tylko najlepszy zestaw sond JetSet". Zapewnia to automatyczne wybranie najbardziej wiarygodnej i specyficznej mikromacierzy dla Twojego genu, co optymalizuje jakość danych i powtarzalność.
  6. Zdefiniuj parametry analizy przetrwania. W sekcji "Przetrwanie" wybierz "Ogólne przeżycie (OS)" jako główny punkt końcowy tej analizy. Narzędzie automatycznie wykorzysta dane od 1880 pacjentek z rakiem piersi, gdy wybierze to ustawienie.
  7. Upewnij się, że opcja "Podziel pacjentów po" jest ustawiona na "median". To podzieli pacjentów na dwie równe grupy; wysoka ekspresja i niska ekspresja, oparte na medianie wartości ekspresji zapytania genu we wszystkich próbkach.
  8. "Próg follow-up" może być użyty do wyboru okresu follow-up. Do tego badania wybrano 180 miesięcy.
  9. Wygeneruj i zinterpretuj wykres Kaplana-Meiera.
  10. Kliknij przycisk "Narysuj wykres Kaplana-Meiera".
  11. Nowe okno się załaduje, pokazując krzywą przetrwania.
  12. Interpretuj kluczowe elementy fabuły; Oś X wskazuje czas w miesiącach, oś Y pokazuje prawdopodobieństwo całkowitego przeżycia, a dwie kolorowe linie oznaczają krzywe przeżycia dla grup pacjentów o wysokiej ekspresji (czerwony) i niskiej ekspresji (czarnych). Wyświetlana jest wartość p o logaritmiatlicznym rzędzie, wskazująca statystyczną istotność różnicy między dwiema krzywymi przeżycia.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krajobraz mutacyjny regulatorów metylacji m6a w raku piersi

W wcześniejszym badaniu analizy genomowej zbiorów danych TCGA zgłoszono nawracające mutacje w kilku genach kodujących regulatory metylacji DNA– 31. W niniejszym badaniu cBioPortal został wykorzystany do analizy zbioru danych "Breast Invasive Carcinoma (TCGA, PanCancer Atlas)" w celu zbadania mutacyjnych profili genów kodujących autorów, czytelników i usuwających metylację m6A RNA. Analiza ta wykazała różnorodne zmiany genetyczne u pacjentek z rakiem piersi, z częstością zmian znacznie różniącymi się w zależności od genów – od 0,4% w CNBP i RBM15B do 12% w VIRMA (Rysunek 1A). Amplifikacja genów była najczęstszą zmianą, podczas gdy dodatkowe zdarzenia obejmowały głębokie delecje, podstawienia zasad oraz wielokrotne równoczesne zmiany. Warto zauważyć, że u 476 pacjentek (48% kohorty) wykryto zmiany w genach regulujących funkcje związane z m6A (Rysunek 1B), co podkreśla znaczenie dynamiki modyfikacji m6A w raku piersi. Chociaż częstotliwość różnych typów zmian się różniła, takie mutacje zaobserwowano we wszystkich molekularnych podtypach raka piersi (rysunek 1C). Do walidacji uwzględniono PIK3CA, TP53, CDH1 i GATA3 jako referencyjne geny kontrolne (Rysunek 1A). Co ciekawe, zmiany w mechanizmie regulacji m6A nie ograniczały się tylko do raka piersi. Analiza 10 967 próbek od 10 953 pacjentów z 32 badań w TCGA Pan-Cancer Atlas ujawniła zachowane wzorce mutacyjne w szerokim zakresie typów nowotworów. Niedawno wykazano, że szlak m6A jest często zmieniany w raku prostaty (PCa) i ogólnie odgrywa rolę proonkogenną32. Wyniki te wskazują, że mutacje wpływające na geny kodujące autorów, czytników i usuwających modyfikację m6A RNA są częstą cechą w wielu nowotworach (Rysunek 2).

Nieprawidłowe profile ekspresji genów w raku piersi

Pojawiające się dowody wskazują, że zaburzenia transkryptomiczne są kluczowymi czynnikami powstawania nowotworów, a nieprawidłowa ekspresja genów może być biomarkerami w raku piersi. Aby to zbadać, przeanalizowano poziomy transkrypcji genów regulujących modyfikację m6A na podstawie danych z TCGA oraz projektu Genotype Tissue Expression (GTEx) reprezentującego prawidłową tkankę piersi. Jak ilustruje Rysunek 3A, różne geny związane z m6A wykazywały istotne zaburzenia regulacji w próbkach raka piersi. Zarówno upregulacje, jak i obniżenie stężenia zaobserwowano w tkankach nowotworowych w porównaniu do normalnych grup kontrolnych. METTL3 i WTAP, oba składniki kompleksu autora, zostały obniżone wśród innych genów, podczas gdy kilka innych genów, w tym VIRMA, YTHDF1 i YTHDF3, zostało zwykłych. Rysunek 3B szczegółowo przedstawia różnice profili ekspresji poszczególnych genów w kohorcie TCGA i GTEx. Łącznie te wyniki wskazują, że geny kodujące autorów, czytników i gumek m6A przechodzą rozległą deregulację transkrypcyjną w raku piersi, co podkreśla ich potencjalne znaczenie dla postępu choroby.

Geny maszynerii m6A i ich rola w prognozowaniu pacjentów

Po obserwacji, że zmiany genetyczne i zmiany ekspresji genów są bardzo powszechne wśród pacjentów onkologicznych, zbadano prognostyczne znaczenie tych zmian ekspresji w raku piersi. Wykorzystując narzędzie Kaplan-Meier (KM)Plotter 30, które integruje mikromacierze dane, oceniono całkowite przeżycie (OS) w kohorcie 1880 pacjentek z rakiem piersi zgodnie z ekspresją genów regulatora m6A. Analiza wykazała, że podwyższona ekspresja METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 i RBMX była istotnie powiązana z poprawą całkowitego przeżycia. Dla porównania, nadekspresja YWHAG koreluje ze słabymi wynikami przeżycia (Rysunek 4). Jako kontrolne grupy uwzględniono CCND2 i TOP2A, znane odpowiednio markery lepszej i gorszej prognozy. Inne geny kodujące regulatory m6A nie wykazały statystycznie istotnych korelacji z przeżyciem pacjentów (Ilustracja uzupełniająca). Wyniki te podkreślają podzbiór genów regulujących metylację m6A o potencjalnym zastosowaniu w prognozowaniu raka piersi.

figure-results-1
Rysunek 1: Zmiany genetyczne w genach autorów, czytelników i gumer m6A w raku piersi. (A) Pokazano rozkład zmian wśród 996 pacjentek z rakiem piersi, przy czym każda szara linia reprezentuje indywidualny przypadek. Kolorowe paski oznaczają różne typy zmian, w tym mutacje missense, głębokie delecje, amplifikacje, mutacje w ramce oraz mutacje skracające. Dobrze scharakteryzowane geny, PIK3CA, TP53, CDH1 i GATA3, są uwzględniane jako dodatnia kontrola ze względu na ustaloną częstotliwość mutacji. (B) Ogólna częstotliwość zmian genów regulujących m6A w kohorcie pacjenta. (C) Wzorce modyfikacji genetycznych w genach regulatorów m6A przez podtypy raka piersi. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Częstotliwość zmian genetycznych w genach kodujących m6A autorów, czytelników i gumek w różnych typach nowotworów. Analiza opiera się na danych z TCGA pan-cancer atlas, obejmującego 10 967 próbek od 10 953 pacjentów w 32 badaniach onkologicznych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Anomalie ekspresji w genach kodujących pisarze, czytniki i gumki m6A. (A) Pokazano nadekspresję (czerwone paski) i niedoekspresję (niebieskie paski) wszystkich genów. Dane z GTEx i TCGA wykorzystano do porównania próbek normalnych z rakiem piersi. (B) Ten wykres przedstawia porównanie ekspresji genów u pacjentów z normalnym rakiem piersi i pacjentek. Xena wykorzystuje test t Welcha do określenia wartości p dla każdego genu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Profile ekspresji autorów, czytelników i gumek m6A oraz ich związek z rokowaniem w raku piersi. Krzywe przeżycia Kaplan-Meier przedstawiają ogólne przeżycie pacjenta, gdzie oś X oznacza czas (miesiące), a oś Y ogólne prawdopodobieństwo przeżycia. Czerwone linie oznaczają grupę o wysokiej ekspresji, natomiast czarne linie to grupę o niskiej ekspresji. Pacjenci byli podzieleni na stratyfikacje w zależności od mediany poziomu ekspresji genów. wartości p określano za pomocą testu Log-Rank. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Ilustracja uzupełniająca: Członkowie regulatorów m6A nie wykazują istotnej korelacji z ogólnym przeżywalstwem pacjenta, co pokazują krzywe przeżycia Kaplana-Meiera. Czerwone linie oznaczają grupę o wysokiej ekspresji, natomiast czarne linie to grupę o niskiej ekspresji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

TypSymbol genu
ScenarzyściMETTL3
METTL14
ZC3H13
WTAP
RBM15
RBM15B
METTL16
CBLL1
KIAA1429/VIRMA
CzytelnicyYTHDF1
YTHDF2
YTHDF3
YTHDC1
YTHDC2
HNRNPA2B1
HNRNPC
HNRNPG/RBMX
IGF2BP1
IGF2BP2
IGF2BP3
CNBP
ELAVL1
SND1
PRRC2A
PRRC2B
PRRC2C
EIF3A
FMR1
FXR1
FXR2
LRPPRC
MSI2
GumkiALKBH5
FTO

Tabela 1: Geny kodujące pisarze, czytniki i gumki m6A. Tabela 1 przedstawia przegląd głównych rodzin genów odpowiedzialnych za instalację, rozpoznawanie i usuwanie modyfikacji m6A w eukariotycznym RNA.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł z This Method przedstawia kompleksowy, dostępny i zintegrowany workflow systematycznego wieloomicznego profilowania i klinicznej translacji dowolnego sygnatury genu w badaniach nad rakiem, co zostało przedstawione tutaj poprzez analizę regulatorów metylacji m6A RNA w raku piersi. Łącząc te główne publiczne platformy bioinformatyczne, to podejście umożliwia naukowcom efektywne przechodzenie od odkryć genomowych do klinicznie istotnych hipotez bez konieczności posiadania zaawansowanej wiedzy obliczeniowej.

Główną zaletą tej metodologii jest modułowy, generujący hipotezy pipeline. Protokół prowadzi użytkownika przez logiczną sekwencję; najpierw zidentyfikował, które geny są genetycznie zmienione (za pomocą cBioPortal), następnie ocenił zaburzenia ekspresji w środowisku korekcyjnym partii (za pomocą UCSC Xena), a na końcu ocenił kliniczny wpływ tej dysregulacji na przeżycie pacjentów (za pomocą Kaplan-Meier Plotter). Ta analiza stopniowa, od DNA przez RNA, aż po wyniki kliniczne, skutecznie priorytetowo traktuje geny kandydatów do dalszych badań. Na przykład, zastosowanie tego workflow do regulatorów m6A skutecznie wskazało geny takie jak YWHAG (częste zmiany, prognozujące dla słabego przeżycia) jako priorytetowe cele do walidacji funkcjonalnej.

Konstrukcja protokołu do analizy pan-nowotworowej dodatkowo zwiększa jego użyteczność, pozwalając naukowcom szybko określić, czy sygnatura molekularna jest specyficzna dla jednego z nowotworów, czy też jest cechą wspólną nowotworu, co zaobserwowano przy szeroko zakrojonych zmianach w maszynerii m6A w tym badaniu. Analiza pan-nowotworowa wykazała, że mutacje dotyczące autorów, czytelników i gumek m6A nie ograniczały się do raka piersi, lecz występują w wielu nowotworach. Jest to zgodne z narastającymi dowodami, że nieprawidłowa regulacja m6A jest charakterystyczną cechą onkogenezy w różnych typach nowotworów, ponieważ wpływa na wiele cech nowotworowych i procesów fizjologicznych, w tym splicing RNA, stabilność, translację oraz aktywność niekodującego RNA33.

To podejście metodologiczne jest bardzo elastyczne. Choć wykazano to za pomocą regulatorów m6A, ten sam workflow można natychmiast zastosować do charakteryzacji genów punktów kontrolnych immunologicznych, enzymów metabolicznych lub nowych sygnatur genów z eksperymentów RNA-seq w dowolnym typie nowotworu dostępnym w tych bazach danych. Ten krok po kroku format obniża barierę dla naukowców laboratoryjnych w przeprowadzaniu zaawansowanych analiz in silico , przyspieszając przejście od danych genomowych do biologicznych analiz.

Podsumowując, protokół ten stanowi solidne ramy do kontekstualizacji genów związanych z rakiem. Oprócz wyrysowania krajobrazu mutacyjnego, wyniki ujawniły dwukierunkowe zmiany ekspresji w regulatorach m6A. To odkrycie podkreśla złożoność epitranskryptomu i wzmacnia ustalony paradygmat funkcji zależnej od kontekstu, czego przykładem są podwójne role opisane dla białek rodzin METTL3 i YTHDF w różnych nowotworach34,35. Oś m6A wykazano również, że odgrywa rolę w regulacji proliferacji, przerzutów i unikania odporności w przypadku raka piersi z potrójnym ujemnymwynikiem 36,37. Co ciekawe, analiza przeżycia zidentyfikowała podzbiór regulatorów m6A o znaczeniu prognostycznym. Podwyższona ekspresja METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 i RBMX wiązała się z korzystnymi wynikami, podczas gdy ekspresja YWHAG koreluje ze słabym ogólnym przeżyciem. Te wyniki potwierdzają potencjalne kliniczne zastosowanie regulatorów m6A jako prognostycznych biomarkerów. CBLL1 został również zidentyfikowany jako jeden z czynników o korzystnym rokowaniu w wcześniejszym badaniu38. Jednak obecna analiza, obejmująca zaktualizowane członków regulatorów m6A, zidentyfikowała dodatkowych członków, takich jak RBMX i YWHAG, odpowiednio z lepszym, a gorszym ogólnym przeżywalnością. Obserwacja, że różne regulatory mogą przewidywać zarówno niekorzystne, jak i korzystne rokowanie, podkreśla podwójne i kontekstowe funkcje modyfikacji m6A w biologii nowotworów. Chociaż YTHDF1 i YTHDF3 są istotnie zwiększone w guzach, ich brak korelacji z ogólnym przeżyciem może odzwierciedlać funkcjonalną redundancję wśród czytelników, rolę zależną od kontekstu w różnych podtypach nowotworów lub potrzebę uwzględnienia ich proporcji lub netto sieci regulacyjnej m6A zamiast indywidualnych poziomów ekspresji. Dodatkowo, chociaż VIRMA wykazywała najwyższą częstotliwość zmian (12%, głównie amplifikacja), jej ekspresja nie korelowała istotnie z ogólnym przeżyciem w raku piersi. Jednym z możliwych wyjaśnień jest to, że ekspresja hIgh VIRMA wskazuje jedynie na podwyższony potencjał depozycji m6A, a nie na to, czy obecne są odpowiednie odczyty lub docelowe mRNA, które mogłyby przełożyć to na agresywne zachowanie guza. Co istotne, podczas gdy YTHDF1 i YTHDF3 były nadekspresjonowane w kohorcie, YTHDC1 i YTHDC2 były znacząco obniżone. Ten niedopasowany wzorzec ekspresji sugeruje, że funkcjonalna kombinacja konkretnych autorów i czytelników wymagana do produkcji onkogennej może nie działać w przypadku raka piersi. Tak więc, mimo wysokiej ekspresji, VIRMA może nie być dominującym czynnikiem w tym kontekście (ilustracja uzupełniająca).

Autorzy przyznają się do głównego ograniczenia tego in silico pipeline. Analizy te są z natury korelacyjne; identyfikują silne powiązania, ale nie ustanawiają mechanistycznej przyczynowości. Taką przyczynowość można ustalić za pomocą genomiki funkcjonalnej lub za pomocą inhibitorów małych cząsteczek celujących w składniki szlaku m6A39. Warto zauważyć, że pierwszy inhibitor peptydu ukierunkowany na METTL3, RSM3, został niedawno opracowany i wykazał potencjał przeciwnowotworowy w modelach raka prostaty in vivo40. Ten metodologiczny sposób pracy stanowi więc cenne narzędzie do identyfikacji kandydatów na cele oraz stratyfikacji populacji pacjentów, które najprawdopodobniej skorzystają z tych interwencji terapeutycznych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fragmenty tego manuskryptu zostały poprawione przy pomocy narzędzi językowych opartych na AI, aby poprawić przejrzystość i czytelność. Cała merytoryczna treść, interpretacja, analizy i wnioski są własnymi autorami. Oświadczamy, że nie ma konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na szczęście przyznano grant od Alfaisal University (IRG 25450) dla RM.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalMemorialne Centrum Onkologiczne Sloan-Ketteringhttps://www.cbioportal.org
Ekspresja genotypowo-tkankowa (GTEx)Konsorcjum GTExhttps://gtexportal.org
Kaplan-Meier PlotterGyorffy lab/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
Atlas Genomu Raka (TCGA)Narodowy Instytut Onkologii (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
Przeglądarka UCSC XenaUniwersytet Kalifornijski Santa Cruzhttps://xenabrowser.net

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

Related Articles